Lavorazione di tessuto cardiaco umano verso la matrice extracellulare autoassemblanti idrogel per In Vitro e In Vivo applicazioni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di trasformare la matrice extracellulare cardiaca in un idrogel, che consente di studiare l'effetto della matrice in vari saggi basati su cellule. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo cardiaco, come ad esempio il modo in cui la matrice extracellulare influisce sul comportamento cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita l'uso della matrice extracellulare per fare esperimenti su larga scala in vitro o in vivo.

Le applicazioni di questa tecnica possono essere estese a una terapia per l'infarto del miocardio perché la matrice può fornire spunti essenziali per la sopravvivenza. Per iniziare l'esperimento, utilizzare un bisturi sterile con una lama numero dieci, per rimuovere il tessuto adiposo da un miocardio ventricolare sinistro precedentemente ottenuto. Tagliare il miocardio a cubetti di circa 1 per 1 per 1 cm, utilizzando un bisturi.

Quindi, posizionare i cubetti in una provetta sterile da 50 ml. Conservare i tubi contenenti i cubetti a 80 gradi Celsius. Estrarre dal congelatore il tubo contenente i cubetti preparati e trasportarlo con ghiaccio al criostato.

Impostare la temperatura dell'oggetto e della camera del criostato a 15 gradi Celsius. Raffreddare le provette vuote da 50 ml e i timbri nella camera. Aggiungere uno strato di terreno di criosezione sul timbro a freddo e lasciarlo congelare fino a quando non diventa bianco e solido.

Aggiungere un secondo strato di terreno di criosezione e posizionare una provetta per miocardio nel secondo strato. Assicurarsi che il terreno di criosezione e il miocardio siano completamente congelati. Quindi, inserire il timbro con miocardio congelato nel supporto e serrare tutte le viti.

Rifilare la superficie del tessuto fino ad ottenere una superficie di sezionamento uniforme. Sezionare il miocardio congelato con sezionamento automatico per garantire sezioni di taglio uniformi. Da un cubo si possono affettare circa 30-40 sezioni.

Posizionare ogni fetta, dopo il sezionamento, in una provetta da 50 ml pre-raffreddata. Chiudere i tubi pieni e metterli sul ghiaccio. Trasferire le sezioni congelate di tutte le provette da 50 mL in un becher sterile.

Aggiungere 50 mL di soluzione di lisi per provetta da 50 mL contenente fette di miocardio. Quindi, agitare le fette di miocardio in un becher sterile. Filtrare il liquido con le fette di tessuto attraverso un colino grosso.

Quindi, trasferire le fette di tessuto con una pinzetta smussata in un nuovo becher sterile. Aggiungere 50 mL di SDS allo 0,5% in PBS per provetta iniziale da 50 mL di fette di miocardio. Agitare il becher continuamente per sei ore a 100-150 giri/min a temperatura ambiente.

Dopo aver agitato, filtrare il liquido con le fette di fazzoletti attraverso un colino grossolano. Utilizzando una pinzetta smussata, trasferire le fette di fazzoletti in un nuovo becher sterile e lavare le fette tre volte con 50 ml di PBS. Successivamente, lavare le fette per una notte in PBS, con l'1% di penicillina streptomicina e l'1% di nistatina.

Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 25 ml di FBS preriscaldato a 37 gradi Celsius con l'1% di penicillina streptomicina e l'1% di nistatina, alle fette decellularizzate per provetta iniziale da 50 ml di fette di miocardio. Incubare le fette per tre ore a 37 gradi Celsius per rimuovere il DNA rimanente dalla matrice. Quindi, trasferire le fette in un nuovo becher sterile e lavare tre volte con 50 ml di PBS.

Posizionare le fette ECM in una nuova piastra sterile a sei pozzetti. Congelare l'ECM a 80 gradi Celsius e liofilizzarlo per due giorni in una liofilizzazione. Per la polverizzazione della fetta ECM, utilizzare tubi di fresatura contenenti perle di ceramica da 1,4 mm.

Riempire le provette senza stringere con ECM liofilizzato, utilizzando una pinzetta sterile e smussata. Congelare a scatto le provette in azoto liquido. Inserire i tubi congelati nella fresatrice e polverizzare l'ECM.

Imposta la durata su 30 secondi, regola la velocità massima e avvia il dispositivo. Dopo la polverizzazione, estrarre i tubi e congelarli nuovamente in azoto liquido. Lavare le microparticelle dalle provette, aggiungendo 1 mL di ddH20 per provetta, e agitare per una solubilizzazione completa.

Quindi, filtrare la soluzione eterogenea attraverso una maglia di 200 micrometri, in una provetta da 50 mL. Congelare la provetta in azoto liquido. Sostituire il coperchio standard della provetta con un filtro da 0,22 micrometri per evitare che la polvere fuoriesca dalla provetta.

Inserire il tubo nel liofilizzatore e liofilizzare nuovamente per rimuovere l'acqua dalla fase di lavaggio. Sciogliere la polvere di ECM umana liofilizzata precedentemente preparata in una soluzione di pepsina, fino a una concentrazione finale di 10 mg per ml. Trasferire la soluzione in provette da 2 mL con un volume di 1 mL per provetta.

Pipettare la soluzione per miscelarla accuratamente. Quindi, posizionare i tubi nello shaker e agitare a 1200 giri/min per 48 ore a 27 gradi Celsius. Estrarre le provette dallo shaker e posizionarle sul ghiaccio o su un portaprovette pre-raffreddato.

Mescolare 1/9 del volume della soluzione ECM di PBS 10X freddo, con 1/10 di un volume di soluzione ECM di idrossido di sodio molare 0,1 molare freddo, in una provetta pre-raffreddata e metterla su ghiaccio per neutralizzare la soluzione ECM digerita e inattivare la pepsina. Infine, aggiungere la soluzione ECM alla miscela di neutralizzazione e miscelare accuratamente mediante pipettaggio o vortex. I saggi quantitativi per i singoli componenti della ECM hanno rivelato una rimozione più completa del DNA e una migliore conservazione del collagene, dell'elastina e dei glicosaminoglicani totali rispetto alla decellularizzazione mediante SDS, da sola.

La RT-PCR è stata utilizzata per quantificare l'espressione delle proteine strutturali della cardiomiocita, dei fattori di trascrizione cardiomiogenica precoce e tardiva e dei geni marcatori di superficie delle cellule endoteliali nelle ESC murane, sottoposte a differenziamento spontaneo. Il contatto con la cECM spinge le cellule staminali pluripotenti, preferibilmente verso un fenotipo simile a quello della cardiomiocite. La microscopia ottica a contrasto di fase dimostra che la digestione enzimatica della cECM per 48 ore si traduce in una soluzione ECM più omogeneizzata.

La colorazione viva/morta di fibroblasti cardiaci umani su idrogel cECM, mostra una maggiore vitalità. Sia le microparticelle cECM che l'idrogel cECM migliorano l'attività metabolica delle cellule HL-1 contrattili, in condizioni ischemiche, rispetto alle cellule in coltura standard. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro una settimana dal tessuto all'idrogel, se eseguita correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione cardiaca, per esplorare gli effetti della matrice extracellulare cardiaca, in vitro e in vivo, sistemi modello.