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Imaging a cellule vive della mitosi

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Cell Biology

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Live Cell Imaging of Mitosis

4.2: Cell Cycle Analysis

4.4: An Introduction to Cell Motility and Migration

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09:57 min

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April 30, 2023

Overview

La mitosi è una forma di divisione cellulare in cui il materiale genetico di una cellula è diviso equamente tra due cellule figlie. La mitosi può essere suddivisa in sei fasi, durante ognuna delle quali i componenti della cellula, come i suoi cromosomi, mostrano caratteristiche visivamente distinte. I progressi nell’imaging delle cellule vive a fluorescenza hanno permesso agli scienziati di studiare questo processo in grande dettaglio, fornendo importanti informazioni sul controllo biologico di questo processo e su come potrebbe andare storto in malattie come il cancro.

Iniziamo questo video abbattendo le fasi della mitosi e introducendo alcune importanti considerazioni per una visualizzazione ottimale del processo utilizzando l’imaging delle cellule vive. Quindi percorriamo i passaggi per l’esecuzione di un esperimento di imaging di mitosi cellulare dal vivo e discutiamo vari metodi di analisi, tra cui la generazione di montaggi, film e ricreazioni 3D. Infine, diamo un’occhiata a come la visualizzazione del processo mitotico può essere applicata per rispondere alle domande in biologia cellulare.

Procedure

La mitosi è la divisione altamente organizzata e controllata dei contenuti nucleari che si verifica durante il ciclo cellulare. La mitosi è di fondamentale importanza per il corretto sviluppo dell’organismo e per la crescita, la manutenzione e la riparazione dei tessuti. L’interruzione di questo processo è stata indicata in alcune malattie, come il cancro. L’imaging di cellule vive tramite microscopia fluorescente time-lapse è uno dei metodi più comuni per studiare la mitosi nei laboratori di oggi.

In questo video, introdurremo brevemente le fasi della mitosi e poi discuteremo le considerazioni sperimentali per l’imaging cellulare vivo di questo processo cellulare. Verrà mostrato un protocollo dettagliato di acquisizione e analisi dei dati e concluderemo con alcune applicazioni di questa tecnica.

Per capire meglio cosa stanno cercando gli scienziati in questi esperimenti di imaging, passiamo prima attraverso le fasi della mitosi.

Il ciclo cellulare descrive il processo complessivo di crescita e divisione cellulare. La fase mitotica rappresenta una breve porzione di questo ciclo, che può essere ulteriormente suddivisa in sei fasi: vale a dire profase, prometafase, metafase, anafase, telofase e citochinesi.

Durante la profase, il DNA si condensa in cromatidi fratelli uniti al centromero. Nel citoplasma, due organelli chiave denominati centrosomi iniziano ad assemblare strutture di microtubuli, comunemente note come fibre del fuso, in uno schema simile a una ruota.

La fase successiva, la prometafase, vede la rottura della membrana nucleare e l’assemblaggio di un complesso di proteine, noto come chinetocore, ai centromeri. Questa fase testimonia anche il collegamento delle fibre del fuso con il chinetocore.

Nella metafase, i cromosomi si allineano alla piastra metafase, un piano immaginario equidistante dai due centromeri. Durante l’anafase, i cromosomi “si rompono” al centromero, con i singoli cromatidi fratelli che migrano verso le estremità opposte della cellula. Nella telofase, il fuso mitotico si smonta e la cromatina inizia a decondense. Infine, durante la citochinesi – attraverso la contrazione di un anello di actina/miosina che forma il “solco di scissione” – la cellula madre si divide in due cellule figlie.

Con questa comprensione della progressione mitotica, diamo un’occhiata alle considerazioni pratiche per la visualizzazione di questo processo utilizzando l’imaging di cellule vive.

La prima domanda da porsi è: come etichettare le cellule per visualizzare la mitosi? I “tag” più comunemente impiegati per questo esperimento sono molecole fluorescenti, che assorbono la luce a una lunghezza d’onda ed emettono luce a un’altra lunghezza d’onda.

Per etichettare gli acidi nucleici, si può usare un colorante legante il DNA permeabile alle cellule, come Hoechst. Per etichettare proteine come i microtubuli, si possono usare anticorpi marcati fluorescentemente. Questi sono generalmente impermeabili alla membrana, e quindi vengono utilizzate tecniche di microiniezione per inserirli nei campioni.

Un’altra strategia è l’etichettatura genetica, in cui le cellule possono essere manipolate per esprimere proteine marcate fluorescentemente che etichettano i componenti attivamente coinvolti nella mitosi, come i cromosomi. Quando si lavora con molecole fluorescenti, è necessario evitare un’eccessiva esposizione alla luce per evitare il fotosbiancamento.

Scegliere il microscopio giusto è una decisione altrettanto importante. I due microscopi più comunemente usati sono epifluorescenti e confocali. La microscopia epifluorescente o a campo largo passa la luce sull’intero campo visivo, mentre la microscopia confocale utilizza i laser per focalizzare la luce su singoli punti.

Mentre i microscopi epifluorescenti sono in genere più economici, i microscopi confocali sono preferiti in quanto l’illuminazione puntuale fornisce una maggiore risoluzione ottica, producendo immagini più chiare. Il singolo punto di illuminazione riduce anche la fototossicità o l’aumento della morte cellulare causata da un’eccessiva esposizione alla luce.

Ora che abbiamo esaminato alcune considerazioni sperimentali, vediamo come eseguire un esperimento di imaging cellulare vivo per visualizzare la mitosi.

Le cellule dovrebbero essere coltivate su piatti con fondo di vetro o su coverslip, il che consente la migliore visualizzazione della mitosi. Successivamente, dovrebbero essere mantenuti in un ambiente controllato fino a quando non viene eseguita l’etichettatura. Come accennato in precedenza, la scelta della tecnica di etichettatura dipende dall’esperimento in questione. Dopo l’etichettatura, posizionare il piatto di coltura cellulare nella camera specializzata al microscopio. Ciò consente di mantenere le condizioni di coltura cellulare durante l’imaging.

Successivamente, a seconda della molecola di etichettatura, impostare le lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione sul microscopio. Per l’acquisizione dei dati, impostare i punti temporali e la posizione per l’acquisizione delle immagini. In questo contesto, i punti temporali sono le istanze in cui le immagini verranno acquisite per fornire una copertura visiva completa per tutte le fasi mitotiche. Le posizioni si riferiscono alle coordinate X-Y sul piatto di coltura. Inoltre, per ogni posizione è possibile acquisire immagini a diverse profondità di campo. Ogni immagine rappresenta una fetta ottica sull’asse Z. Pertanto, sono collettivamente noti come Z-stack. Dopo aver inserito tutti i parametri, prova le impostazioni e poi siediti e divertiti!

Avendo acquisito i dati time-lapse, ci sono diversi modi per presentarlo. Discutiamo alcuni di questi modi.

Un montaggio è uno dei modi più comuni per presentare dati time-lapse, in cui più immagini sono disposte in un modello simile a una griglia basato sul tempo. Questi possono mostrare chiaramente la progressione mitotica e consentire ai ricercatori di determinare informazioni come il tempo trascorso nelle singole fasi mitotiche. Combinare queste immagini in sequenza per creare un “film” può essere una presentazione più dinamica.

Infine, gli Z-stack ottenuti utilizzando un microscopio confocale possono essere combinati per presentare una ricreazione 3D di un campione. Questo può rivelare con precisione le relazioni spaziali tra pezzi del macchinario mitotico. Questo è importante poiché i componenti che si guardano uno accanto all’altro in 2D possono effettivamente essere molto distanti in tre dimensioni.

Ora che sai come eseguire un esperimento di imaging cellulare vivo, esaminiamo alcune applicazioni di questa tecnica.

La mitosi è una parte essenziale dello sviluppo. Qui, i ricercatori hanno isolato cervelli di topo embrionali per osservare la mitosi nelle cellule progenitrici neurali. La divisione controllata di queste cellule è fondamentale per una corretta crescita e funzione del cervello. Dopo l’isolamento, i cervelli sono stati sezionati utilizzando un vibratoma, colorati con colorante legante l’acido nucleico permeabile alla membrana e ripresi tramite microscopia confocale per visualizzare chiaramente la mitosi delle cellule progenitrici neurali.

La riparazione del DNA è un processo cellulare critico che è coinvolto nella crescita e nella divisione cellulare. In questo esperimento, i ricercatori hanno studiato una proteina di riparazione del DNA che forma i fuochi, che sono macchie puntate create in risposta al danno al DNA. I risultati dell’imaging delle cellule vive e dell’analisi 3D hanno evidenziato la localizzazione della proteina di riparazione del DNA durante il processo di divisione cellulare.

Infine, i ricercatori studiano i checkpoint mitotici, che sono punti di “pausa” in cui le condizioni cellulari vengono valutate prima che la divisione continui. Nella mitosi, il checkpoint di assemblaggio del fuso, o SAC, assicura una corretta connessione tra il fuso mitotico e i cromosomi. Per studiare questo, gli scienziati hanno microiniettato reagenti che inducono SAC in embrioni di mosca transgenica e hanno analizzato la mitosi utilizzando l’imaging di cellule vive. I risultati mostrano cinetocori arrestati, dimostrando cellule che non riescono a progredire attraverso la mitosi.

Hai appena visto il video di JoVE sull’imaging cellulare dal vivo della mitosi. Dopo un’introduzione alle fasi della mitosi, questo video ha introdotto importanti considerazioni e tecniche di analisi dei dati per l’imaging di cellule vive. Infine, sono state presentate le applicazioni di questa tecnica. L’imaging di cellule vive ha sostanzialmente aiutato gli scienziati a comprendere i meccanismi mitotici legati allo sviluppo, al mantenimento dei tessuti e alle malattie. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

Mitosis is the highly organized and controlled division of nuclear contents that occurs during the cell cycle. Mitosis is fundamentally important for proper organismal development, and for tissue growth, maintenance, and repair. Disruption of this process has been indicated in certain diseases, like cancer. Live cell imaging via time-lapse fluorescent microscopy is one of the most common methods of studying mitosis in labs today.

In this video, we’ll briefly introduce the phases of mitosis, and then discuss experimental considerations for live cell imaging of this cellular process. A detailed data acquisition and analysis protocol will be shown, and we’ll wrap up with a few applications of this technique.

To better understand what scientists are looking for in these imaging experiments, let’s first walk through the stages of mitosis.

The cell cycle describes the overall process of cell growth and division. The mitotic phase represents one short portion of this cycle, which can be further broken down into six phases: namely prophase, prometaphase, metaphase, anaphase, telophase, and cytokinesis.

During prophase, the DNA condenses into sister chromatids joined at the centromere. In the cytoplasm, two key organelles referred to as centrosomes begin assembling microtubule structures—commonly known as spindle fibers—in a wheel-like pattern.

The next phase, prometaphase, sees the breakdown of the nuclear membrane, and assembly of a complex of proteins, known as the kinetochore, at the centromeres. This phase also witnesses the linkage of the spindle fibers with the kinetochore.

In metaphase, the chromosomes line up at the metaphase plate, an imaginary plane equidistant from the two centromeres. During anaphase, chromosomes “break apart” at the centromere, with individual sister chromatids migrating to the opposite ends of the cell. In telophase, the mitotic spindle disassembles and the chromatin begins to decondense. Finally, during cytokinesis—via contraction of an actin/myosin ring that forms the “cleavage furrow”—the parent cell divides into two daughter cells.

With this understanding of mitotic progression, let’s take a look at the practical considerations for viewing this process using live cell imaging.

The first question to ask is: how to label cells in order to visualize mitosis? The most commonly employed “tags” for this experiment are fluorescent molecules, which absorb light at one wavelength and emit light at another wavelength.

In order to label nucleic acids, one can use a cell permeable DNA binding dye, like Hoechst. For labeling proteins such as microtubules, one can use fluorescently tagged antibodies. These are generally membrane impermeable, and therefore microinjection techniques are employed to insert them into samples.

Another strategy is genetic labeling, in which cells can be manipulated to express fluorescently tagged proteins that label components actively involved in mitosis, such as chromosomes. When working with fluorescent molecules, you must avoid excessive exposure to light to avoid photobleaching.

Choosing the right microscope is an equally important decision. The two most commonly used microscopes are epifluorescent and confocal. Epifluorescent or wide field microscopy passes light over the entire field of view, while confocal microscopy uses lasers to focus light onto single points.

While epifluorescent microscopes are typically cheaper, confocal microscopes are preferred as the point illumination provides increased optical resolution, producing clearer images. The single point of illumination also reduces phototoxicity, or increased cell death caused by excessive exposure to light.

Now that we’ve reviewed some experimental considerations, let’s see how to run a live cell imaging experiment for visualizing mitosis.

Cells should be cultured on glass bottom dishes or on coverslips, which allows for the best visualization of mitosis. Next, they should be maintained in a controlled envioronment until labeling is performed. As mentioned earlier, the choice of labeling technique depends on the experiment at hand. After labeling, place the cell culture dish into the specialized chamber on the microscope. This allows cell culture conditions to be maintained during imaging.

Next, depending on the labeling molecule, set the excitation and emission wavelengths on the microscope. For data acquisition, setup time points and position for image capture. In this context, time points are the instances at which images will be acquired to provide complete visual coverage for all mitotic stages. Positions refer to the X-Y coordinates on the culture dish. In addition, for each position one can acquire images at different depths of field. Each image represents an optical slice on the Z-axis. Therefore, they are collectively known as Z-stacks. After entering all parameters, test the settings and then sit back and enjoy!

Having acquired the time-lapse data, there are several ways to present it. Let’s discuss a few of these ways.

A montage is one of the most common ways to present time-lapse data, where multiple images are arrayed in a grid-like pattern based on time. These can clearly show mitotic progression, and allow researchers to determine information such as time spent in individual mitotic phases. Combining these images sequentially to make a “movie” can be a more dynamic presentation.

Lastly, Z-stacks obtained using a confocal microscope can be combined to present a 3D recreation of a sample. This can accurately reveal spatial relationships between pieces of the mitotic machinery. This is important since components that look next to each other in 2D may actually be far apart in three dimensions.

Now that you know how to run a live cell imaging experiment, let’s review some applications of this technique.

Mitosis is an essential part of development. Here, researchers isolated embryonic mouse brains to observe mitosis in neural progenitor cells. Controlled division of these cells is critical for proper brain growth and function. Following isolation, brains were sectioned using a vibratome, stained with membrane permeable nucleic acid-binding dye, and imaged via confocal microscopy to clearly visualize mitosis of neural progenitor cells.

DNA repair is a critical cellular process that is involved in cell growth and division. In this experiment, researchers studied a DNA repair protein that forms foci, which are punctate spots created in response to DNA damage. Results of live cell imaging and 3D analysis highlighted the localization of the DNA repair protein throughout the cell division process.

Finally, researchers study mitotic checkpoints, which are “pause” points where cellular conditions are assessed before division continues. In mitosis, the spindle assembly checkpoint, or SAC, ensures proper connection between the mitotic spindle and the chromosomes. To study this, scientists microinjected SAC-inducing reagents into transgenic fly embryos, and analyzed mitosis using live cell imaging. Results show arrested kinetochores, demonstrating cells that fail to progress through mitosis.

You’ve just watched JoVE’s video on live cell imaging of mitosis. Following an introduction to the stages of mitosis, this video introduced important considerations and data analysis techniques for live cell imaging. Finally, applications of this technique were presented. Live cell imaging has substantially helped scientists in understanding mitotic mechanisms related to development, tissue maintenance, and disease. As always, thanks for watching!

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