4.3: Imaging a cellule vive della mitosi

La mitosi è la divisione altamente organizzata e controllata dei contenuti nucleari che si verifica durante il ciclo cellulare. La mitosi è di fondamentale importanza per il corretto sviluppo dell'organismo e per la crescita, la manutenzione e la riparazione dei tessuti. L'interruzione di questo processo è stata indicata in alcune malattie, come il cancro. L'imaging di cellule vive tramite microscopia fluorescente time-lapse è uno dei metodi più comuni per studiare la mitosi nei laboratori di oggi.

In questo video, introdurremo brevemente le fasi della mitosi e poi discuteremo le considerazioni sperimentali per l'imaging cellulare vivo di questo processo cellulare. Verrà mostrato un protocollo dettagliato di acquisizione e analisi dei dati e concluderemo con alcune applicazioni di questa tecnica.

Per capire meglio cosa stanno cercando gli scienziati in questi esperimenti di imaging, passiamo prima attraverso le fasi della mitosi.

Il ciclo cellulare descrive il processo complessivo di crescita e divisione cellulare. La fase mitotica rappresenta una breve porzione di questo ciclo, che può essere ulteriormente suddivisa in sei fasi: vale a dire profase, prometafase, metafase, anafase, telofase e citochinesi.

Durante la profase, il DNA si condensa in cromatidi fratelli uniti al centromero. Nel citoplasma, due organelli chiave denominati centrosomi iniziano ad assemblare strutture di microtubuli, comunemente note come fibre del fuso, in uno schema simile a una ruota.

La fase successiva, la prometafase, vede la rottura della membrana nucleare e l'assemblaggio di un complesso di proteine, noto come chinetocore, ai centromeri. Questa fase testimonia anche il collegamento delle fibre del fuso con il chinetocore.

Nella metafase, i cromosomi si allineano alla piastra metafase, un piano immaginario equidistante dai due centromeri. Durante l'anafase, i cromosomi "si rompono" al centromero, con i singoli cromatidi fratelli che migrano verso le estremità opposte della cellula. Nella telofase, il fuso mitotico si smonta e la cromatina inizia a decondense. Infine, durante la citochinesi – attraverso la contrazione di un anello di actina/miosina che forma il "solco di scissione" – la cellula madre si divide in due cellule figlie.

Con questa comprensione della progressione mitotica, diamo un'occhiata alle considerazioni pratiche per la visualizzazione di questo processo utilizzando l'imaging di cellule vive.

La prima domanda da porsi è: come etichettare le cellule per visualizzare la mitosi? I "tag" più comunemente impiegati per questo esperimento sono molecole fluorescenti, che assorbono la luce a una lunghezza d'onda ed emettono luce a un'altra lunghezza d'onda.

Per etichettare gli acidi nucleici, si può usare un colorante legante il DNA permeabile alle cellule, come Hoechst. Per etichettare proteine come i microtubuli, si possono usare anticorpi marcati fluorescentemente. Questi sono generalmente impermeabili alla membrana, e quindi vengono utilizzate tecniche di microiniezione per inserirli nei campioni.

Un'altra strategia è l'etichettatura genetica, in cui le cellule possono essere manipolate per esprimere proteine marcate fluorescentemente che etichettano i componenti attivamente coinvolti nella mitosi, come i cromosomi. Quando si lavora con molecole fluorescenti, è necessario evitare un'eccessiva esposizione alla luce per evitare il fotosbiancamento.

Scegliere il microscopio giusto è una decisione altrettanto importante. I due microscopi più comunemente usati sono epifluorescenti e confocali. La microscopia epifluorescente o a campo largo passa la luce sull'intero campo visivo, mentre la microscopia confocale utilizza i laser per focalizzare la luce su singoli punti.

Mentre i microscopi epifluorescenti sono in genere più economici, i microscopi confocali sono preferiti in quanto l'illuminazione puntuale fornisce una maggiore risoluzione ottica, producendo immagini più chiare. Il singolo punto di illuminazione riduce anche la fototossicità o l'aumento della morte cellulare causata da un'eccessiva esposizione alla luce.

Ora che abbiamo esaminato alcune considerazioni sperimentali, vediamo come eseguire un esperimento di imaging cellulare vivo per visualizzare la mitosi.

Le cellule dovrebbero essere coltivate su piatti con fondo di vetro o su coverslip, il che consente la migliore visualizzazione della mitosi. Successivamente, dovrebbero essere mantenuti in un ambiente controllato fino a quando non viene eseguita l'etichettatura. Come accennato in precedenza, la scelta della tecnica di etichettatura dipende dall'esperimento in questione. Dopo l'etichettatura, posizionare il piatto di coltura cellulare nella camera specializzata al microscopio. Ciò consente di mantenere le condizioni di coltura cellulare durante l'imaging.

Successivamente, a seconda della molecola di etichettatura, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sul microscopio. Per l'acquisizione dei dati, impostare i punti temporali e la posizione per l'acquisizione delle immagini. In questo contesto, i punti temporali sono le istanze in cui le immagini verranno acquisite per fornire una copertura visiva completa per tutte le fasi mitotiche. Le posizioni si riferiscono alle coordinate X-Y sul piatto di coltura. Inoltre, per ogni posizione è possibile acquisire immagini a diverse profondità di campo. Ogni immagine rappresenta una fetta ottica sull'asse Z. Pertanto, sono collettivamente noti come Z-stack. Dopo aver inserito tutti i parametri, prova le impostazioni e poi siediti e divertiti!

Avendo acquisito i dati time-lapse, ci sono diversi modi per presentarlo. Discutiamo alcuni di questi modi.

Un montaggio è uno dei modi più comuni per presentare dati time-lapse, in cui più immagini sono disposte in un modello simile a una griglia basato sul tempo. Questi possono mostrare chiaramente la progressione mitotica e consentire ai ricercatori di determinare informazioni come il tempo trascorso nelle singole fasi mitotiche. Combinare queste immagini in sequenza per creare un "film" può essere una presentazione più dinamica.

Infine, gli Z-stack ottenuti utilizzando un microscopio confocale possono essere combinati per presentare una ricreazione 3D di un campione. Questo può rivelare con precisione le relazioni spaziali tra pezzi del macchinario mitotico. Questo è importante poiché i componenti che si guardano uno accanto all'altro in 2D possono effettivamente essere molto distanti in tre dimensioni.

Ora che sai come eseguire un esperimento di imaging cellulare vivo, esaminiamo alcune applicazioni di questa tecnica.

La mitosi è una parte essenziale dello sviluppo. Qui, i ricercatori hanno isolato cervelli di topo embrionali per osservare la mitosi nelle cellule progenitrici neurali. La divisione controllata di queste cellule è fondamentale per una corretta crescita e funzione del cervello. Dopo l'isolamento, i cervelli sono stati sezionati utilizzando un vibratoma, colorati con colorante legante l'acido nucleico permeabile alla membrana e ripresi tramite microscopia confocale per visualizzare chiaramente la mitosi delle cellule progenitrici neurali.

La riparazione del DNA è un processo cellulare critico che è coinvolto nella crescita e nella divisione cellulare. In questo esperimento, i ricercatori hanno studiato una proteina di riparazione del DNA che forma i fuochi, che sono macchie puntate create in risposta al danno al DNA. I risultati dell'imaging delle cellule vive e dell'analisi 3D hanno evidenziato la localizzazione della proteina di riparazione del DNA durante il processo di divisione cellulare.

Infine, i ricercatori studiano i checkpoint mitotici, che sono punti di "pausa" in cui le condizioni cellulari vengono valutate prima che la divisione continui. Nella mitosi, il checkpoint di assemblaggio del fuso, o SAC, assicura una corretta connessione tra il fuso mitotico e i cromosomi. Per studiare questo, gli scienziati hanno microiniettato reagenti che inducono SAC in embrioni di mosca transgenica e hanno analizzato la mitosi utilizzando l'imaging di cellule vive. I risultati mostrano cinetocori arrestati, dimostrando cellule che non riescono a progredire attraverso la mitosi.

Hai appena visto il video di JoVE sull'imaging cellulare dal vivo della mitosi. Dopo un'introduzione alle fasi della mitosi, questo video ha introdotto importanti considerazioni e tecniche di analisi dei dati per l'imaging di cellule vive. Infine, sono state presentate le applicazioni di questa tecnica. L'imaging di cellule vive ha sostanzialmente aiutato gli scienziati a comprendere i meccanismi mitotici legati allo sviluppo, al mantenimento dei tessuti e alle malattie. Come sempre, grazie per aver guardato!