Imaging a cellule vive della mitosi
La mitosi è una forma di divisione cellulare in cui il materiale genetico di una cellula è diviso equamente tra due cellule figlie. La mitosi può esse…
La mitosi è la divisione altamente organizzata e controllata dei contenuti nucleari che si verifica durante il ciclo cellulare. La mitosi è di fondamentale importanza per il corretto sviluppo dell'organismo e per la crescita, la manutenzione e la riparazione dei tessuti. L'interruzione di questo processo è stata indicata in alcune malattie, come il cancro. L'imaging di cellule vive tramite microscopia fluorescente time-lapse è uno dei metodi più comuni per studiare la mitosi nei laboratori di oggi.
In questo video, introdurremo brevemente le fasi della mitosi e poi discuteremo le considerazioni sperimentali per l'imaging cellulare vivo di questo processo cellulare. Verrà mostrato un protocollo dettagliato di acquisizione e analisi dei dati e concluderemo con alcune applicazioni di questa tecnica.
Per capire meglio cosa stanno cercando gli scienziati in questi esperimenti di imaging, passiamo prima attraverso le fasi della mitosi.
Il ciclo cellulare descrive il processo complessivo di crescita e divisione cellulare. La fase mitotica rappresenta una breve porzione di questo ciclo, che può essere ulteriormente suddivisa in sei fasi: vale a dire profase, prometafase, metafase, anafase, telofase e citochinesi.
Durante la profase, il DNA si condensa in cromatidi fratelli uniti al centromero. Nel citoplasma, due organelli chiave denominati centrosomi iniziano ad assemblare strutture di microtubuli, comunemente note come fibre del fuso, in uno schema simile a una ruota.
La fase successiva, la prometafase, vede la rottura della membrana nucleare e l'assemblaggio di un complesso di proteine, noto come chinetocore, ai centromeri. Questa fase testimonia anche il collegamento delle fibre del fuso con il chinetocore.
Nella metafase, i cromosomi si allineano alla piastra metafase, un piano immaginario equidistante dai due centromeri. Durante l'anafase, i cromosomi "si rompono" al centromero, con i singoli cromatidi fratelli che migrano verso le estremità opposte della cellula. Nella telofase, il fuso mitotico si smonta e la cromatina inizia a decondense. Infine, durante la citochinesi – attraverso la contrazione di un anello di actina/miosina che forma il "solco di scissione" – la cellula madre si divide in due cellule figlie.
Con questa comprensione della progressione mitotica, diamo un'occhiata alle considerazioni pratiche per la visualizzazione di questo processo utilizzando l'imaging di cellule vive.
La prima domanda da porsi è: come etichettare le cellule per visualizzare la mitosi? I "tag" più comunemente impiegati per questo esperimento sono molecole fluorescenti, che assorbono la luce a una lunghezza d'onda ed emettono luce a un'altra lunghezza d'onda.
Per etichettare gli acidi nucleici, si può usare un colorante legante il DNA permeabile alle cellule, come Hoechst. Per etichettare proteine come i microtubuli, si possono usare anticorpi marcati fluorescentemente. Questi sono generalmente impermeabili alla membrana, e quindi vengono utilizzate tecniche di microiniezione per inserirli nei campioni.
Un'altra strategia è l'etichettatura genetica, in cui le cellule possono essere manipolate per esprimere proteine marcate fluorescentemente che etichettano i componenti attivamente coinvolti nella mitosi, come i cromosomi. Quando si lavora con molecole fluorescenti, è necessario evitare un'eccessiva esposizione alla luce per evitare il fotosbiancamento.
Scegliere il microscopio giusto è una decisione altrettanto importante. I due microscopi più comunemente usati sono epifluorescenti e confocali. La microscopia epifluorescente o a campo largo passa la luce sull'intero campo visivo, mentre la microscopia confocale utilizza i laser per focalizzare la luce su singoli punti.
Mentre i microscopi epifluorescenti sono in genere più economici, i microscopi confocali sono preferiti in quanto l'illuminazione puntuale fornisce una maggiore risoluzione ottica, producendo immagini più chiare. Il singolo punto di illuminazione riduce anche la fototossicità o l'aumento della morte cellulare causata da un'eccessiva esposizione alla luce.
Ora che abbiamo esaminato alcune considerazioni sperimentali, vediamo come eseguire un esperimento di imaging cellulare vivo per visualizzare la mitosi.
Le cellule dovrebbero essere coltivate su piatti con fondo di vetro o su coverslip, il che consente la migliore visualizzazione della mitosi. Successivamente, dovrebbero essere mantenuti in un ambiente controllato fino a quando non viene eseguita l'etichettatura. Come accennato in precedenza, la scelta della tecnica di etichettatura dipende dall'esperimento in questione. Dopo l'etichettatura, posizionare il piatto di coltura cellulare nella camera specializzata al microscopio. Ciò consente di mantenere le condizioni di coltura cellulare durante l'imaging.
Successivamente, a seconda della molecola di etichettatura, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sul microscopio. Per l'acquisizione dei dati, impostare i punti temporali e la posizione per l'acquisizione delle immagini. In questo contesto, i punti temporali sono le istanze in cui le immagini verranno acquisite per fornire una copertura visiva completa per tutte le fasi mitotiche. Le posizioni si riferiscono alle coordinate X-Y sul piatto di coltura. Inoltre, per ogni posizione è possibile acquisire immagini a diverse profondità di campo. Ogni immagine rappresenta una fetta ottica sull'asse Z. Pertanto, sono collettivamente noti come Z-stack. Dopo aver inserito tutti i parametri, prova le impostazioni e poi siediti e divertiti!
Avendo acquisito i dati time-lapse, ci sono diversi modi per presentarlo. Discutiamo alcuni di questi modi.
Un montaggio è uno dei modi più comuni per presentare dati time-lapse, in cui più immagini sono disposte in un modello simile a una griglia basato sul tempo. Questi possono mostrare chiaramente la progressione mitotica e consentire ai ricercatori di determinare informazioni come il tempo trascorso nelle singole fasi mitotiche. Combinare queste immagini in sequenza per creare un "film" può essere una presentazione più dinamica.
Infine, gli Z-stack ottenuti utilizzando un microscopio confocale possono essere combinati per presentare una ricreazione 3D di un campione. Questo può rivelare con precisione le relazioni spaziali tra pezzi del macchinario mitotico. Questo è importante poiché i componenti che si guardano uno accanto all'altro in 2D possono effettivamente essere molto distanti in tre dimensioni.
Ora che sai come eseguire un esperimento di imaging cellulare vivo, esaminiamo alcune applicazioni di questa tecnica.
La mitosi è una parte essenziale dello sviluppo. Qui, i ricercatori hanno isolato cervelli di topo embrionali per osservare la mitosi nelle cellule progenitrici neurali. La divisione controllata di queste cellule è fondamentale per una corretta crescita e funzione del cervello. Dopo l'isolamento, i cervelli sono stati sezionati utilizzando un vibratoma, colorati con colorante legante l'acido nucleico permeabile alla membrana e ripresi tramite microscopia confocale per visualizzare chiaramente la mitosi delle cellule progenitrici neurali.
La riparazione del DNA è un processo cellulare critico che è coinvolto nella crescita e nella divisione cellulare. In questo esperimento, i ricercatori hanno studiato una proteina di riparazione del DNA che forma i fuochi, che sono macchie puntate create in risposta al danno al DNA. I risultati dell'imaging delle cellule vive e dell'analisi 3D hanno evidenziato la localizzazione della proteina di riparazione del DNA durante il processo di divisione cellulare.
Infine, i ricercatori studiano i checkpoint mitotici, che sono punti di "pausa" in cui le condizioni cellulari vengono valutate prima che la divisione continui. Nella mitosi, il checkpoint di assemblaggio del fuso, o SAC, assicura una corretta connessione tra il fuso mitotico e i cromosomi. Per studiare questo, gli scienziati hanno microiniettato reagenti che inducono SAC in embrioni di mosca transgenica e hanno analizzato la mitosi utilizzando l'imaging di cellule vive. I risultati mostrano cinetocori arrestati, dimostrando cellule che non riescono a progredire attraverso la mitosi.
Hai appena visto il video di JoVE sull'imaging cellulare dal vivo della mitosi. Dopo un'introduzione alle fasi della mitosi, questo video ha introdotto importanti considerazioni e tecniche di analisi dei dati per l'imaging di cellule vive. Infine, sono state presentate le applicazioni di questa tecnica. L'imaging di cellule vive ha sostanzialmente aiutato gli scienziati a comprendere i meccanismi mitotici legati allo sviluppo, al mantenimento dei tessuti e alle malattie. Come sempre, grazie per aver guardato!
La mitosi è la divisione altamente organizzata e controllata dei contenuti nucleari che si verifica durante il ciclo cellulare. La mitosi è di fondamentale importanza per il corretto sviluppo dell'organismo e per la crescita, la manutenzione e la riparazione dei tessuti. L'interruzione di questo processo è stata indicata in alcune malattie, come il cancro. L'imaging di cellule vive tramite microscopia fluorescente time-lapse è uno dei metodi più comuni per studiare la mitosi nei laboratori di oggi.
In questo video, introdurremo brevemente le fasi della mitosi e poi discuteremo le considerazioni sperimentali per l'imaging cellulare vivo di questo processo cellulare. Verrà mostrato un protocollo dettagliato di acquisizione e analisi dei dati e concluderemo con alcune applicazioni di questa tecnica.
Per capire meglio cosa stanno cercando gli scienziati in questi esperimenti di imaging, passiamo prima attraverso le fasi della mitosi.
Il ciclo cellulare descrive il processo complessivo di crescita e divisione cellulare. La fase mitotica rappresenta una breve porzione di questo ciclo, che può essere ulteriormente suddivisa in sei fasi: vale a dire profase, prometafase, metafase, anafase, telofase e citochinesi.
Durante la profase, il DNA si condensa in cromatidi fratelli uniti al centromero. Nel citoplasma, due organelli chiave denominati centrosomi iniziano ad assemblare strutture di microtubuli, comunemente note come fibre del fuso, in uno schema simile a una ruota.
La fase successiva, la prometafase, vede la rottura della membrana nucleare e l'assemblaggio di un complesso di proteine, noto come chinetocore, ai centromeri. Questa fase testimonia anche il collegamento delle fibre del fuso con il chinetocore.
Nella metafase, i cromosomi si allineano alla piastra metafase, un piano immaginario equidistante dai due centromeri. Durante l'anafase, i cromosomi "si rompono" al centromero, con i singoli cromatidi fratelli che migrano verso le estremità opposte della cellula. Nella telofase, il fuso mitotico si smonta e la cromatina inizia a decondense. Infine, durante la citochinesi – attraverso la contrazione di un anello di actina/miosina che forma il "solco di scissione" – la cellula madre si divide in due cellule figlie.
Con questa comprensione della progressione mitotica, diamo un'occhiata alle considerazioni pratiche per la visualizzazione di questo processo utilizzando l'imaging di cellule vive.
La prima domanda da porsi è: come etichettare le cellule per visualizzare la mitosi? I "tag" più comunemente impiegati per questo esperimento sono molecole fluorescenti, che assorbono la luce a una lunghezza d'onda ed emettono luce a un'altra lunghezza d'onda.
Per etichettare gli acidi nucleici, si può usare un colorante legante il DNA permeabile alle cellule, come Hoechst. Per etichettare proteine come i microtubuli, si possono usare anticorpi marcati fluorescentemente. Questi sono generalmente impermeabili alla membrana, e quindi vengono utilizzate tecniche di microiniezione per inserirli nei campioni.
Un'altra strategia è l'etichettatura genetica, in cui le cellule possono essere manipolate per esprimere proteine marcate fluorescentemente che etichettano i componenti attivamente coinvolti nella mitosi, come i cromosomi. Quando si lavora con molecole fluorescenti, è necessario evitare un'eccessiva esposizione alla luce per evitare il fotosbiancamento.
Scegliere il microscopio giusto è una decisione altrettanto importante. I due microscopi più comunemente usati sono epifluorescenti e confocali. La microscopia epifluorescente o a campo largo passa la luce sull'intero campo visivo, mentre la microscopia confocale utilizza i laser per focalizzare la luce su singoli punti.
Mentre i microscopi epifluorescenti sono in genere più economici, i microscopi confocali sono preferiti in quanto l'illuminazione puntuale fornisce una maggiore risoluzione ottica, producendo immagini più chiare. Il singolo punto di illuminazione riduce anche la fototossicità o l'aumento della morte cellulare causata da un'eccessiva esposizione alla luce.
Ora che abbiamo esaminato alcune considerazioni sperimentali, vediamo come eseguire un esperimento di imaging cellulare vivo per visualizzare la mitosi.
Le cellule dovrebbero essere coltivate su piatti con fondo di vetro o su coverslip, il che consente la migliore visualizzazione della mitosi. Successivamente, dovrebbero essere mantenuti in un ambiente controllato fino a quando non viene eseguita l'etichettatura. Come accennato in precedenza, la scelta della tecnica di etichettatura dipende dall'esperimento in questione. Dopo l'etichettatura, posizionare il piatto di coltura cellulare nella camera specializzata al microscopio. Ciò consente di mantenere le condizioni di coltura cellulare durante l'imaging.
Successivamente, a seconda della molecola di etichettatura, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sul microscopio. Per l'acquisizione dei dati, impostare i punti temporali e la posizione per l'acquisizione delle immagini. In questo contesto, i punti temporali sono le istanze in cui le immagini verranno acquisite per fornire una copertura visiva completa per tutte le fasi mitotiche. Le posizioni si riferiscono alle coordinate X-Y sul piatto di coltura. Inoltre, per ogni posizione è possibile acquisire immagini a diverse profondità di campo. Ogni immagine rappresenta una fetta ottica sull'asse Z. Pertanto, sono collettivamente noti come Z-stack. Dopo aver inserito tutti i parametri, prova le impostazioni e poi siediti e divertiti!
Avendo acquisito i dati time-lapse, ci sono diversi modi per presentarlo. Discutiamo alcuni di questi modi.
Un montaggio è uno dei modi più comuni per presentare dati time-lapse, in cui più immagini sono disposte in un modello simile a una griglia basato sul tempo. Questi possono mostrare chiaramente la progressione mitotica e consentire ai ricercatori di determinare informazioni come il tempo trascorso nelle singole fasi mitotiche. Combinare queste immagini in sequenza per creare un "film" può essere una presentazione più dinamica.
Infine, gli Z-stack ottenuti utilizzando un microscopio confocale possono essere combinati per presentare una ricreazione 3D di un campione. Questo può rivelare con precisione le relazioni spaziali tra pezzi del macchinario mitotico. Questo è importante poiché i componenti che si guardano uno accanto all'altro in 2D possono effettivamente essere molto distanti in tre dimensioni.
Ora che sai come eseguire un esperimento di imaging cellulare vivo, esaminiamo alcune applicazioni di questa tecnica.
La mitosi è una parte essenziale dello sviluppo. Qui, i ricercatori hanno isolato cervelli di topo embrionali per osservare la mitosi nelle cellule progenitrici neurali. La divisione controllata di queste cellule è fondamentale per una corretta crescita e funzione del cervello. Dopo l'isolamento, i cervelli sono stati sezionati utilizzando un vibratoma, colorati con colorante legante l'acido nucleico permeabile alla membrana e ripresi tramite microscopia confocale per visualizzare chiaramente la mitosi delle cellule progenitrici neurali.
La riparazione del DNA è un processo cellulare critico che è coinvolto nella crescita e nella divisione cellulare. In questo esperimento, i ricercatori hanno studiato una proteina di riparazione del DNA che forma i fuochi, che sono macchie puntate create in risposta al danno al DNA. I risultati dell'imaging delle cellule vive e dell'analisi 3D hanno evidenziato la localizzazione della proteina di riparazione del DNA durante il processo di divisione cellulare.
Infine, i ricercatori studiano i checkpoint mitotici, che sono punti di "pausa" in cui le condizioni cellulari vengono valutate prima che la divisione continui. Nella mitosi, il checkpoint di assemblaggio del fuso, o SAC, assicura una corretta connessione tra il fuso mitotico e i cromosomi. Per studiare questo, gli scienziati hanno microiniettato reagenti che inducono SAC in embrioni di mosca transgenica e hanno analizzato la mitosi utilizzando l'imaging di cellule vive. I risultati mostrano cinetocori arrestati, dimostrando cellule che non riescono a progredire attraverso la mitosi.
Hai appena visto il video di JoVE sull'imaging cellulare dal vivo della mitosi. Dopo un'introduzione alle fasi della mitosi, questo video ha introdotto importanti considerazioni e tecniche di analisi dei dati per l'imaging di cellule vive. Infine, sono state presentate le applicazioni di questa tecnica. L'imaging di cellule vive ha sostanzialmente aiutato gli scienziati a comprendere i meccanismi mitotici legati allo sviluppo, al mantenimento dei tessuti e alle malattie. Come sempre, grazie per aver guardato!
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Q1: What are the six phases of mitosis?
Mitosis consists of prophase, prometaphase, metaphase, anaphase, telophase, and cytokinesis. During prophase, DNA condenses into sister chromatids and centrosomes assemble spindle fibers. Prometaphase involves nuclear membrane breakdown and kinetochore assembly. Metaphase aligns chromosomes at the metaphase plate. Anaphase separates sister chromatids to opposite cell ends. Telophase disassembles the spindle and decondenses chromatin. Cytokinesis divides the parent cell into two daughter cells via an actin/myosin cleavage furrow.
Q2: How do scientists label cells for live cell imaging of mitosis?
Scientists use fluorescent molecules that absorb light at one wavelength and emit at another. DNA binding dyes like Hoechst label nucleic acids and are cell permeable. Fluorescently tagged antibodies label proteins such as microtubules but require microinjection since they're membrane impermeable. Genetic labeling allows cells to express fluorescently tagged proteins that mark mitotic components like chromosomes. Excessive light exposure must be avoided to prevent photobleaching.
Q3: Why is confocal microscopy preferred over epifluorescent microscopy for mitosis imaging?
Confocal microscopy uses lasers to focus light onto single points, providing increased optical resolution and clearer images compared to epifluorescent microscopy, which passes light over the entire field of view. The point illumination in confocal microscopy also reduces phototoxicity, or increased cell death caused by excessive light exposure. Although confocal microscopes are more expensive, their superior image quality and reduced cell damage make them the preferred choice for detailed mitotic visualization.
Q4: What are Z-stacks and why are they important in mitosis imaging?
Z-stacks are multiple optical slices captured at different depths of field along the Z-axis for each position on the culture dish. They allow researchers to reconstruct three-dimensional images of mitotic cells, accurately revealing spatial relationships between mitotic machinery components. This is critical because structures appearing adjacent in two-dimensional images may actually be far apart in three dimensions, providing essential information about the true organization of the dividing cell.
Q5: How are time-lapse imaging results typically presented to show mitotic progression?
Montages are the most common presentation method, displaying multiple images in a grid-like pattern based on time to clearly show mitotic progression and allow determination of time spent in individual phases. Sequential combination of these images creates dynamic movies for more engaging presentation. Confocal Z-stacks can be combined to generate 3D recreations that reveal spatial relationships between mitotic components with greater accuracy than 2D analysis alone.
Q6: What experimental setup is required before acquiring live cell imaging data?
Cells must be cultured on glass bottom dishes or coverslips for optimal visualization. They're maintained in a controlled environment until labeling is performed using the appropriate technique. After labeling, the culture dish is placed into a specialized microscope chamber that maintains cell culture conditions during imaging. Excitation and emission wavelengths are set based on the labeling molecule, and time points and X-Y positions are configured to capture complete coverage of all mitotic stages.
Q7: How is live cell imaging of mitosis applied to studying cell division?
Live cell imaging reveals mitotic mechanisms critical for understanding cell division proliferation cancer and development. Researchers use it to observe neural progenitor cell division during brain development, track DNA repair protein localization throughout division, and study spindle assembly checkpoints that pause division when chromosomes aren't properly connected. These applications have substantially helped scientists understand how mitosis is biologically controlled and how disruption of this process contributes to diseases like cancer.