La differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati CD34 cellule⁺

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare campioni di sangue cordonale umano per isolare cellule CD34-positive pure per studiare gli effetti di specifici farmaci di interesse sulla differenziazione dei megacariociti, sulla formazione delle propiastrine e sulla produzione di piastrine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul campo dei megacariociti e delle piastrine, come ad esempio quali sono gli effetti di un trattamento specifico sulla differenziazione dei megacariociti e sulla produzione e funzione piastrinica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo per l'isolamento coerente di cellule CD34-positive vitali dal sangue fresco del cordone ombelicale.

Attraverso questo metodo può fornire informazioni sulla megacariopoiesi, possono essere studiati anche altri tipi di cellule come linfociti, eritrociti e macrofagi. Iniziare aggiungendo 10 millilitri di tampone di separazione in una provetta conica da 150 millilitri per 10 millilitri di sangue del cordone ombelicale. Utilizzando un ago smussato calibro 18 montato su una siringa da 10 millilitri, trasferire 10 millilitri di sangue in ciascuna provetta, seguiti dall'aggiunta di 15 millilitri di terreno di separazione linfocitaria sul fondo di ciascuna provetta.

Separare le cellule mediante centrifugazione in gradiente di densità, quindi, alla fine della centrifuga, raccogliere con cura da cinque a 10 millilitri di cella mononucleata contenente uno strato di buffy coat in una nuova provetta per campione. Portare il volume totale in ciascuna provetta fino a 50 millilitri con un tampone di separazione fresco e centrifugare nuovamente le cellule. Risospendere i pellet in 5-10 millilitri di tampone di separazione fresco e raggruppare i campioni di cellule.

Regolare il volume a 50 millilitri con un tampone di separazione fresco per il conteggio e mettere da parte 100 microlitri di cellule per determinare la percentuale di cellule CD34 positive mediante citometria a flusso. Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in 300 microlitri di tampone di separazione, 100 microlitri di reagente bloccante IgG umano del recettore FC e 100 microlitri di microsfere magnetiche CD34 per una volta da 10 all'ottava cellula. Mescolare delicatamente le cellule prima di posizionarle a quattro gradi Celsius per un'incubazione di 30-40 minuti.

Durante l'incubazione, posizionare una colonna di separazione a biglie magnetiche di dimensioni adeguate nel supporto magnetico corrispondente e lavare la colonna con tre millilitri di tampone di separazione. Al termine dell'incubazione, rimuovere le perle non legate mediante centrifugazione in 5-10 millilitri di tampone di separazione e risospendere la microsfera magnetica e il pellet cellulare in 1,5 millilitri di tampone di separazione fresco. Caricare le celle marcate sulla colonna e raccogliere il flusso non etichettato in una provetta di raccolta da 15 millilitri.

Caricare nuovamente l'effluente sulla colonna e raccogliere il secondo giro di flusso nella stessa provetta di raccolta. Quindi lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone di separazione e rimuovere la colonna dal magnete. Utilizzando lo stantuffo della colonna, far scorrere gradualmente due millilitri di tampone di separazione attraverso la colonna in un nuovo tubo da 15 millilitri e rimettere la colonna nel magnete.

Caricare nuovamente le celle scaricate sulla colonna. Raccogliere il flusso e lavare la colonna con due millilitri di tampone di separazione, come appena dimostrato. Dopo aver rimosso la colonna dal magnete, lavare la colonna con due millilitri di tampone di separazione fresco per raccogliere la frazione cellulare CD34-positiva come appena dimostrato e raccogliere le cellule CD34-positive mediante centrifugazione.

Quindi risospendere il pellet in un terreno privo di siero per cellule CD34-positive. Per la differenziazione dei megacariociti, seminare da cinque x 10 alla quinta cellula CD34-positiva per millilitro in 2 millilitri di terreno privo di siero, integrato con trombopoietina umana ricombinante per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti per la loro incubazione a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, in un'atmosfera umidificata. Nei punti temporali appropriati per il monitoraggio della differenziazione, raccogliere le cellule da due a tre pozzetti per punto temporale senza disturbare le cellule negli altri pozzetti e colorare le cellule raccolte con anticorpi anti-CD41 e anti-CD42a per determinare la percentuale di megacariociti maturi all'interno delle colture.

Per la visualizzazione microscopica sui marcatori della superficie cellulare, lavare le cellule raccolte in 1 millilitro di tampone di separazione e risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone fresco. Utilizzare un citospin per seminare le cellule su un vetrino e fissare le cellule al vetrino con un'immersione di 30 secondi in metanolo. Dopo l'essiccazione all'aria, etichettare le celle con 20 microlitri di terreno di montaggio integrato con DAPI e coprire le celle con un vetrino coprioggetti per la visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza.

Per contare le propiastrine, raccogliere le cellule all'ottavo o nono giorno di differenziazione e seminare le cellule raccolte da una x 10 alla quarta cellula per 200 microlitri di terreno fresco privo di siero, integrato con trombopoietina umana ricombinante per pozzetto in una piastra a 48 pozzetti. Dopo cinque giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, contare il numero di megacariociti contenenti propiastrine per pozzetto su un microscopio ottico invertito, utilizzando l'obiettivo 10 o 20 volte. Per analizzare l'attivazione piastrinica, il giorno 14 o 15 di coltura, mescolare delicatamente le cellule con una pipetta Pasteur e raccogliere 100 microlitri di cellule.

Aggiungere 1 millilitro di tampone di Tyrode alle celle e pellettizzarle mediante centrifugazione. Raccogliere il surnatante per la centrifugazione per pellettare le particelle delle dimensioni delle piastrine e risospendere le particelle in 100 microlitri di tampone di Tyrode fresco, quindi etichettare le particelle con l'anticorpo anti-PAK1, attivarle con l'adenosina difosfato per 20 minuti a temperatura ambiente e analizzare la percentuale di eventi positivi per PAK1 mediante citometria a flusso. La percentuale tipica di cellule CD34-positive nel sangue del cordone ombelicale è di circa l'1,3% e la purezza delle cellule CD34-positive CD45-positive dopo l'isolamento varia dal 90 al 99%I megacariociti CD41-positivi si osservano precocemente nelle colture cellulari CD34-positive prive di siero, con la percentuale di megacariociti CD42a-positivi CD42a-positivi maturi che raggiungono il 30-40% entro il giorno 7 e i livelli più alti di cellule doppie positive osservati tra il giorno 10 e il 12 di differenziazione.

I megacariociti in coltura appaiono come grandi cellule, solitamente multinucleate, che esprimono il fattore di Von Willebrand CD42b e la P-selectina nel loro citoplasma. Almeno tre classi di ploidia sono comunemente osservate in queste colture cellulari. La percentuale di megacariociti che portano propiastrine, lunghe fibre perlate che si estendono dal corpo megacariocitario, è tipicamente di circa l'1,3%La maggior parte delle piastrine nel surnatante della coltura cellulare rientra nel cancello analitico delle piastrine del sangue periferico, sono positive per il marcatore piastrinico CD41, possono essere attivate da agonisti piastrinici come l'adenosina difosfato, come dimostrato da un aumento del legame dell'anticorpo monoclonale PAK1 specifico per l'attivazione.

Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come isolare le cellule CD34-positive dal sangue del cordone ombelicale. Sarai anche in grado di impostare colture di differenziazione dei megacariociti, contare le propiastrine e analizzare le piastrine e i megacariociti prodotti in vitro. Non dimenticare che lavorare con campioni umani può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come lavorare in una cabina di sicurezza biologica di classe II.