Name: La differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati CD34 cellule+ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Impara a isolare cellule CD34+ da sangue cordonale umano per studiare la differenziazione dei megacariociti e la produzione di piastrine. Questo metodo standardizzato offre purezze del 90-99% per ricerche ematologiche avanzate.

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Gli autori riconoscono il supporto del Australian Health and Medical Research Council (progetto grant 1012409 collegato a BHC).

Questo protocollo è stato approvato dal sud orientale Sydney umana ricerca comitato etico e ratificato dal comitato di etica umana ricerca l'Università del New South Wales. Sangue del cordone ombelicale ottenuto da donatori sani è stato fornito da Sydney Cord Blood Bank (Sydney, NSW, Australia). Volumi di circa 100 mL sono stati utilizzati per questa procedura.
Nota: Lavorare in una classe II biosicurezza utilizzando una tecnica asettica. Decontaminare l'esterno della sacca del sangue con etanolo al 70%. Per questa procedura, usare strumenti sterili (forbici, pinzette).
1. cavo di preparazione delle cellule del sangue e l'isolamento di CD34 cellule+
<ol>
	<li>Preparare il tampone di separazione sterile (SB) con tamponato fosfato salino (PBS), a pH 7,2 e contenente 0.5% bovino dell'albumina di siero e 2 mM EDTA.</li>
	<li>Versare 10 mL di SB in una provetta conica da 50 mL (una provetta per 10 mL di sangue è necessaria). Utilizzando un ago smussato G18 montato su una siringa da 10 mL, disegnare 10 mL di sangue dal sacchetto e dispensare nelle provette da 50 mL contenente 10 mL di SB.</li>
	<li>Aggiungere 15 mL di media di separazione del linfocita (Vedi Tabella materiali) alla parte inferiore del tubo contenente il sangue diluito, creando due strati. Nota: Dispensare media lentamente nella parte inferiore del tubo per evitare di miscelare i diversi strati.</li>
	<li>Centrifugare provette a 1.200 × g per 30 min a temperatura ambiente (TA) con senza pausa e senza accelerazione.</li>
	<li>Trasferire lo strato vicino al centro del tubo contenente cellule mononucleari (circa 5-10 mL da ciascuna provetta) in una nuova provetta da 50 mL utilizzando una pipetta Pasteur. Aggiungere SB ogni tubo per un volume totale di 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare a 400 × g per 10 min a RT. scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare accuratamente con una pipetta Pasteur in 5-10 mL di SB. Combine le cellule sospese e portare il volume a 50 mL con SB.</li>
	<li>Numero di celle utilizzando la macchiatura blu di Trypan e un emocitometro o automatizzata delle cellule contatore (Vedi Tabella materiali). Per determinare la percentuale di CD34+ cellule nel campione, risospendere 2,5 × 105 cellule in 100 µ l di SB e macchia aggiungendo 10 µ l di anticorpo anti-CD34-PE per 15-30 min a 4 ° C. Analizzare mediante citometria a flusso (Figura 1A).</li>
	<li>Provette per centrifuga a 400 × g per 10 min a 4 ° C. Gettare il surnatante. Nota: se non richiesto immediatamente, cellule mononucleari possono essere congelate in questa fase.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 300 µ l di SB per 108 cellule. Aggiungere 100 µ l di IgG umane FcR (reagente, bloccante Vedi Tabella materiali) e 100 µ l di CD34 biglie magnetiche per 108 cellule. Mescolare delicatamente e incubare a 4 ° C per 30-40 min. Nota: Una sospensione singola cella è necessaria (se necessario, passare le cellule però un filtro 30 µm prima di aggiungere i reagenti). Utilizzare i volumi di reagente descritti qui per 108 celle o meno. Per più di 108 celle, scalabilità di conseguenza i reagenti (SB, bloccando la soluzione e sfere magnetiche CD34).</li>
	<li>Preparare la colonna di separazione LS durante il periodo di incubazione posizionando la colonna LS in un supporto magnetico e lavaggio con 3 mL di SB. Discard effluente. Nota: Colonne di separazione LS possono essere caricate con fino a 2 × 108 cellule totali. Colonne più piccole e più grandi sono disponibili.</li>
	<li>Aggiungere 5-10 mL di SB per la miscela di cella e centrifugare a 400 × g per 10 min. scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1,5 mL di SB e caricare la sospensione cellulare (1,5 mL) sulla colonna di LS. Raccogliere il flusso attraverso contenente le celle senza etichetta in un tubo di raccolta di 15 mL (frazione negativo #1). Lasciate che il liquido svuotare e lavare la colonna con 1,5 mL di SB.</li>
	<li>Caricare il flusso raccolto attraverso (3 mL) nuovamente dentro la colonna e raccogliere il flusso attraverso nello stesso tubo di raccolta 15 mL (frazione negativo #1). Lavare la colonna LS 3 volte con 3 mL di SB. Nota: Se necessario, le cellule nella frazione negativa (12 mL) possono essere macchiate con l'anticorpo anti-CD34 per accertare la cattura di CD34+ cellule tramite la colonna di LS.</li>
	<li>Togliere colonna dal separatore magnetico e lavare le cellule lentamente con lo stantuffo della siringa in una nuova provetta da 15 mL con 2 mL di SB.</li>
	<li>Riposizionare colonna sul separatore magnetico e carico da 2 mL di celle nella colonna. Raccogliere il flusso attraverso e lavare con 2ml SB. Questa è la frazione negativa #2 (4 mL).</li>
	<li>Rimuovere la colonna LS da separatore magnetico e aggiungere 2 mL di Flush SB. cellule costantemente e saldamente con un pistone della siringa per raccogliere il CD34+ frazione delle cellule. Contare le celle usando la macchiatura blu di trypan e un emocitometro o contatore di cellule automatizzato.</li>
	<li>Provetta da centrifuga con la frazione positiva a 400 × g per 15 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in terreni privi di siero per CD34+ cellule (SFM, Vedi Tabella materiali). Nota: se non richiesto immediatamente, le cellule possono essere congelate in azoto liquido in questa fase.</li>
</ol>
2. purezza Check di CD34 isolato cellule+
<ol>
	<li>2 x 104 cellule dalla frazione positiva con 10 µ l l'anticorpo anti-CD34-PE e anticorpo anti-CD45-PerCP 20 µ l per 15 min a 4 ° C (uso un separato del tubo per i controlli dell'isotipo) (Figura 1B).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di SB per lavare. Centrifugare a 400 × g per 10 min. Risospendere il pellet in 200 µ l di SB.</li>
	<li>Eseguire l'analisi cytometric di flusso e cancello la popolazione di cellule vive per escludere detriti (Figura 1B). Impostare la porta per le popolazioni positivi PE e PerCP utilizzando i controlli di isotipo PE e PerCP (Figura 1B) e determinare la percentuale di CD34+/CD45+ cellule.</li>
</ol>
3. differenziamento megacariocitico
<ol>
	<li>Seme 5 × 105 cellule/mL CD34+ cellule in 2 mL di SFM completati con 50 ng/mL trombopoietina umana ricombinante (terapeutici) per pozzetto in un piatto di 12-pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2 in atmosfera umidificata. Se le cellule sono confluenti prima che sono necessari per l'analisi, raccogliere le cellule e dividere in pozzi multipli con media fresco e terapeutici. Nota: Due o tre pozzetti devono essere preparati specificamente per controllare la differenziazione in diversi momenti (ad esempio, giorni 7, 9 e 10).</li>
	<li>Raccogliere le cellule dai pozzetti accantonati per controllare la differenziazione senza disturbare le cellule in altri pozzi.</li>
	<li>Cellule di macchia con l'anticorpo anti-GPIIb/CD41-FITC di 20 µ l e 10 µ l anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 anticorpo in un volume finale di 100 µ l. impostare un controllo tubo usando gli anticorpi di controllo rispettivi isotype. Incubare per 15-30 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di SB per lavare.</li></ol>Centrifugare a 400 × g per 10 min. scartare il supernatante e risospendere il pellet in 200-300 µ l di SB. analizzare tramite flusso cytometry.
	<li>Per ogni fluoroforo, analizzare i controlli di isotipo per impostare il gating per popolazioni positivi FITC e Alexa 647 di farina. Analizzare i campioni di cellule macchiato per determinare la percentuale di CD41+/CD42a+ doppio cellule positive, che rappresentano maturo MK (Figura 1).</li>
	<li>Per visualizzazione microscopica della cellula marcatori di superficie macchiano le celle come descritto al punto 3.3.<ol>
		<li>Aggiungere 1 mL di SB per lavare. Centrifuga a 400 × g per 10 min. Risospendere il pellet in 100 µ l di SB e spin su una lastra di vetro a 1.000 x g per 5 min. Fix cellule sul vetrino mediante immersione in metanolo per 30 s. aria secca, aggiungere 20 µ l di montaggio supporti contenenti DAPI (Vedi Tabella materiali) , coprire con un vetrino coprioggetto e visualizzare utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per la visualizzazione di antigeni intracellulari, risospendere le cellule in PBS e fissate con paraformaldeide (1% di concentrazione finale) per 15 min a temperatura ambiente. Per permeabilize le celle, aggiungere triton-X100 (0,1%) e incubare per 15 min. cellule di lavaggio con 2 mL PBS/0.1% triton-X 100. Risospendere in 100 µ l di PBS/0.1% triton-X 100, aggiungere anti vWf e anti CD62p anticorpi (diluizione 1: 200) ed incubare per 30 min a temperatura ambiente.<ol>
		<li>Lavare con 2 mL PBS/0.1% triton-X100 e centrifugare a 400 × g per 10 min, risospendere in 100 µ l di buffer stesso e aggiungere anti-mouse IgG-Alexa 594 e anti-coniglio IgG-Alexa 488 (1: 100). Incubare per 30 min a temperatura ambiente, lavare con 2 mL PBS/0.1% triton-X100, risospendere in 100 µ l di buffer stesso e aggiungere 20 µ l di anti CD42b-APC. Poi girare le cellule su vetrini come descritto al punto 3.6.1 e preparare i campioni per visualizzazione microscopica come descritto al punto 3.6.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per la determinazione di ploidia, raccogliere le cellule ai giorni 12 o 13 di differenziazione. Aggiungere 1 mL di SB per lavare. Centrifuga a 400 × g per 10 min e macchia con l'anticorpo anti-GPIIb/CD41-FITC di 20 µ l in un volume finale di 100 µ l. Incubare a 4 ° C per 30 min.<ol>
		<li>Lavare una volta con 1 mL di SB e risospendere il pellet in 300 µ l di citrato ipotonico buffer (citrato di sodio di 1,25 mM, 2,5 mM di cloruro di sodio, destrosio di 3,5 mM) contenenti 20 µ g/ml ioduro di propidio e 0,05% Triton-X100. Incubare per 15 min a 4 ° C al riparo dalla luce.</li>
		<li>Aggiungere RNasi a una concentrazione finale di 20 µ g/mL ed incubare per 30 min a 4 ° C al riparo dalla luce. Determinare l'intensità di ioduro di propidio tramite flusso cytometry raccogliendo 30.000 a 50.000 eventi della popolazione CD41-FITC+ (Figura 2).</li>
	</ol>
	</li>

4. a conteggio, enumerazione della piastrina e l'attivazione piastrinica
<ol>
	<li>Raccogliere le cellule (dal punto 3.1) a giorni 8 o 9 di differenziazione e di sementi a 1 × 104 cellule/pozzetto in piastre 48 pozzetti in 200 µ l di fresco SFM completati con 50 ng/mL terapeutici. Cultura per 5 giorni a 37 ° C, 5% CO2. Nota: Ai fini della quantificazione, seme pozzi in triplice copia. Questa bassa densità è necessaria per la visualizzazione e contiamo di a-cuscinetto Mk. associato solitamente iniziano ad apparire dopo 2 giorni di cultura. Il picco è tra i giorni 4 e 5.</li>
	<li>Contare il numero di a-cuscinetto MK nel pozzo tutto su un microscopio invertito luce utilizzando 10 X o 20 X obiettivi. Nota: Una fase di microscopio riscaldata (37 ° C) è preferibile, dato che la conservazione delle cellule a temperatura ambiente per periodi prolungati provoca restringimento delle estensioni a. Associato è osservati come lunghe estensioni dal corpo MK. Ogni MK può avere diversi a sporgenze. Come sviluppa associato, il corpo della MK diminuisce nel formato.</li>
	<li>Raccogliere le cellule e centrifugare a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente. Macchia le cellule con l'anticorpo di anti-umani CD41-FITC 20 µ l, come descritto ai punti 3.3 e 3.4. Calcolare la percentuale di MK a cuscinetto (pbMK): pbMK (%) = [(MKs propiastrine-cuscinetto/bene) / (Totale CD41+ cellule / bene)] x 100</li>
	<li>Per contare le piastrine rilasciate nel terreno di coltura, delicatamente mescolare le cellule con una pipetta Pasteur e raccogliere 100 µ l a giorni 14 e 15 della cultura.<ol>
		<li>Macchiare con 20 µ l anticorpo anti-umane CD41-FITC per 20-30 min a 4 ° C. Impostare una provetta di controllo utilizzando l'anticorpo di controllo rispettivi isotype.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l di SB e 50 µ l di contare le perline.</li>
		<li>Per l'analisi cytometric di flusso, impostato il FSC e SSC scala logaritmica. Piastrine del sangue umane normale uso da plasma ricco di piastrine colorati con CD41-FITC come descritto in sezione 4.4.1 per impostare il gating per le piastrine (Figura 3A).</li>
		<li>Analizzare le piastrine macchiate con perline di conteggio tramite flusso cytometry. Raccogliere 1.000 eventi di conteggio perline utilizzando il FSC rispetto al grafico a dispersione SSC (Figura 3A). Calcolare il numero delle piastrine in base agli eventi positivi CD41-FITC (Figura 3B) utilizzando la formula: Piastrine per µ l = [(numero di eventi positivi CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/volume del campione)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per analizzare l'attivazione della piastrina, delicatamente mescolare le cellule con una pipetta Pasteur e raccogliere 100 µ l a giorni 14 e 15 della cultura. Aggiungere 1 mL di tampone (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12mm NaHCO3, 5,5 mM D-glucosio, pH 6.5) e centrifugare di Tyrode a 200 x g per 5 min agglomerare le cellule.<ol>
		<li>Raccogliere il surnatante e centrifuga a 800 x g per 10 min a particelle di dimensioni della piastrina di pellet.</li>
		<li>Eliminare il surnatante e risospendere in 100 µ l di tampone di Tyrode. Aggiungere 20 µ l di anticorpo PAC1-FITC e adenosina difosfato (ADP) ad una concentrazione finale di 20 µM. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. analisi di citometria a flusso per determinare la percentuale di eventi positivi FITC. Uso delle piastrine umane fresche trattate nello stesso modo come controllo positivo (Figura 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto qui è adatto a produzione costante MK e piastrine in coltura dal sangue del cordone ombelicale. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare i vari processi come l'effetto di droghe o di attività biologiche su MK proliferazione, differenziazione, a formazione e produzione della piastrina.
Una varietà di terreni di coltura e combinazioni di citochina sono stati presentati nella letteratura. Addizione di citochine come il fattore di cellula formativa, ligando Flt...

Isolamento di un numero adeguato di megacariociti umani primari (MK) per uso di laboratorio regolari non è fattibile a causa della loro bassa frequenza nel midollo osseo, dove rappresentano ~0.01% di cellule nucleate1. Una comoda alternativa è l'espansione ex vivo e la differenziazione delle staminali ematopoietiche e cellule progenitrici in presenza di specifici fattori di crescita. Una serie di citochine, compreso il fattore di cellula formativa (SCF; c-kit ligando) e interleuchina (IL) -3 e IL-11 è stati impiegati in sistemi di coltura per produrre MKs. Thrombopoietin (TPO) è il fattore più efficace di crescita e differenziazione megakaryocytic culture ed è efficace da solo o con altre citochine, quali SCF e IL-32. TPO può agire su popolazioni di cellule staminali per provocare la proliferazione e la maturazione di MKs2.
Le piastrine di produrre MK da protrusioni citoplasmatiche chiamati associato e, in vivo, circa 1 x 1011 piastrine sono formate ogni giorno per sostenere la conta piastrinica di 150-400 x 109produzione /L. piastrinica in vitro è fino a 1000 -piegare inferiori lo in vivo stima3, e ciò ha dato luogo a numerose condizioni di coltura utilizzando CD34+ cellule progenitrici ematopoietiche per migliorare della piastrina e MK produzione in vitro. La fonte iniziale di CD34+ celle utilizzate per il differenziamento di MK era sangue periferico umano4. Includono altre fonti di cellule del midollo osseo5,6, cellule staminali embrionali/induced pluripotent cellule staminali (ESC/iPSC)7e cordone ombelicale sangue (UCB)8,9,10 . Midollo osseo umano CD34+ 11 e mouse lignaggio negativo del midollo osseo cellule5 prodotti MK e piastrine in vitro; Tuttavia, la mancanza di disponibilità del midollo osseo umano limita il suo uso come fonte di CD34+ cellule. Al contrario, ESC e iPSC rappresentano una fonte illimitata di cellule per la produzione della piastrina in vitro . La produzione della piastrina da queste cellule richiede le cellule di alimentatore come cellule murine OP9 e periodi più lunghi di cultura. Le piastrine derivate in condizioni prive di alimentatore sembrano essere meno funzionale12. iPSC-derivato piastrine rischiano di essere di uso nelle regolazioni cliniche, dal momento che può essere espansa a larga scala. Questo processo richiede trasduzione lentivirale-mediata di fattori di trascrizione e a lungo termine delle cellule cultura13.
UCB è una fonte accessibile di CD34+ cellule che possono essere facilmente utilizzate in impostazioni di ricerca. TPO da solo può promuovere la differenziazione del midollo derivate dal sangue CD34+ cellule e questo dà luogo ad elevata purezza, maturo MKs senza l'esigenza del completamento del siero o co-coltura con le cellule di alimentatore. Altre citochine come SCF può diminuire la differenziazione da UCB CD34 cellule+ , mentre ligando Flt-3 e IL-11 promuovere la produzione di megacariociti acerbi14. Questo protocollo descrive la produzione di colture altamente pure MK cordonali CD34+ cellule nelle circostanze senza siero.

<table><tbody><tr><td>Reagenti per colture cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Terreni privi di siero per cellule CD34+</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagenti di isolamento CD34</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit MicroBead CD34 ultrapuro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>Questo kit include il reagente bloccante IgG umano FcR e microsfere CD34. Queste perle contengono il clone di anticorpi anti-CD34 QBEND/10. Utilizzare un clone anti-CD34 diverso per il controllo della purezza (ad es. clone 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Terreni di separazione dei linfociti (densità 1,077 g/mL)</td></tr><tr><td>Tampone di separazione sterile (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>Questo tampone contiene soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2 contenente lo 0,5% di albumina sierica bovina e 2 mM EDTA. Può essere preparato utilizzando componenti sterili di grado per colture cellulari. Degasare prima dell'uso perché le bolle d'aria possono ostruire la colonna.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Citometria a flusso e reagenti per la colorazione cellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Topo anti-umano CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Clone 8G12. Questo può essere utilizzato per il controllo della purezza del CD34. Concentrazione finale di anticorpi 1:10 diluizione.</td></tr><tr><td>PerCP topo anti-umano CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>diluizione 1:10</td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>diluizione 1:10</td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Concentrazione finale di anticorpi 1:5 diluizione.</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-Human CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>Questo anticorpo può essere utilizzato anche per rilevare MK maturo (la percentuale di cellule positive è solitamente inferiore rispetto all'anti CD42a). Concentrazione finale di anticorpi 1:10 diluizione.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Topo anti-Umano CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Attualmente distribuito da Bio-Rad. Concentrazione finale di anticorpi 1:10 diluizione.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse Controllo Negativo</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Attualmente distribuito da Bio-Rad. Anticorpo per il controllo dell'isotipo</td></tr><tr><td>Anti von Willebrand factor coniglio policlonale</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>V450 topo anti-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>diluizione 1: 20</td></tr><tr><td>V450 controllo dell'isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>diluizione 1:20</td></tr><tr><td>anticorpo PAC1-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>diluizione 1:10</td></tr><tr><td>Anti CD62p topo monoclonale</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti coniglio</td><td>IgG Invitrogen</td><td>A11008</td><td>diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anti topo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Anticorpo per il controllo dell'isotipo</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Conteggio delle perline</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS colonne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Colonne sempre più grandi sono disponibili in commercio</td></tr><tr><td>Magnete separatore MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL provette FACS in polipropilene a fondo tondo, con tappo a scatto, tecnologie sterili</td><td>in vitro</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>vetrini in vetro</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Supporti di montaggio con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Mezzo di montaggio antidissolvenza con DAPI</td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Microscopio</td><td></td><td>invertito Leica DMIRB</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore cellulare</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin centrifuga</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Catalog Numero</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software analizzatore cellulare</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td>Software per</tr><tr><td>l'analisi</td> di singole cellule <td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Software per microscopio fluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blue edition</td><td></td></tr></tbody></table>

la differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati cd34 cellule+

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

La produzione della piastrina si verifica principalmente nel midollo osseo in un processo noto come thrombopoiesis. Durante thrombopoiesis, cellule progenitrici ematopoietiche differenziano ai precursori delle piastrine forma chiamati megacariociti, che differenziano terminalmente per rilasciare le piastrine da processi citoplasmici lungo definiti associato. I megacariociti sono confinate al midollo osseo le cellule rare e sono quindi difficili da raccogliere in numero sufficiente per uso di laboratorio. Produzione efficiente di megacariociti umani può essere raggiunto in vitro coltivando CD34+ cellule nelle circostanze adatte. Il protocollo dettagliato qui descrive l'isolamento di CD34 cellule di+ da magnetico cella ordinamento da campioni di sangue del cordone ombelicale. Sono descritti i passi necessari per la produzione di megacariociti altamente puri, maturi nelle circostanze senza siero. Dettagli di analisi fenotipica di differenziamento megacariocitico e determinazione della produzione della piastrina e di formazione a disposizione. Gli effettori che influenzano la differenziazione dei megacariociti e/o a formazione, quali gli anticorpi anti-piastrine o mimetics della trombopoietina, possono essere aggiunti alle cellule coltivate per esaminare la funzione biologica.

Questo protocollo permette la preparazione di colture di MK altamente pure dal cordone derivate dal sangue CD34+ cellule. La percentuale di CD34+ cellule nel midollo sangue è di circa 1,3%15 (Figura 1A) e il numero totale di cellule mononucleari (passo 1,8) intervalli da 90-300 x 106 per unità UCB. La purezza di CD34 + cellule CD45 + dopo intervalli di isolamento da 90 a 99% (Figura...

Una popolazione altamente pura dei megacariociti sono ottenibili dal midollo derivate dal sangue CD34+ cellule. Un metodo per CD34+ differenziazione megacariocita e isolamento delle cellule è descritto qui.

La differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati CD34 cellule+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare campioni di sangue cordonale umano per isolare cellule CD34-positive pure per studiare gli effetti di specifici farmaci di interesse sulla differenziazione dei megacariociti, sulla formazione delle propiastrine e sulla produzione di piastrine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul campo dei megacariociti e delle piastrine, come ad esempio quali sono gli effetti di un trattamento specifico sulla differenziazione dei megacariociti e sulla produzione e funzione piastrinica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo per l'isolamento coerente di cellule CD34-positive vitali dal sangue fresco del cordone ombelicale.Attraverso questo metodo può fornire informazioni sulla megacariopoiesi, possono essere studiati anche altri tipi di cellule come linfociti, eritrociti e macrofagi. Iniziare aggiungendo 10 millilitri di tampone di separazione in una provetta conica da 150 millilitri per 10 millilitri di sangue del cordone ombelicale. Utilizzando un ago smussato calibro 18 montato su una siringa da 10 millilitri, trasferire 10 millilitri di sangue in ciascuna provetta, seguiti dall'agg

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

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Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra una tecnica per la differenziazione dei megacariociti e la formazione delle piastrine. Le cellule progenitrici staminali ematopoietiche, isolate dal sangue del cordone ombelicale umano, si differenziano in megacariociti maturi in presenza di trombopoietina. I megacariociti maturi producono estensioni citoplasmatiche chiamate propiastrine, che danno origine a singole piastrine.

Un metodo in vitro per la differenziazione dei megacariociti e la formazione delle piastrine

Qui, presentiamo pluripotenti umane protocolli di coltura della cellula formativa (hPSC), utilizzata per differenziare hPSCs in CD34+ progenitori ematopoietici. Questo metodo utilizza la modifica di fase-specifici di Canonica WNT segnalazione per specificare le celle esclusivamente al programma ematopoietica sia definitiva o primitivo.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, presentiamo un protocollo per la caratterizzazione immunofenotipica e la differenziazione citochina indotta del sangue cordonale derivato CD34- cellule staminali ematopoietiche e progenitrici ai quattro lignaggi mieloidi. Le applicazioni di questo protocollo includono indagini sull'effetto delle mutazioni della malattia mieloide o di piccole molecole sulla differenziazione mieloide del CD34- cellule.

Differenziazione pan-mieloide del sangue di cordone umano Derivato CD34- Cellule staminali eseminazioni e progenitrici

Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Questo protocollo descrive in dettaglio tutte le fasi necessarie per ottenere i progenitori ematopoietici CD34+ derivati dal leucofiltro e la loro differenziazione e maturazione in vitro in megacariociti portatori di proplatelet che sono in grado di rilasciare piastrine nel terreno di coltura. Questa procedura è utile per l'analisi approfondita dei meccanismi cellulari e molecolari che controllano la megacariopoiesi.

Filtri leucodeplezione-Cellule CD34+ derivate come fonte cellulare per studiare la differenziazione dei megacariociti e la formazione piastrinica

Qui presentiamo una strategia di immunofenotipizzazione per la caratterizzazione della differenziazione dei megacariociti, e mostriamo come tale strategia consente lo smistamento dei megacariociti in diverse fasi con uno smistatore di cellule attivato dalla fluorescenza. La metodologia può essere applicata ai tessuti primari umani, ma anche ai megacariociti generati in coltura in vitro.

Immunofenotipizzazione e smistamento cellulare di MK umani da fonti primarie umane o differenziati in vitro da progenitori ematopoietici

La modellizzazione dell'eritropoiesi fornisce una preziosa opportunità per comprendere il significato biologico degli attori in questo processo e per valutare nuovi approcci terapeutici che possono alleviare i difetti di differenziazione. Qui, descriviamo un metodo semplice e affidabile per differenziare in modo efficiente le cellule staminali ematopoietiche CD34+ e le cellule progenitrici ex vivo.

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In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Impara a isolare cellule CD34+ da sangue cordonale umano per studiare la differenziazione dei megacariociti e la produzione di piastrine. Questo metodo standardizzato offre purezze del 90-99% per ricerche ematologiche avanzate.

La differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati CD34 cellule⁺

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