Name: Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Scopri la decorazione superficiale di Mycobacterium bovis BCG con proteine ricombinanti avidina-biotina. Questa tecnica rapida migliora l'immunogenicità del vaccino e offre un'alternativa efficace ai metodi genetici tradizionali per lo sviluppo di vaccini.

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Ringraziamo Dr. R Stokes per il ceppo di BCG Pasteur e r. Talal per il supporto tecnico. Ringraziamo anche GenScript per aiuto con sintesi di geni.

Tutti gli animali sono stati mantenuti secondo protocolli approvati dalle commissioni di utilizzo presso la University of British Columbia e cura degli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dalle commissioni di utilizzo e cura degli animali ed eseguiti secondo il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali. Il numero di benessere animale assicurazione è A11-0247.
1. generazione di proteine di fusione di avidina monomerico esprimendo plasmidi
<ol><li>Sub-clonare monomerico avidina sequenza12 in plasmide pDEST17 tra i siti "CTC" e "GAA", che corrisponde a 133-134bp. (vale a dire, tra il 6-histag e il sito di ricombinazione Attr1 pDEST17) per ottenere p17-Avi. Nota: La sequenza di DNA di avidina monomerica è mostrata di seguito. Tre mutazioni introdotte nel selvaggio-tipo avidina ottenere monomerico avidina sono indicate in caratteri in grassetto. gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga</li>
	<li>Disegnare primers affiancato con AttB1 e B2 Attsiti corrispondenti a OVA polipeptide757-1035 (-Ab- e H-2_Kb-limitato epitopi) sequenza di DNA. Sono sequenze dell'iniettore: Attb1-OVA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT e Attb2-OVA GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 e Attb2 sequenze sono in grassetto).<ol>
<li>PCR-amplificare OVA polipeptide757-1035 sequenza di DNA con i primer sopra utilizzando il plasmide pUC57-OVA come modello.</li>
		<li>Duplicare i prodotti PCR in pDONR-221 attraverso una site-specific in vitro reazione di ricombinazione (ad es., BP Clonase) per ottenere pDONR-OVA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire il gene di interesse in p17-Avi usando la reazione di LR Clonase per ottenere p17-Avi-OVA. Nota: Per dettagli di clonazione di ricombinazione BP e LR, vedere il manuale del produttore.</li>
</ol>2. espressione della proteina di fusione monomerico avidina, purificazione e Refolding
<ol><li>Trasformare p17-Avi-OVA plasmide in e. coli BL21 e indurre 250 mL di e. coli BL21 cultura con IPTG (0,1 M) per 3 ore a 37 ° C.</li>
	<li>
Lisi dei batteri e corpi di inclusione solubilizzazione
	<ol>
<li>Pellet i 250 mL di indotto BL21 cultura da 30 min di centrifugazione a 4.000 x g e a 4 ° C.</li>
		<li>Raccogliere palline in 10 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidina-HCL, pH 1.5-2.5) e incubare per 15 min a 95 ° C. Incubare per una notte a temperatura ambiente in un rotatore.</li>
		<li>Centrifugare 30 min a 15.000 x g e 4 ° C e raccogliere surnatante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificare l'Avi-OVA da supernatante (frazione solubilizzata corpi di inclusione) utilizzando colonne di Ni-NTA.
	<ol>
<li>Diluire 1:2 di corpi di inclusione con tampone di lisi.</li>
		<li>Utilizzare 4 mL di resina Ni-NTA per 250 mL di cultura-derivato di corpi di inclusione.</li>
		<li>Lavare 3 volte con 10 mL di tampone di lisi (pH 7.0).</li>
		<li>Eluire con 10 mL di tampone di eluizione (lisi tampone pH 7.0 con imidazolo 250 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripiegare le proteine eluite diluendo graduale (01:10) e rapida nel Vortex in tampone Tris (pH 7,5) contenente 1 millimetro DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, arginina 500 mM e 200 mM NaCl per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>De-sale e cambio buffer riavvolgerlo proteina da tampone Tris in PBS con concentratori di proteina secondo i protocolli del produttore.</li>
	<li>Rimuovere gli aggregati mediante centrifugazione per 30 min a 3.500 x g e a 4 ° C e conservare le aliquote di proteina solubile a-20 ° C.</li>
</ol>3. biotinilazione della superficie delle cellule di BCG
<ol><li>Crescere di BCG in brodo Middlebrook 7H 9 brodo con 10% OADC (acido oleico, albumina e destrosio soluzione) e 0.05% Tween 80 a 37 ° C su una piattaforma di agitatore a 50 giri/min fino a OD = 0,5-1. Nota: BCG è un patogeno di livello 2 di biosicurezza e tutti gli esperimenti riguardanti BCG dovrebbero essere fatto in una cappa di biosicurezza con dispositivi di protezione personale.</li>
	<li>Lavare 109 BCG 3 volte con 500 µ l di PBS gratis endotossina ghiacciata più 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Sospendere a pellet BCG in gratuito PBS sterile endotossina.</li>
	<li>
Immediatamente prima dell'uso, preparare 1 mL di biotina di Sulfo-NHS SS 10 mM in acqua filtrata sterile.
	<ol>
<li>Incubare i batteri con 1 mL di 0.5 mM di biotina Sulfo-NHS SS a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavare con etichettati batteri 3 volte con 500 µ l di PBST freddo ghiacciato per rimuovere non reagiti biotinylation reagente.
	<ol>
<li>Risospendere il pellet in 1 mL di PBST.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Per valutare l'efficienza biotinylation, macchia 108 biotinilati BCG con Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µ l) a temperatura ambiente per 20 min.
	<ol>
<li>Incubare i batteri macchiati in 1 mL di 2% PFA per 20 min a temperatura ambiente e quindi esaminare i livelli di biotinilazione dall'analisi di citometria a flusso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. fenotipo di Biotinylated micobatteri: crescita e sopravvivenza
<ol><li>
Coltivare ceppi di BCG in brodo Middlebrook 7H 9 brodo con 10% OADC (acido oleico, albumina e destrosio soluzione) e 0.05% Tween 80 a 37 ° C su una piattaforma di agitatore a 50 giri/min.
	<ol>
<li>Registrare la densità ottica (OD600) della coltura batterica per un periodo di 8 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilizzare BCG-Luc (precedentemente descritto9) per rilevare la sopravvivenza dei batteri in macrofagi.
	<ol>
<li>Infettare le cellule RAW 264.7 con biotinilati BCG-Luc (MOI 10:1) o non trattata di BCG-Luc (controllo) e incubate a 37 ° C sopra un 48h periodo di tempo.</li>
		<li>Lavare monostrati di cellule umane e quindi lisare con 0.025% SDS per rilasciare batteri ingeriti.</li>
		<li>Misurare la produzione di bioluminescenza con sistema di analisi di Luciferase e luminometro. Nota: Il segnale di luminescenza è indicativo della vitalità batterica. Fare riferimento al manuale del produttore per ulteriori informazioni di analisi di luciferase.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. associazione di proteina monomerica avidina-Fusion biotinilati BCG superficie
<ol><li>Mix 5 x 108 biotinilati BCG con Avi-proteina (finale di 10 μg/mL in PBS-T) per 1 h a temperatura ambiente su piattaforma shaker.</li>
	<li>Batteri di lavare 3 volte con 500 µ l di PBST freddo ghiacciato e macchia con anticorpo di coniglio anti-avidina (Ab) (diluizione 1: 100, precedentemente descritti10) per 20 min a temperatura ambiente e poi con FITC Coniugato anti-coniglio di capra Ab IgG nelle stesse condizioni.</li>
	<li>Lavare i batteri 3 volte con 500 µ l di PBST e analizzare mediante citometria a flusso per valutare l'entità della decorazione di superficie.</li>
</ol>6. liofilizzazione di micobatteri
<ol><li>Biotinylate batteri secondo passo 3.1-3.4 e cappotto biotinilati batteri con Avi-OVA secondo punto 5.1.</li>
	<li>Aliquota biotinilato e rivestite con batteri (108), lavate con PBS e risospendere in media di liofilizzazione di 0,5 mL (mezzo Sauton 25% e 75% H2O 1,5% Na-glutammato).</li>
	<li>Trasferire i batteri a fiale di vetro e congelare in un congelatore a-80 ° C durante la notte.</li>
	<li>Lyophilize fiale di vetro riempito e congelato per 24 ore utilizzando un essiccatore di congelamento.</li>
	<li>Conservare i campioni essiccati a temperatura ambiente e ricostituire in PBS quando necessario.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.5 per valutare biotinylation e rivestimento stabilità superficiale.</li>
</ol>7. test di fagocitosi
<ol><li>Crescere 264.7 celle grezze del macrofago in piastre di coltura di diametro di 10 cm in DMEM Media contenente 5% FCS, 1% di L-Glutammina, HEPES, gli aminoacidi non essenziali e penicillina e streptomicina fino al confluency di 70-80%.</li>
	<li>2 x 106 RAW 264.7 cellule macrofagiche in una piastra a 6 pozzetti del seme. Consentire alle cellule di aderire durante la notte a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Generare DsRed BCG (precedentemente descritto9) decorate con Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) secondo una gradualità 3.1-3.4 e 5.1.</li>
	<li>Infettare cellule RAW con DsRed BCG-Avi-OVA o non trattata DsRed BCG a MOI 20:1 per 24 h a 37 ° C.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte e tripsinizzano con 1 mL di tripsina 0,25% a 37 ° C per 10 min per rimuovere batteri parzialmente disconnesso.</li>
	<li>Difficoltà nel 2,5% PFA in PBS per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare 3 volte con PBS e analizzare tramite flusso cytometry.</li>
</ol>8. intracellulare di ovuli decorato biotinilati BCG in macrofagi
<ol><li>
Microscopia a fluorescenza
	<ol>
<li>3 x 105 RAW 264.7 cellule macrofagiche sulle lamelle in una piastra a 24 pozzetti del seme. Consentire alle cellule di aderire durante la notte a 37 ° C e 5% CO2.</li>
		<li>Infettare cellule del macrofago con micobatteri (MOI 10:1) nei mezzi di manutenzione senza antibiotici a 37 ° C e 5% CO2 per 4-24 h.</li>
		<li>Lavare le cellule e tripsinizzano per rimuovere i batteri dalla superficie allegati, non ingerito come al punto 7.5.</li>
		<li>Correzione infettato cellule nel 2,5% PFA in PBS per 20 min a temperatura ambiente seguito da 3 lavaggi con PBS.</li>
		<li>Permeabilize le cellule nel buffer blocco/permeabilizzazione (0,1% Triton X-100, 3% BSA in PBS) per 20 min a temperatura ambiente.<ol>
<li>Anticorpo specifico uso di interesse (ad es., coniglio Ab anti-avidina) a 10 μg/mL in permeabilizzazione buffer per 20 min a temperatura ambiente seguito da anticorpo secondario (ad es., FITC-goat anti-rabbit IgG) per 20 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lavare le cellule 3 volte con PBS, una volta con acqua e montare su diapositive in 10 μL di mezzo di montaggio acquoso per minimizzare la fluorescenza photobleaching.</li>
		<li>Esaminare i vetrini al microscopio confocale digitale utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato x 63 / 1.4 obiettivo piano-apocromatico. Registrare le immagini utilizzando una fotocamera digitale accoppiato al software di microscopio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunogold macchiatura e microscopia elettronica
	<ol>
<li>2 x 106 RAW 264.7 cellule macrofagiche in piastre da 6 pozzetti del seme.</li>
		<li>Difficoltà macrofagi infettati BCG con 4% PFA per 4 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare campioni due volte con PBS.</li>
		<li>Incorporare i campioni nel 4% basso punto di fusione dell'agarosi e disidratare in etanolo al 70%.</li>
		<li>Trasferire campioni di resina acrilica e polimerizzare a 50 ° C.</li>
		<li>Tagliare 60 sezioni nm con un microtomo e raccogliere le sezioni sulle griglie di nichel.</li>
		<li>Etichettare i campioni con l'anticorpo di avidina 10 μg/mL per 1 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la notte nella soluzione di incubazione (PBS e 0.1% BSA) e poi lavare con incubazione soluzione coniugato oro f2 di ultra-piccolo goat-anti-rabbit IgG (1/20) per 1 h a camera temperatura nella soluzione di incubazione.</li>
		<li>Sezioni di lavare in acqua distillata, macchia in glutaraldeide al 2%, lavare di nuovo, lasciare asciugare all'aria ed esaminare con microscopio elettronico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. animale immunizzazione ed elaborazione dell'organo
Nota: Tutti i passaggi dovrebbero essere fatto in una cappa di biosicurezza.
<ol><li>Pass biotinilato e proteina rivestito batteri attraverso 271/2G ago 10 volte per rendere sospensione unicellulare.</li>
	<li>
Prendere 1 x 106 batteri in 100 μL di PBS privo di endotossina e immunizzare un topi C57BL/6 femminili (-A,b, H - 2Kb, 5-6 settimana vecchia) per via sottocutanea nella collottola del collo.
	<ol>
<li>Iniettare topi di controllo con 100 μL di PBS da solo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eutanasia topi immunizzati 20 giorni post-immunizzazione per inalazione di CO2 seguita da dislocazione cervicale.
	<ol>
<li>Isolare la milza e trasferirlo nel supporto di RPMI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Poltiglia della milza attraverso un colino di cella di 70 µm con un pistone della siringa 5 mL.
	<ol>
<li>Lavare con 5 mL di RPMI. Centrifuga (800 x g, 3 min) per isolare una sospensione unicellulare.</li>
		<li>Impoveriscono RBC con kit di selezione positiva di biotina mouse con biotina-Ter119/degli eritrociti cellule Ab.</li>
		<li>Centrifuga e risospendere le cellule in 10 mL di RPMI completo (10% FCS, 1% L-Glutammina, penicillina 1%, 1% streptomicina e 50 μM 2-ME).</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. I-Ab tetramero macchiatura per determinare le frequenze di antigene-specifici CD4+ le cellule di T e Cytokine colorazione intracellulare per determinare le frequenze di antigene-specifiche T cellule rilasciando citochine in animali immunizzati
<ol><li>
Tetramero di colorazione
	<ol>
<li>Macchia splenocytes dai topi immunizzati (~ 20 x 106 cellule) con PE-coniugato-Abe controllo-tetrameri di323-339 OVA (diluizione 1/12,5) per 1 h a 37 ° C nel buffer di associazione (PBS con FCS 2% e 0,1% di NaN3).</li>
		<li>Aggiungere AF647 CD4 Ab (01:25) e 7-AAD (per rilevare le cellule morte) gli splenocytes per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Analizzare i campioni mediante citometria a flusso.</li>
		<li>Acquisire 500.000 eventi della regione per determinare la frequenza di eventi positivi tetramero positiva CD4. Nota: Totale splenocytes sono definiti dalla macchia del puntino SSC/FSC, cellule vive dall'esclusione degli eventi positivi 7-AAD e sottoinsiemi di CD4 di gating AF647 eventi positivi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Frequenza di antigene specifico intracellulare Cytokine rilascio di cellule T
	<ol>
<li>Trasferimento di circa 1 × 107 splenocytes in 4 mL di terreno RPMI completo in sei pozzetti con o senza OVA ricombinante (10 µ g/mL) e incubare per 16 h.</li>
		<li>Curare le cellule con brefeldina A (1:1, 000) per altre 5 h.</li>
		<li>Lavaggio con PBS e soggette a intracellulare cytokine colorazione come segue:<ol>
<li>Macchia di campioni di cellule con PE-CD8 o PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 in buffer obbligatorio) a temperatura ambiente per 30 min.</li>
			<li>Difficoltà nel 4% PFA a temperatura ambiente per 20 min.</li>
			<li>Permeabilize utilizzando soluzione di permeabilizzazione, secondo le istruzioni del produttore.</li>
			<li>Lavare le cellule ed etichetta con AF647-coniugato IFN-γ Ab (01:50) per 20 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Lavare le cellule e soggetto a analisi di citometria a flusso, come descritto in precedenza.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Horwitz, M. A., Harth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vaccine+against+tuberculosis+affords+greater+survival+after+challenge+than+the+current+vaccine+in+the+guinea+pig+model+of+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis.</a> Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).</li>
<li>Pym, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+BCG+exporting+ESAT-6+confers+enhanced+protection+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.</a> Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).</li>
<li>Grode, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vaccine+efficacy+against+tuberculosis+of+recombinant+Mycobacterium+bovis+bacille+Calmette-Guerin+mutants+that+secrete+listeriolysin%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin.</a> The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).</li>
<li>Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Mycobacterium+bovis+BCG%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Recombinant Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).</li>
<li>Mederle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmidic+versus+insertional+cloning+of+heterologous+genes+in+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+impact+on+in+vivo+antigen+persistence+and+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses.</a> Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).</li>
<li>Singh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity+A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity.</a> Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).</li>
<li>Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+requirements+for+enhanced+antigen+cross-presentation+to+CD8+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes.</a> J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).</li>
<li>Sharif-Paghaleh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination+by+early+detection+of+%2899m%29+Tc-HMPAO-labelled+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells.</a> Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).</li>
<li>Laitinen, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+an+active+avidin+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rational design of an active avidin monomer.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).</li>
<li>Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+immunogenicity+of+the+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccine+by+non-genetic+bacterial+surface+decoration+using+the+avidin-biotin+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145833(2015).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li>
<li>Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin-biotin+technology+in+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Avidin-biotin technology in targeted therapy.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).</li>
<li>Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunotherapy+of+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Radioimmunotherapy of brain tumor.</a> Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).</li>
<li>Cummings, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+plant-produced+recombinant+monomer+hemagglutinin-based+influenza+vaccine+derived+from+influenza+A+%28H1N1%29pdm09+virus%3A+a+Phase+1+dose-escalation+study+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults.</a> Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).</li>
<li>Kolotilin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+solutions+for+veterinary+immunotherapeutics+and+prophylactics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics.</a> Vet Res. 45, 114-117 (2014).</li>
<li>Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+engineering+of+streptavidin+monomer+with+a+reduced+biotin+dissociation+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate.</a> Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).</li>
<li>Deghmane, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoamide+dehydrogenase+mediates+retention+of+coronin-1+on+BCG+vacuoles%2C+leading+to+arrest+in+phagosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation.</a> J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).</li>
<li>Soualhine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+bovis+bacillus+Calmette-Guerin+secreting+active+cathepsin+S+stimulates+expression+of+mature+MHC+class+II+molecules+and+antigen+presentation+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages.</a> J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).</li>
<li>Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+antibodies+to+avidin+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22ImmunolLett%22%5BJournal%5D)">Natural antibodies to avidin in human serum.</a> ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).</li>
<li>Petronzelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+avidin+is+not+hampered+by+antiavidin+antibodies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biother+Radiopharm%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans.</a> Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).</li>
<li>Bigini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+of+avidin-nucleic+acid+nanoassemblies+as+multifunctional+diagnostic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools.</a> ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo segnalato in questo studio un approccio non-genetica per visualizzazione rapida ed efficace delle proteine esogene sulla superficie di BCG per aggiungere gli antigeni specifici o specifiche proprietà funzionali dovuto migliorare in modo efficiente l'immunogenicità del batterio. Abbiamo dimostrato che la superficie della cellula di BCG potrebbe essere facilmente biotinilato per decorazione di superficie istantanea con proteine di fusione di avidina. La procedura totale può essere eseguita entro 2 h, mentre la tras...

Sono state proposte varie strategie per sostituire l'attuale vaccino BCG, inclusi sistemi proteici adiuvante, tecnologie basato su vettori virali, ceppi di M.tb vivo attenuati e geneticamente ceppi di BCG, sia per introdurre geni di TB che iper-esprimono gli antigeni di BCG che non sono sufficientemente espressi durante infezione1 o Mtb-antigeni specifici non presentano in BCG2. Ingegneria genetica, tuttavia, affronta molte barriere tra cui l'incerto livello di sicurezza, il processo che richiede tempo e la bassa efficienza di vettori di espressione4,5. Per quanto riguarda il miglioramento BCG, è necessario un approccio alternativo per migliorare immunogenicità senza la necessità di alternanze genetiche incerti.
In questo studio, presentiamo una nuova strategia per la visualizzazione di proteine ricombinanti di interesse sulla superficie della cellula di BCG che si basa sull'interazione ben noto ad alta affinità avidina con biotina. Questo approccio permette di attacco rapido e riproducibile di proteine di fusione ricombinante avidina sulla superficie di biotinylated BCG, che facilita la vaste manipolazioni di BCG per conseguire il miglioramento massimo della sua efficacia pur mantenendo la sicurezza eccellente registrare, osservato in decenni di utilizzo.
Affinità avidina biotina è estremamente alta (Kd = 10− 15 M) e una volta che formato, il complesso avidina-biotina è molto stabile e può essere interrotta solo sotto condizioni6di denaturazione. Tuttavia, per questo tipo di interazione per servire come un'alternativa di metodo di trasferimento gene, esposizione a lungo termine ma reversibile di proteine ricombinanti è richiesto. Così, abbiamo qui introdotto un avidina monomerico bassa affinità (Kd = 10− 7 M) che conduce al rilascio reversibile della proteina dalla superficie decorata BCG una volta ingeriti all'interno di cellule presentanti l'antigene. Al fine di fornire una prova di concetto, abbiamo testato questo metodo utilizzando una proteina chimerica monomerico avidina corrispondente ad un antigene di surrogato derivato da ovoalbumina (uova)7,8. I risultati hanno mostrato che la superficie della cellula di BCG può essere facilmente e rapidamente decorata con proteine di fusione di avidina monomerico e che questa associazione alla superficie di BCG è stabile e riproducibile senza variazioni rilevabili in crescita batterica e la sopravvivenza. Inoltre, abbiamo trovato che BCG decorato con avidina monomerico fuso con ovuli (AviOVA) può indurre una risposta immunitaria simile a quella indotta da BCG geneticamente che esprimono l'antigene stesso sia in vitro che in vivo. Questa tecnologia di schermo reversibile di proteine di interesse sulla superficie batterica è pertanto un efficace sostituto di gene tradizionale trasferimento approcci e può fornire una piattaforma per ulteriori applicazioni nel vaccino e ampia manipolazioni di BCG sviluppo.

<table><tbody><tr><td>Tecnologie RPMI 1640</td><td>StemCell</td> senza endotossine<td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS biotina</td><td>Thermo Fisher</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina coniugata FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>Ficoeritrina (PE)-coniugata I-Ab-OVA323-339 tetramero&nbsp;</td><td>MBL Internazionale&nbsp;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON poliistidina-Resina per purificazione Tag&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 coniugato ratto anti-topo CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>AF647 ratto anti-topo IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557735</tr><tr><td>AF647 ratto anti-topo I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>562367</tr><tr><td>PeCy7 ratto anti-topo CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>552775</tr><tr><td>PE ratto anti-topo CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>561095</tr><tr><td>AF 647 ratto anti-topo H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coniugato capra anticorpo coniglio</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 ratto anti-topo CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>Microscopia elettronica</td><td>anti-coniglio di capra coniugata in oro ultra-piccolo Scienze</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Brodo Middlebrook 7H9</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 linee cellulari di macrofagi murini</td><td>Tipo americano Collezione</td><td></td><td></td>di colture</tr><tr><td>pDEST17 plasmide&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pUC57-OVA</td><td>GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP clonasi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR clonasi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pDONR221</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>colonne Ni-NTA&nbsp;</td><td>Concentratori di proteine Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II microscopio per epifluorescenza</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD fotocamera digitale&nbsp;</td><td>Retiga EX, Microscopio elettronico QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 200kV&nbsp;</td><td>Azienda FEI</td><td>G2 200Kv&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; m Filtro cellulare Falcon</td><td>Thermo Fisher</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>Kit di selezione positiva della biotina del mouse EasyStep</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>biotina-Ter119/Cellule ertiroidi anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>kit Cytofix/Cytoperm&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di dosaggio della luciferasi Bright-Glo</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Luminometro Turner Biosystem&nbsp;</td><td>Microtomo Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6</td><td> Liofilizzatore Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Fiale in vetro boroscilicato</td><td>Wheaton</td><td> VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

espressione di antigeni esogeni nel mycobacterium bovis bcg vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tubercolosi (TB) è una malattia infettiva grave e il bacillo di M. bovis vaccino disponibile solo Calmette-Guérin (BCG) è sicuro ed efficace per la protezione contro la meningite di TB severa per bambini e alcune forme di TB diffusa, ma non riesce a proteggere contro la tubercolosi polmonare, che è la forma più diffusa della malattia. Strategie più promettenti per migliorare BCG attualmente si basano sia sulla sua trasformazione con geni codificanti immunodominanti M. tuberculosis (Mtb)-antigeni specifici e/o complementazione con geni codificanti co-fattori di che stimolerebbero l'antigene cellule presentanti. Principali limiti di questi approcci includono bassa efficienza, bassa stabilità e l'incerto livello di sicurezza dei vettori di espressione. In questo studio, presentiamo un approccio alternativo al miglioramento di vaccino, che consiste di complementazione di BCG con proteine esogene di interesse sulla superficie dei batteri, piuttosto che la trasformazione con plasmidi codifica geni corrispondenti. In primo luogo, le proteine di interesse sono espressi in fusione con avidina monomerica in standard Escherichia coli sistemi di espressione e quindi utilizzato per decorare la superficie di biotinylated BCG. Utilizzando BCG superficie decorata con antigene ovoalbumina surrogato gli esperimenti sugli animali dimostrano che il batterio modificato è completamente immunogenico e capace di indurre risposte delle cellule T specifiche. Complessivamente, i dati presentati qui fortemente sostengono un romanzo e un metodo efficiente per rimodellare l'attuale vaccino BCG che sostituisce l'approccio convenzionale laborioso di complementazione con acidi nucleici esogeni.

Con le procedure generali descritte sopra, è stata esaminata la fattibilità di BCG superficie biotinylation e decorazione con antigene surrogato OVA. L'immunogenicità del BCG modificate è stato poi testato in vivo. La superficie batterica è stato facilmente etichettata con biotina per la visualizzazione rapida di antigeni chimerico avidina senza modifiche rilevabili nei fenotipi batterici. Il BCG modificate risultante viene ingerito efficientemente dalle cellule di presentazione ...

Una nuova tecnica per la visualizzazione rapida dell'antigene su una superficie batterica è presentata, che coinvolge la superficie biotinylation seguita dall'esposizione alle proteine di interesse in fusione con avidina monomerico. Caricamento di BCG con antigeni selezionati correttamente, migliora la sua immunogenicità, suggerendo che la decorazione di superficie può sostituire tradizionali approcci genetici.

Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esprimere proteine di superficie su micobatteri utilizzando la decorazione superficiale con proteine ricombinanti come alternativa agli approcci tradizionali basati sulla genetica. Questi metodi possono aiutare a rispondere a importanti domande di ricerca nel campo della micobatteriologia, in particolare nell'area delle interazioni ospedaliere e dello sviluppo di vaccini. Questa tecnica può essere utilizzata per lo screening di potenziali fattori di interferenza o antigeni candidati.Può essere rapidamente paragonato agli approcci tradizionali basati sulla genetica, meticolosi e dispendiosi in termini di tempo. A dimostrare questa procedura sarà Amina Talal, un'assistente di ricerca nel mio laboratorio. Questa parte del protocollo inizia con la trasformazione del plasmide OVA P17 Aviden in E.Coli BL21.Per fare ciò, indurre 250 millilitri di coltura di E.Coli BL21 con IPTG per tre ore a 37 gradi Celsius. Dopo tre ore, lisare i batteri per solubilizzare i corpi inclusi pellettando prima la coltura BL21 indotta e scartando il surnatante. Quindi risospendere il pellet in 10 millilitri di tampone di lisi e lasciare che le cellule vengano lisate per 15 minuti.Continuare quindi l'incubazione a temperatura ambiente utilizzando un rotatore per l'agitazione e lasciarla andare per una notte. Al mattino centrifugare il composto per mezz'ora. Quindi raccogliere il surnatante contenente i corpi di inclusione solubilizzati.Successivamente, purificare le proteine OVA di Aviden utilizzando una colonna NTA di nichel. Innanzitutto, diluire il surnatante uno o due nel tampone di lisi e stimare il volume. Quindi preparare una colonna contenente quattro millilitri di resina NTA di nichel per 250 millilitri di surnatante diluito e caricare la diluizione sulla colonna.Successivamente, lavare la colonna tre volte utilizzando 10 millilitri di tampone di lisi a pH sette per lavaggio. Per raccogliere la proteina ricombinante, lavare la colonna con un tampone di lisi contenente imidazolo e raccogliere l'eluato. Se la tua proteina ricombinante è priva di corpi di inclusione, la seguente è la procedura che andrà bene per molte proteine nel nostro laboratorio.Innanzitutto, regola il pH della soluzione di ripiegamento in modo che sia un'unità sopra o sotto il punto isoelettrico della proteina. Quindi, vorticare gradualmente e diluire la proteina a una diluizione da 1 a 10 in una soluzione di ripiegamento. Quindi incubare la proteina su un agitatore magnetico per 30 minuti a temperatura ambiente per completare il processo di ripiegamento.Successivamente, la dissalinizzazione e il tampone scambiano le proteine ripiegate in PBS utilizzando un concentratore di proteine. Seguire centrifugando la colonna e conservare aloquat di proteina solubile a 20 gradi Celsius. Lavora in una cabina di biosicurezza utilizzando dispositivi di protezione individuale perché il BCG è un agente patogeno di livello 2.Per biotinilare la superficie delle cellule BCG, far crescere prima le cellule su una piattaforma shaker alla densità corretta. Raccogli circa un miliardo di cellule e lavale tre volte usando 500 microlitri di PBST ghiacciato e privo di endotossine. Quindi, spin down le cellule e sospenderle in PBS sterile e privo di endotossine.Successivamente, preparare la biotina solfo-NHSSS fresca da 10 millimolari in acqua filtrata sterile. Quindi incubare i batteri in un millilitro di brodo contenente 0,5 millimolari di solfo-NHSSS Biotina. Eseguire l'incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi lavare i batteri ora etichettati tre volte con 500 microlitri di PBST ghiacciato, come prima per rimuovere il reagente non reagito. Quindi, risospendere il pellet in un millilitro di PBST. Per valutare l'efficienza della biotinilazione, colorare un aloquat di 100 milioni di BCG biotinilato con 25 microlitri di Strepravidin-FITC.Quindi, incubare brevemente i batteri colorati nella para-formaldeide, quindi misurare il livello di biotinilazione utilizzando la citometria a flusso. Dopo aver valutato la crescita e la sopravvivenza dei micobatteri biotinilati, procedere con il legame della proteina di fusione Aviden ad essi. Innanzitutto, mescola 500 milioni di BCG biotinilati con la proteina di fusione Aviden per una concentrazione finale di 10 microgrammi di proteine per millilitro.Lasciate andare questa reazione per un'ora a temperatura ambiente su uno shaker. Successivamente, lavare i batteri tre volte con 500 microlitri di PBST ghiacciato. Quindi colorare i batteri con l'anticorpo anti-Aviden di coniglio per 20 minuti a temperatura ambiente.Dopo 20 minuti, eseguire una fase di lavaggio con 500 microlitri di PBST ghiacciato. Quindi, colorare i batteri con l'anticorpo IGG anti-coniglio di capra coniugato FITC. Successivamente, lavare i batteri utilizzando 500 microlitri di PBST ghiacciato e analizzare i batteri mediante citometria a flusso per valutare la decorazione della superficie.Dopo aver seguito il protocollo descritto, la citologia mostra che c'erano livelli minimi di legame OVA con batteri non biotinilati e livelli significativi di legame OVA con batteri biotinilati. È importante sottolineare che i livelli di Aviden OVA sulla superficie batterica sono rimasti stabili e rilevabili un mese dopo la liofilizzazione e la conservazione a temperatura ambiente. Successivamente, sono state utilizzate cellule RAW e batteri dsRed per eseguire un test di fagocitosi.Piacevolmente, non c'era deterrenza nel fenotipo dei macrofagi. Per esaminare il destino dei BCG decorati con OVA Aviden all'interno dei macrofagi, le cellule RAW aderenti sono state infettate ed esaminate mediante microscopia a fiorescenza. L'OVA di Aviden non era solo presente sulla superficie batterica, ma anche staccato e translocalizzato nel citoplasma lontano dai batteri.Un esperimento di immuno-colorazione con oro ha dimostrato che gli antigeni Aviden OVA possono staccarsi dalla superficie del BCG, attraversare la membrana fagosomica e viaggiare verso il citosol. I macrofagi infettati con Aviden OVA BCG hanno mostrato una co-localizzazione di Avi OVA con molecole IA. Ciò suggerisce che le proteine di fusione di Aviden si staccano e si traslocano nei compartimenti di presentazione dell'antigene per essere caricate sulle molecole MHC2.I peptidi OVA di Aviden sono anche co-localizzati con molecole di classe I all'interno dei fagosomi BCG, come dimostrato dalla colorazione H2K. Pertanto, esiste una potenziale presentazione dell'antigene Avi OVA alle cellule T CD8 positive da parte del macrofago. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere le proteine nei micobatteri e questo organismo difficile da manipolare con gli attuali metodi genetici.Dopo la tecnica, la usiamo con successo per caricare il vaccino con l'antigene dei micobatteri è a sei. Poi abbiamo dimostrato che i vaccini modificati erano l'opportunità di utilizzare come risposta immunitaria specifica nel modello murino. Attualmente stiamo collaborando con per esplorare questo approccio in teratina Abbiamo proposto di utilizzare BCG aggiornato con antigeni o immunobulatori selezionati.

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Il presente protocollo descrive la bioingegneria delle vescicole della membrana esterna come una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display", compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.

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Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l'encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l'epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) 35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.

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Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina (Video) | JoVE Journal

Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

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