Name: Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Scopri la decorazione superficiale di Mycobacterium bovis BCG con proteine ricombinanti avidina-biotina. Questa tecnica rapida migliora l'immunogenicità del vaccino e offre un'alternativa efficace ai metodi genetici tradizionali per lo sviluppo di vaccini.

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Ringraziamo Dr. R Stokes per il ceppo di BCG Pasteur e r. Talal per il supporto tecnico. Ringraziamo anche GenScript per aiuto con sintesi di geni.

Tutti gli animali sono stati mantenuti secondo protocolli approvati dalle commissioni di utilizzo presso la University of British Columbia e cura degli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dalle commissioni di utilizzo e cura degli animali ed eseguiti secondo il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali. Il numero di benessere animale assicurazione è A11-0247.
1. generazione di proteine di fusione di avidina monomerico esprimendo plasmidi
<ol><li>Sub-clonare monomerico avidina sequenza12 in plasmide pDEST17 tra i siti "CTC" e "GAA", che corrisponde a 133-134bp. (vale a dire, tra il 6-histag e il sito di ricombinazione Attr1 pDEST17) per ottenere p17-Avi. Nota: La sequenza di DNA di avidina monomerica è mostrata di seguito. Tre mutazioni introdotte nel selvaggio-tipo avidina ottenere monomerico avidina sono indicate in caratteri in grassetto. gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga</li>
	<li>Disegnare primers affiancato con AttB1 e B2 Attsiti corrispondenti a OVA polipeptide757-1035 (-Ab- e H-2_Kb-limitato epitopi) sequenza di DNA. Sono sequenze dell'iniettore: Attb1-OVA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT e Attb2-OVA GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 e Attb2 sequenze sono in grassetto).<ol>
<li>PCR-amplificare OVA polipeptide757-1035 sequenza di DNA con i primer sopra utilizzando il plasmide pUC57-OVA come modello.</li>
		<li>Duplicare i prodotti PCR in pDONR-221 attraverso una site-specific in vitro reazione di ricombinazione (ad es., BP Clonase) per ottenere pDONR-OVA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire il gene di interesse in p17-Avi usando la reazione di LR Clonase per ottenere p17-Avi-OVA. Nota: Per dettagli di clonazione di ricombinazione BP e LR, vedere il manuale del produttore.</li>
</ol>2. espressione della proteina di fusione monomerico avidina, purificazione e Refolding
<ol><li>Trasformare p17-Avi-OVA plasmide in e. coli BL21 e indurre 250 mL di e. coli BL21 cultura con IPTG (0,1 M) per 3 ore a 37 ° C.</li>
	<li>
Lisi dei batteri e corpi di inclusione solubilizzazione
	<ol>
<li>Pellet i 250 mL di indotto BL21 cultura da 30 min di centrifugazione a 4.000 x g e a 4 ° C.</li>
		<li>Raccogliere palline in 10 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidina-HCL, pH 1.5-2.5) e incubare per 15 min a 95 ° C. Incubare per una notte a temperatura ambiente in un rotatore.</li>
		<li>Centrifugare 30 min a 15.000 x g e 4 ° C e raccogliere surnatante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificare l'Avi-OVA da supernatante (frazione solubilizzata corpi di inclusione) utilizzando colonne di Ni-NTA.
	<ol>
<li>Diluire 1:2 di corpi di inclusione con tampone di lisi.</li>
		<li>Utilizzare 4 mL di resina Ni-NTA per 250 mL di cultura-derivato di corpi di inclusione.</li>
		<li>Lavare 3 volte con 10 mL di tampone di lisi (pH 7.0).</li>
		<li>Eluire con 10 mL di tampone di eluizione (lisi tampone pH 7.0 con imidazolo 250 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripiegare le proteine eluite diluendo graduale (01:10) e rapida nel Vortex in tampone Tris (pH 7,5) contenente 1 millimetro DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, arginina 500 mM e 200 mM NaCl per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>De-sale e cambio buffer riavvolgerlo proteina da tampone Tris in PBS con concentratori di proteina secondo i protocolli del produttore.</li>
	<li>Rimuovere gli aggregati mediante centrifugazione per 30 min a 3.500 x g e a 4 ° C e conservare le aliquote di proteina solubile a-20 ° C.</li>
</ol>3. biotinilazione della superficie delle cellule di BCG
<ol><li>Crescere di BCG in brodo Middlebrook 7H 9 brodo con 10% OADC (acido oleico, albumina e destrosio soluzione) e 0.05% Tween 80 a 37 ° C su una piattaforma di agitatore a 50 giri/min fino a OD = 0,5-1. Nota: BCG è un patogeno di livello 2 di biosicurezza e tutti gli esperimenti riguardanti BCG dovrebbero essere fatto in una cappa di biosicurezza con dispositivi di protezione personale.</li>
	<li>Lavare 109 BCG 3 volte con 500 µ l di PBS gratis endotossina ghiacciata più 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Sospendere a pellet BCG in gratuito PBS sterile endotossina.</li>
	<li>
Immediatamente prima dell'uso, preparare 1 mL di biotina di Sulfo-NHS SS 10 mM in acqua filtrata sterile.
	<ol>
<li>Incubare i batteri con 1 mL di 0.5 mM di biotina Sulfo-NHS SS a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavare con etichettati batteri 3 volte con 500 µ l di PBST freddo ghiacciato per rimuovere non reagiti biotinylation reagente.
	<ol>
<li>Risospendere il pellet in 1 mL di PBST.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Per valutare l'efficienza biotinylation, macchia 108 biotinilati BCG con Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µ l) a temperatura ambiente per 20 min.
	<ol>
<li>Incubare i batteri macchiati in 1 mL di 2% PFA per 20 min a temperatura ambiente e quindi esaminare i livelli di biotinilazione dall'analisi di citometria a flusso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. fenotipo di Biotinylated micobatteri: crescita e sopravvivenza
<ol><li>
Coltivare ceppi di BCG in brodo Middlebrook 7H 9 brodo con 10% OADC (acido oleico, albumina e destrosio soluzione) e 0.05% Tween 80 a 37 ° C su una piattaforma di agitatore a 50 giri/min.
	<ol>
<li>Registrare la densità ottica (OD600) della coltura batterica per un periodo di 8 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilizzare BCG-Luc (precedentemente descritto9) per rilevare la sopravvivenza dei batteri in macrofagi.
	<ol>
<li>Infettare le cellule RAW 264.7 con biotinilati BCG-Luc (MOI 10:1) o non trattata di BCG-Luc (controllo) e incubate a 37 ° C sopra un 48h periodo di tempo.</li>
		<li>Lavare monostrati di cellule umane e quindi lisare con 0.025% SDS per rilasciare batteri ingeriti.</li>
		<li>Misurare la produzione di bioluminescenza con sistema di analisi di Luciferase e luminometro. Nota: Il segnale di luminescenza è indicativo della vitalità batterica. Fare riferimento al manuale del produttore per ulteriori informazioni di analisi di luciferase.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. associazione di proteina monomerica avidina-Fusion biotinilati BCG superficie
<ol><li>Mix 5 x 108 biotinilati BCG con Avi-proteina (finale di 10 μg/mL in PBS-T) per 1 h a temperatura ambiente su piattaforma shaker.</li>
	<li>Batteri di lavare 3 volte con 500 µ l di PBST freddo ghiacciato e macchia con anticorpo di coniglio anti-avidina (Ab) (diluizione 1: 100, precedentemente descritti10) per 20 min a temperatura ambiente e poi con FITC Coniugato anti-coniglio di capra Ab IgG nelle stesse condizioni.</li>
	<li>Lavare i batteri 3 volte con 500 µ l di PBST e analizzare mediante citometria a flusso per valutare l'entità della decorazione di superficie.</li>
</ol>6. liofilizzazione di micobatteri
<ol><li>Biotinylate batteri secondo passo 3.1-3.4 e cappotto biotinilati batteri con Avi-OVA secondo punto 5.1.</li>
	<li>Aliquota biotinilato e rivestite con batteri (108), lavate con PBS e risospendere in media di liofilizzazione di 0,5 mL (mezzo Sauton 25% e 75% H2O 1,5% Na-glutammato).</li>
	<li>Trasferire i batteri a fiale di vetro e congelare in un congelatore a-80 ° C durante la notte.</li>
	<li>Lyophilize fiale di vetro riempito e congelato per 24 ore utilizzando un essiccatore di congelamento.</li>
	<li>Conservare i campioni essiccati a temperatura ambiente e ricostituire in PBS quando necessario.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.5 per valutare biotinylation e rivestimento stabilità superficiale.</li>
</ol>7. test di fagocitosi
<ol><li>Crescere 264.7 celle grezze del macrofago in piastre di coltura di diametro di 10 cm in DMEM Media contenente 5% FCS, 1% di L-Glutammina, HEPES, gli aminoacidi non essenziali e penicillina e streptomicina fino al confluency di 70-80%.</li>
	<li>2 x 106 RAW 264.7 cellule macrofagiche in una piastra a 6 pozzetti del seme. Consentire alle cellule di aderire durante la notte a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Generare DsRed BCG (precedentemente descritto9) decorate con Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) secondo una gradualità 3.1-3.4 e 5.1.</li>
	<li>Infettare cellule RAW con DsRed BCG-Avi-OVA o non trattata DsRed BCG a MOI 20:1 per 24 h a 37 ° C.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte e tripsinizzano con 1 mL di tripsina 0,25% a 37 ° C per 10 min per rimuovere batteri parzialmente disconnesso.</li>
	<li>Difficoltà nel 2,5% PFA in PBS per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare 3 volte con PBS e analizzare tramite flusso cytometry.</li>
</ol>8. intracellulare di ovuli decorato biotinilati BCG in macrofagi
<ol><li>
Microscopia a fluorescenza
	<ol>
<li>3 x 105 RAW 264.7 cellule macrofagiche sulle lamelle in una piastra a 24 pozzetti del seme. Consentire alle cellule di aderire durante la notte a 37 ° C e 5% CO2.</li>
		<li>Infettare cellule del macrofago con micobatteri (MOI 10:1) nei mezzi di manutenzione senza antibiotici a 37 ° C e 5% CO2 per 4-24 h.</li>
		<li>Lavare le cellule e tripsinizzano per rimuovere i batteri dalla superficie allegati, non ingerito come al punto 7.5.</li>
		<li>Correzione infettato cellule nel 2,5% PFA in PBS per 20 min a temperatura ambiente seguito da 3 lavaggi con PBS.</li>
		<li>Permeabilize le cellule nel buffer blocco/permeabilizzazione (0,1% Triton X-100, 3% BSA in PBS) per 20 min a temperatura ambiente.<ol>
<li>Anticorpo specifico uso di interesse (ad es., coniglio Ab anti-avidina) a 10 μg/mL in permeabilizzazione buffer per 20 min a temperatura ambiente seguito da anticorpo secondario (ad es., FITC-goat anti-rabbit IgG) per 20 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lavare le cellule 3 volte con PBS, una volta con acqua e montare su diapositive in 10 μL di mezzo di montaggio acquoso per minimizzare la fluorescenza photobleaching.</li>
		<li>Esaminare i vetrini al microscopio confocale digitale utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato x 63 / 1.4 obiettivo piano-apocromatico. Registrare le immagini utilizzando una fotocamera digitale accoppiato al software di microscopio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunogold macchiatura e microscopia elettronica
	<ol>
<li>2 x 106 RAW 264.7 cellule macrofagiche in piastre da 6 pozzetti del seme.</li>
		<li>Difficoltà macrofagi infettati BCG con 4% PFA per 4 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare campioni due volte con PBS.</li>
		<li>Incorporare i campioni nel 4% basso punto di fusione dell'agarosi e disidratare in etanolo al 70%.</li>
		<li>Trasferire campioni di resina acrilica e polimerizzare a 50 ° C.</li>
		<li>Tagliare 60 sezioni nm con un microtomo e raccogliere le sezioni sulle griglie di nichel.</li>
		<li>Etichettare i campioni con l'anticorpo di avidina 10 μg/mL per 1 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la notte nella soluzione di incubazione (PBS e 0.1% BSA) e poi lavare con incubazione soluzione coniugato oro f2 di ultra-piccolo goat-anti-rabbit IgG (1/20) per 1 h a camera temperatura nella soluzione di incubazione.</li>
		<li>Sezioni di lavare in acqua distillata, macchia in glutaraldeide al 2%, lavare di nuovo, lasciare asciugare all'aria ed esaminare con microscopio elettronico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. animale immunizzazione ed elaborazione dell'organo
Nota: Tutti i passaggi dovrebbero essere fatto in una cappa di biosicurezza.
<ol><li>Pass biotinilato e proteina rivestito batteri attraverso 271/2G ago 10 volte per rendere sospensione unicellulare.</li>
	<li>
Prendere 1 x 106 batteri in 100 μL di PBS privo di endotossina e immunizzare un topi C57BL/6 femminili (-A,b, H - 2Kb, 5-6 settimana vecchia) per via sottocutanea nella collottola del collo.
	<ol>
<li>Iniettare topi di controllo con 100 μL di PBS da solo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eutanasia topi immunizzati 20 giorni post-immunizzazione per inalazione di CO2 seguita da dislocazione cervicale.
	<ol>
<li>Isolare la milza e trasferirlo nel supporto di RPMI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Poltiglia della milza attraverso un colino di cella di 70 µm con un pistone della siringa 5 mL.
	<ol>
<li>Lavare con 5 mL di RPMI. Centrifuga (800 x g, 3 min) per isolare una sospensione unicellulare.</li>
		<li>Impoveriscono RBC con kit di selezione positiva di biotina mouse con biotina-Ter119/degli eritrociti cellule Ab.</li>
		<li>Centrifuga e risospendere le cellule in 10 mL di RPMI completo (10% FCS, 1% L-Glutammina, penicillina 1%, 1% streptomicina e 50 μM 2-ME).</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. I-Ab tetramero macchiatura per determinare le frequenze di antigene-specifici CD4+ le cellule di T e Cytokine colorazione intracellulare per determinare le frequenze di antigene-specifiche T cellule rilasciando citochine in animali immunizzati
<ol><li>
Tetramero di colorazione
	<ol>
<li>Macchia splenocytes dai topi immunizzati (~ 20 x 106 cellule) con PE-coniugato-Abe controllo-tetrameri di323-339 OVA (diluizione 1/12,5) per 1 h a 37 ° C nel buffer di associazione (PBS con FCS 2% e 0,1% di NaN3).</li>
		<li>Aggiungere AF647 CD4 Ab (01:25) e 7-AAD (per rilevare le cellule morte) gli splenocytes per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Analizzare i campioni mediante citometria a flusso.</li>
		<li>Acquisire 500.000 eventi della regione per determinare la frequenza di eventi positivi tetramero positiva CD4. Nota: Totale splenocytes sono definiti dalla macchia del puntino SSC/FSC, cellule vive dall'esclusione degli eventi positivi 7-AAD e sottoinsiemi di CD4 di gating AF647 eventi positivi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Frequenza di antigene specifico intracellulare Cytokine rilascio di cellule T
	<ol>
<li>Trasferimento di circa 1 × 107 splenocytes in 4 mL di terreno RPMI completo in sei pozzetti con o senza OVA ricombinante (10 µ g/mL) e incubare per 16 h.</li>
		<li>Curare le cellule con brefeldina A (1:1, 000) per altre 5 h.</li>
		<li>Lavaggio con PBS e soggette a intracellulare cytokine colorazione come segue:<ol>
<li>Macchia di campioni di cellule con PE-CD8 o PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 in buffer obbligatorio) a temperatura ambiente per 30 min.</li>
			<li>Difficoltà nel 4% PFA a temperatura ambiente per 20 min.</li>
			<li>Permeabilize utilizzando soluzione di permeabilizzazione, secondo le istruzioni del produttore.</li>
			<li>Lavare le cellule ed etichetta con AF647-coniugato IFN-γ Ab (01:50) per 20 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Lavare le cellule e soggetto a analisi di citometria a flusso, come descritto in precedenza.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo segnalato in questo studio un approccio non-genetica per visualizzazione rapida ed efficace delle proteine esogene sulla superficie di BCG per aggiungere gli antigeni specifici o specifiche proprietà funzionali dovuto migliorare in modo efficiente l'immunogenicità del batterio. Abbiamo dimostrato che la superficie della cellula di BCG potrebbe essere facilmente biotinilato per decorazione di superficie istantanea con proteine di fusione di avidina. La procedura totale può essere eseguita entro 2 h, mentre la tras...

Sono state proposte varie strategie per sostituire l'attuale vaccino BCG, inclusi sistemi proteici adiuvante, tecnologie basato su vettori virali, ceppi di M.tb vivo attenuati e geneticamente ceppi di BCG, sia per introdurre geni di TB che iper-esprimono gli antigeni di BCG che non sono sufficientemente espressi durante infezione1 o Mtb-antigeni specifici non presentano in BCG2. Ingegneria genetica, tuttavia, affronta molte barriere tra cui l'incerto livello di sicurezza, il processo che richiede tempo e la bassa efficienza di vettori di espressione4,5. Per quanto riguarda il miglioramento BCG, è necessario un approccio alternativo per migliorare immunogenicità senza la necessità di alternanze genetiche incerti.
In questo studio, presentiamo una nuova strategia per la visualizzazione di proteine ricombinanti di interesse sulla superficie della cellula di BCG che si basa sull'interazione ben noto ad alta affinità avidina con biotina. Questo approccio permette di attacco rapido e riproducibile di proteine di fusione ricombinante avidina sulla superficie di biotinylated BCG, che facilita la vaste manipolazioni di BCG per conseguire il miglioramento massimo della sua efficacia pur mantenendo la sicurezza eccellente registrare, osservato in decenni di utilizzo.
Affinità avidina biotina è estremamente alta (Kd = 10− 15 M) e una volta che formato, il complesso avidina-biotina è molto stabile e può essere interrotta solo sotto condizioni6di denaturazione. Tuttavia, per questo tipo di interazione per servire come un'alternativa di metodo di trasferimento gene, esposizione a lungo termine ma reversibile di proteine ricombinanti è richiesto. Così, abbiamo qui introdotto un avidina monomerico bassa affinità (Kd = 10− 7 M) che conduce al rilascio reversibile della proteina dalla superficie decorata BCG una volta ingeriti all'interno di cellule presentanti l'antigene. Al fine di fornire una prova di concetto, abbiamo testato questo metodo utilizzando una proteina chimerica monomerico avidina corrispondente ad un antigene di surrogato derivato da ovoalbumina (uova)7,8. I risultati hanno mostrato che la superficie della cellula di BCG può essere facilmente e rapidamente decorata con proteine di fusione di avidina monomerico e che questa associazione alla superficie di BCG è stabile e riproducibile senza variazioni rilevabili in crescita batterica e la sopravvivenza. Inoltre, abbiamo trovato che BCG decorato con avidina monomerico fuso con ovuli (AviOVA) può indurre una risposta immunitaria simile a quella indotta da BCG geneticamente che esprimono l'antigene stesso sia in vitro che in vivo. Questa tecnologia di schermo reversibile di proteine di interesse sulla superficie batterica è pertanto un efficace sostituto di gene tradizionale trasferimento approcci e può fornire una piattaforma per ulteriori applicazioni nel vaccino e ampia manipolazioni di BCG sviluppo.

<table><tbody><tr><td>Tecnologie RPMI 1640</td><td>StemCell</td> senza endotossine<td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS biotina</td><td>Thermo Fisher</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina coniugata FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>Ficoeritrina (PE)-coniugata I-Ab-OVA323-339 tetramero&nbsp;</td><td>MBL Internazionale&nbsp;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON poliistidina-Resina per purificazione Tag&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 coniugato ratto anti-topo CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>AF647 ratto anti-topo IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557735</tr><tr><td>AF647 ratto anti-topo I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>562367</tr><tr><td>PeCy7 ratto anti-topo CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>552775</tr><tr><td>PE ratto anti-topo CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>561095</tr><tr><td>AF 647 ratto anti-topo H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coniugato capra anticorpo coniglio</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 ratto anti-topo CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>Microscopia elettronica</td><td>anti-coniglio di capra coniugata in oro ultra-piccolo Scienze</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Brodo Middlebrook 7H9</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 linee cellulari di macrofagi murini</td><td>Tipo americano Collezione</td><td></td><td></td>di colture</tr><tr><td>pDEST17 plasmide&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pUC57-OVA</td><td>GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP clonasi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR clonasi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pDONR221</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>colonne Ni-NTA&nbsp;</td><td>Concentratori di proteine Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II microscopio per epifluorescenza</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD fotocamera digitale&nbsp;</td><td>Retiga EX, Microscopio elettronico QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 200kV&nbsp;</td><td>Azienda FEI</td><td>G2 200Kv&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; m Filtro cellulare Falcon</td><td>Thermo Fisher</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>Kit di selezione positiva della biotina del mouse EasyStep</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>biotina-Ter119/Cellule ertiroidi anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>kit Cytofix/Cytoperm&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di dosaggio della luciferasi Bright-Glo</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Luminometro Turner Biosystem&nbsp;</td><td>Microtomo Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6</td><td> Liofilizzatore Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Fiale in vetro boroscilicato</td><td>Wheaton</td><td> VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

espressione di antigeni esogeni nel mycobacterium bovis bcg vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tubercolosi (TB) è una malattia infettiva grave e il bacillo di M. bovis vaccino disponibile solo Calmette-Guérin (BCG) è sicuro ed efficace per la protezione contro la meningite di TB severa per bambini e alcune forme di TB diffusa, ma non riesce a proteggere contro la tubercolosi polmonare, che è la forma più diffusa della malattia. Strategie più promettenti per migliorare BCG attualmente si basano sia sulla sua trasformazione con geni codificanti immunodominanti M. tuberculosis (Mtb)-antigeni specifici e/o complementazione con geni codificanti co-fattori di che stimolerebbero l'antigene cellule presentanti. Principali limiti di questi approcci includono bassa efficienza, bassa stabilità e l'incerto livello di sicurezza dei vettori di espressione. In questo studio, presentiamo un approccio alternativo al miglioramento di vaccino, che consiste di complementazione di BCG con proteine esogene di interesse sulla superficie dei batteri, piuttosto che la trasformazione con plasmidi codifica geni corrispondenti. In primo luogo, le proteine di interesse sono espressi in fusione con avidina monomerica in standard Escherichia coli sistemi di espressione e quindi utilizzato per decorare la superficie di biotinylated BCG. Utilizzando BCG superficie decorata con antigene ovoalbumina surrogato gli esperimenti sugli animali dimostrano che il batterio modificato è completamente immunogenico e capace di indurre risposte delle cellule T specifiche. Complessivamente, i dati presentati qui fortemente sostengono un romanzo e un metodo efficiente per rimodellare l'attuale vaccino BCG che sostituisce l'approccio convenzionale laborioso di complementazione con acidi nucleici esogeni.

Con le procedure generali descritte sopra, è stata esaminata la fattibilità di BCG superficie biotinylation e decorazione con antigene surrogato OVA. L'immunogenicità del BCG modificate è stato poi testato in vivo. La superficie batterica è stato facilmente etichettata con biotina per la visualizzazione rapida di antigeni chimerico avidina senza modifiche rilevabili nei fenotipi batterici. Il BCG modificate risultante viene ingerito efficientemente dalle cellule di presentazione ...

Una nuova tecnica per la visualizzazione rapida dell'antigene su una superficie batterica è presentata, che coinvolge la superficie biotinylation seguita dall'esposizione alle proteine di interesse in fusione con avidina monomerico. Caricamento di BCG con antigeni selezionati correttamente, migliora la sua immunogenicità, suggerendo che la decorazione di superficie può sostituire tradizionali approcci genetici.

Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esprimere proteine di superficie su micobatteri utilizzando la decorazione superficiale con proteine ricombinanti come alternativa agli approcci tradizionali basati sulla genetica. Questi metodi possono aiutare a rispondere a importanti domande di ricerca nel campo della micobatteriologia, in particolare nell'area delle interazioni ospedaliere e dello sviluppo di vaccini. Questa tecnica può essere utilizzata per lo screening di potenziali fattori di interferenza o antigeni candidati.Può essere rapidamente paragonato agli approcci tradizionali basati sulla genetica, meticolosi e dispendiosi in termini di tempo. A dimostrare questa procedura sarà Amina Talal, un'assistente di ricerca nel mio laboratorio. Questa parte del protocollo inizia con la trasformazione del plasmide OVA P17 Aviden in E.Coli BL21.Per fare ciò, indurre 250 millilitri di coltura di E.Coli BL21 con IPTG per tre ore a 37 gradi Celsius. Dopo tre ore, lisare i batteri per solubilizzare i corpi inclusi pellettando prima la coltura BL21 indotta e scartando il surnatante. Quindi risospendere il pellet in 10 millilitri di tampone di lisi e lasciare che le cellule venga

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Abbiamo descritto un approccio alternativo alla enumerazione dei...

Un test funzionale di sangue intero per misurare la vitalità dei micobatteri, utilizzando Reporter-Gene Tagged BCG o M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Questo video dimostra l'induzione di un'infiammazione sistemica in un topo anestetizzato. L'iniezione di depositi adiuvanti di antigene micobatterico innesca il rilascio di citochine e l'infiammazione localizzata. I vasi linfatici si aprono, consentendo l'ingresso delle cellule immunitarie nei linfonodi e l'attivazione delle cellule T, che rilasciano citochine pro-infiammatorie, portando a un'infiammazione diffusa.

Iniezione sottocutanea di antigene batterico per indurre infiammazione sistemica in un modello murino

Questo video dimostra la preparazione e la quantificazione dell'inoculo di Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux utilizzando il saggio di bioluminescenza e l'enumerazione delle unità formanti colonie. L'inoculo preparato può essere utilizzato per studi sulle infezioni.

Preparazione e quantificazione dell'inoculo di Mycobacterium bovis BCG lux per l'infezione

Questo video mostra un metodo per generare vaccini multivalenti con vescicole di membrana esterna (OMV). Le cellule di mammifero vengono trasfettate per esprimere e secernere antigeni virali fusi a uno SpyTag e a un tag di poliistidina. Questi antigeni vengono quindi purificati utilizzando una colonna di affinità per acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA). L'antigene purificato viene miscelato con vescicole della membrana esterna che esprimono la proteina SpyCatcher (SC) legata alla superficie.

Generazione di un vaccino multivalente con vescicole della membrana esterna

Il video mostra una tecnica per caricare antigeni su Mycobacterium bovis BCG per migliorare le sue proprietà immunogeniche. Il metodo utilizza il sistema avidina-biotina per rivestire la superficie batterica con antigeni esogeni.

Una tecnica di coniugazione avidina-biotina per la presentazione di antigeni bersaglio su Mycobacterium bovis BCG

A lungo termine colta interferone-γ enzimatico test immunospot viene usato come misura di risposte di memoria centrale e correla con le risposte vaccino anti-micobatteri protettivi. Con questo test, le cellule mononucleari del sangue periferico sono stimolati con antigeni micobatterici e interleuchina-2 per 14 giorni, differenziazione e consentendo l'espansione delle cellule T di memoria centrale.

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Descriviamo in dettaglio la metodologia seguita per confrontare l'efficacia protettiva e la risposta immunitaria polmonare indotta dall'immunizzazione intranasale e sottocutanea con BCG nel modello murino. I nostri risultati mostrano i benefici della vaccinazione polmonare e suggeriscono un ruolo della risposta mediata da IL17 nella protezione indotta dal vaccino.

L&#39;efficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale BCG Amministrazione nei topi

Il presente protocollo descrive la bioingegneria delle vescicole della membrana esterna come una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display", compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.

Una piattaforma di vaccino a nanoparticelle "plug-and-display" basata su vescicole di membrana esterne che mostrano il dominio di legame del recettore SARS-CoV-2

Questo protocollo descrive in dettaglio l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche native (mEV) da colture axeniche di Mycobacterium smegmatis (Msm) e come possono essere progettate e arricchite le MsmEV ricombinanti contenenti mCherry (un reporter fluorescente rosso). Infine, verifica il nuovo approccio con l'arricchimento di MsmEVs contenenti la proteina EsxA di Mycobacterium tuberculosis.

Arricchimento di vescicole extracellulari native e ricombinanti di micobatteri

Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l'encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l'epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) 35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.

Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

La determinazione delle unità formanti colonie (CFU) è la tecnica gold standard per quantificare i batteri, tra cui il Mycobacterium tuberculosis che può richiedere settimane per formare colonie visibili. Qui descriviamo un micro-CFU per la determinazione di CFU con una maggiore efficienza temporale, una riduzione dello spazio di laboratorio e del costo dei reagenti e la scalabilità per esperimenti a media e alta produttività.

Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi

Scopri la decorazione superficiale di Mycobacterium bovis BCG con proteine ricombinanti avidina-biotina. Questa tecnica rapida migliora l'immunogenicità del vaccino e offre un'alternativa efficace ai metodi genetici tradizionali per lo sviluppo di vaccini.

Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina (Video) | JoVE Journal

Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

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