Name: Determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri come monitorare i tassi di decadimento dei trascritti in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti. Questo metodo permette di distinguere tra abbondanza e stabilità degli RNA, offrendo nuove prospettive sulla regolazione dell'espressione genica.

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HAC fu lo studioso di Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni per HAC dal National Institute of General Medical Sciences centro della sovvenzione di eccellenza GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 ad agosto David, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Istituto nazionale di scienze mediche generali R01 GM0866465, Eli &#38; Edythe Broad centro di medicina rigenerativa &#38; ricerca sulle cellule staminali, centro salute/UCLA CTSI NIH delle donne Iris Cantor Grant UL1TR000124 e alla Leukemia Lymphoma Society. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institute del National Institutes of Health, sotto Premio numero P50CA092131. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. HAC è un membro della Eli &#38; Edythe Broad centro di medicina rigenerativa &#38; Stem Cell Research, l'Istituto di biologia molecolare di UCLA e il programma interdipartimentale di bioinformatica di UCLA.

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati da Institutional Review Boards presso la Princeton University e la University of California, Los Angeles.
1. preparare fibroblasti proliferanti e contatto-inibito ActD tempo corso
Nota: Questo protocollo utilizza un timecourse con quattro punti temporali. Tre campioni biologicamente indipendenti possono essere raccolti al timepoint raccogliendo le piastre di coltura di tessuti diversi in un esperimento, o l'esperimento può essere ripetuto più volte con diverse culture di cellule. Nella nostra esperienza, un piatto di coltura del tessuto di 10 cm (diametro) (una piastra) fornisce sufficiente RNA per l'analisi. Se necessario, più piatti di coltura del tessuto possono essere pool per ogni campione aumentare il numero delle cellule presso ogni timepoint. Inoltre, lo stesso esperimento può essere eseguito con fibroblasti isolati da diversi individui come replica biologico veramente indipendente.
<ol>
	<li>Stabilire proliferanti e quiescenti culture di cellule per l'analisi di decadimento di trascrizione. Per le cellule di proliferazione, dividere le celle ogni tre giorni mentre le cellule di contatto-inibito stanno diventando contatto-inibita.
	<ol>
		<li>Per le cellule di contatto-inibito, cambiare il mezzo ogni 2 giorni per 7 giorni. Dividere le cellule proliferanti 2 giorni prima che i fibroblasti hanno inibito contatto sono pronti per il ritiro. Nella Figura 1è riportato un esempio di un sistema di coltura cellulare. I passaggi rimanenti in questa sezione forniscono un protocollo dettagliato per stabilire e spaccare le cellule.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Isolare i fibroblasti cutanei primari da neonatale pelle secondo protocolli stabiliti13. Fibroblasti di passaggio per garantire una popolazione omogenea. Nota: I fibroblasti possono essere congelati e scongelati, se necessario.</li>
	<li>Scongelare o replate fibroblasti, se necessario. Crescere i fibroblasti in DMEM con 10% siero in condizioni sterili in una coltura tissutale incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Utilizzare fibroblasti che sono state coltivate per meno di 10 passaggi. Fibroblasti dovrebbero essere &#60; 80% confluenti il giorno della scissione alle cellule di produrre popolazioni proliferanti e quiescenti.</li>
	<li>Per dividere una piastra di coltura del tessuto in piastre multiple, preriscaldare PBS, tripsina e mezzo con siero in bagnomaria a 37 ° C per 20 min.</li>
	<li>Aspirare o utilizzare una pipetta per rimuovere il mezzo da ciascuna piastra di coltura del tessuto con le cellule per essere replated.</li>
	<li>Dispensare caldo PBS su ogni piatto (10 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 5 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6) e 1 mL per un pozzetto di una piastra ben 12.</li>
	<li>Aspirato o una pipetta per rimuovere PBS da ciascuna piastra di coltura del tessuto.</li>
	<li>Delicatamente dispensare 1 x tripsina-EDTA su ogni piatto (8 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 3 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6 e 1 mL per un pozzetto di una piastra ben 12). Nota: Fare 1 x tripsina-EDTA diluendo sterile 10 x tripsina-EDTA in PBS sterile. La soluzione finale 1 x dovrebbe essere 0.05% tripsina e 0,02% EDTA.</li>
	<li>Incubare la tripsina con le cellule per 5 min.</li>
	<li>Picchiettare delicatamente la piastra per sloggiare le cellule dalla piastra.</li>
	<li>Pipetta per risospendere le cellule in sospensione unicellulare.</li>
	<li>Trasferire le cellule in soluzione di tripsina in una provetta conica contenente lo stesso volume di DMEM con 10% siero (8 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 3 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6 e 1 mL per un pozzo di un 12 ben piatto).</li>
	<li>Rotazione verso il basso le cellule a 4 ° C per 5 minuti a 1.000 x g per rimuovere tripsina.</li>
	<li>Risospendere le cellule in un volume adeguato di medie e totali con un emocitometro per calcolare la concentrazione cellulare.</li>
	<li>Seme 5x105 per piastra di coltura del tessuto di 100 mm per la proliferazione e ha inibito contatto cellule.</li>
	<li>Utilizzando questo metodo, stabilire i campioni proliferanti e inibito di contatto necessari per l'analisi (Figura 1).</li>
</ol>
2. ActD tempo corso
<ol>
	<li>Risospendere ActD in stock concentrazione di 1 mg/mL (per 1 mg di ActD, uso 950 µ l di PBS sterile e 50 µ l di DMSO sterile). Nota: Soluzioni di riserva congelati di ActD dovrebbero essere stabile per un mese a-20 ° C. Soluzioni diluite dovrebbero essere scartati e non memorizzati per un ulteriore uso.</li>
	<li>Aggiungere ActD il volume appropriato di mezzo preriscaldata per tutta la cultura biologica delle cellule replica piastre che per circa 0, 120, 240 e 480 min punti temporali (Figura 2). Aggiungere ActD ad una concentrazione di 15 µ g / mL di terreno. Mescolare bene, aspirate fuori il vecchio mezzo e aggiungere il terreno ActD-contenente le celle.
	<ol>
		<li>Per un 1 mg/mL di brodo, aggiungere 15 µ l ActD per ogni mL di terreno, ad esempio, per 10 mL di terreno per un piatto di 100 mm, aggiungere 150 µ l ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per raccogliere il campione di timepoint zero, delicatamente aspirate fuori ActD medio e dispensare preriscaldata PBS sulle celle. Pipettare 10 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 5 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6 e 1 mL per un pozzetto di una piastra ben 12.</li>
	<li>Aspirare delicatamente o una pipetta il PBS. Nota: Tutti i passaggi che comportano isolamento del RNA devono essere eseguiti con acqua RNAsi-libera, RNAsi-libera per microcentrifuga e pipette RNAsi-libera. Guanti devono essere indossati e cambiati frequentemente quando si lavora con RNA.</li>
	<li>Aggiungere soluzione di fenolo-guanidina isotiocianato (1 mL/10 cm piastra con 4 x 105 a 4 x 107 cellule) direttamente alla piastra di coltura del tessuto. Nota: Fenolo-guanidina isotiocianato soluzione è una soluzione monofasica che mantiene la qualità di RNA durante la lisi di cellule e che separa il RNA, DNA e proteine da altro. Attenzione: Fenolo e guanidina isotiocianato sono corrosivi. Utilizzare una protezione appropriata.</li>
	<li>Miscela a dispensare il fenolo-guanidina isotiocianato soluzione-cella su e giù più volte per ottenere un impasto omogeneo. Nota: Fenolo-guanidina isotiocianato soluzione lisato può essere conservata a 4 ° C durante la notte o a-20 ° C per fino a un anno.</li>
	<li>Raccogliere ogni punto di tempo dopo la giusta quantità di tempo è passato usando il metodo descritto in passaggi 2.3-2.6.</li>
</ol>
3. isolamento di RNA totale da fenolo-guanidina isotiocianato soluzione lisato
<ol>
	<li>Incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 min garantire la completa dissoluzione dei complessi RNA-proteina. Nota: Se non specificato diversamente, i passaggi del protocollo fenolo-guanidina isotiocianato soluzione possono essere eseguiti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Introdurre le trascrizioni di spike-a controllo che possono essere rilevate con la metodologia utilizzata.</li></ol>Introdurre questi controlli in ogni campione a una quantità nota e concentrazione. Nota: L'esterno RNA controllo Consorzio (ERCC) spike-in controllo mix14 è stato specificamente progettato come un controllo di spike per RNA-seq. Può essere utilizzato anche per le macchie nordiche o qPCR in tempo reale. Spike-in controlli progettati specificamente per le tecnologie di microarray sono anche disponibili (Vedi Tabella materiali).
	<li>Trasferire la miscela di soluzione di fenolo-guanidina isotiocianato ad un tubo del microcentrifuge 2,0 mL con una pipetta. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio per la miscela di soluzione fenolo-guanidina isotiocianato per ogni 1 mL di soluzione di fenolo-guanidina isotiocianato utilizzata (ad esempio, aggiungere 0,3 mL di cloroformio per 1,5 mL fenolo-guanidina isotiocianato soluzione miscela).</li>
	<li>Agitare il tubo del microcentrifuge vigorosamente per 15 s e poi incubare fenolo-cloroformio-guanidina isotiocianato miscela a temperatura ambiente per 3 min.</li>
	<li>Spin di campioni a 12.000 x g per 20 minuti a 4 ° C. Nota: Dopo la rotazione iniziale, il campione dovrebbe separare in 3 strati - un strato organico rosso presso il fondo, un interfase bianco/rosa nel mezzo e uno strato acquoso limpida in alto a sinistra (Figura 3).</li>
	<li>Trasferire lo strato acquoso ad un nuovo tubo del microcentrifuge 2,0 mL utilizzando una micropipetta. Nota: Fare attenzione a non disturbare l'interfase durante questo processo. Va bene a lasciare alcuni della frazione acquosa. È meglio lasciare alcuni della frazione acquosa che includendo anche alcuni degli strati interfase, come comprendente l'interfase strato sarebbe contaminare il RNA con il DNA. Lo strato acquoso sarà circa la metà del volume iniziale, così circa 0,9 mL se la miscela di soluzione/cloroformio fenolo-guanidina isotiocianato era 1,8 mL.</li>
	<li>Eliminare l'interfase e frazioni organiche.</li>
	<li>Aggiungere un volume equivalente di 2-propanolo per la frazione acquosa e capovolgere la provetta 10 volte. Aggiungere fino a 1 µ l di 20 mg/mL di soluzione acquosa di glicogeno a 20 µ l di campione, soprattutto se il rendimento dovrebbe essere basso perché meno di 106 cellule sono stati raccolti. Nota: Questo si tradurrà in un pellet denso, tinta che è facile da monitorare dopo la procedura di selezione che seguono.</li>
	<li>Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min.</li>
	<li>Spin di campioni a 12.000 x g per 20 minuti a 4 ° C. Garantire che, alla fine di questo giro, il RNA ha precipitato per formare una pallina bianca nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Con una pipetta, rimuovere e scartare il surnatante prestando particolare cura per non disturbare il pellet di RNA bianco. Nota: Un suggerimento di dispensare sciolto tenuto in mano può essere utilizzato per eliminare l'etanolo in eccesso. Se la pallina del RNA è disturbata, ma non eliminata, lo sperimentatore può ripetere lo spin e rimuovere il surnatante nuovamente. Evitare scartando il pellet come questo richiederà l'investigatore a ripetere l'intera procedura.</li>
	<li>Preparare una soluzione di acqua esente da nucleasi etanolo e 25% 75%. Aggiungere 1 mL di etanolo al 75% a 1 mL di fenolo-guanidina isotiocianato soluzione reagente a lavare la pallina.</li>
	<li>Spin di campioni a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Dopo aver rimosso la maggior parte del surnatante, utilizzare una pipetta per rimuovere quanto più etanolo come possibile, mentre ancora avendo cura di non disturbare il pellet. Nota: La pallina del RNA è meno compatta in questa fase e tende a spostarsi. Fate molta attenzione quando si maneggia il pellet a questo punto per evitare di perdere il RNA.</li>
	<li>Girare i campioni 12.000 x g per 2 min a temperatura ambiente a pellet tutti etanolo in eccesso.</li>
	<li>Rimuovere tutti i etanolo in eccesso dalla provetta utilizzando una micropipetta avendo cura di non disturbare il pellet.</li>
	<li>Lasciare asciugare per 5 min l'aria di pellet di RNA.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di acqua priva di nucleasi alla pallina del RNA e risospendere il pellet in acqua privo di nucleasi.</li>
	<li>Trattare i campioni con 1 µ l della dnasi (2 unità / µ l) per rimuovere il DNA e quindi inattivare DNasi e cationi (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Conservare i campioni di RNA in microcentrifuga 2,0 mL a-80 ° C.</li>

4. analisi dell'abbondanza di trascrizione
<ol>
	<li>Quantificare il RNA e verifica RNA per purezza utilizzando uno spettrofotometro. Nota: Il rapporto di assorbanza a 260 nm a 280 nm dovrebbe essere circa 2.0 per RNA.</li>
	<li>Analisi del RNA con un gel di agarosio all'1% o un'equivalente tecnologia per visualizzare la misura della degradazione. Nota: Due chiari bande che rappresentano 18S e 28S rRNA dovrebbe essere chiaramente visibile (Figura 4). Se queste bande non sono visibili, il RNA potrebbe essere compromesse. Difficoltà tiro suggerimenti per degradazione del RNA sono forniti nella discussione.</li>
	<li>Abbondanza di trascrizione di monitor nelle aliquote raccolte di RNA rispetto a spillo-in standard interno utilizzando microarrays15, RNA-Seq16, in tempo reale qPCR17, o Northern blots18.
	<ol>
		<li>Determinare l'abbondanza per ogni trascrizione in ciascun punto di tempo rispetto a un controllo a spillo-in abbondanza noto. Nota: Per i microarrays, i valori saranno intensità di fluorescenza. Per le macchie nordiche, bande sulla pellicola di raggi x possono essere quantificati. Per qPCR in tempo reale, abbondanza di trascrizione può essere determinato dal confronto con standard noti con il 2- σσCT metodo19. Per RNA-Seq, valori normalizzati possono essere determinati come FPKM o frammenti per kilobase dell'essone per milione letture mappato. Per i tassi di decadimento isoforma-specifici, RNA-Seq dati possono essere analizzati utilizzando metodologie isoforma-consapevole come DEXSeq20. I tassi di decadimento isoforma-specifici sono meglio determinati con RNA-seq. Se sono da determinarsi con dati di microarray, quindi i dati devono essere analizzati su una base di sonda, piuttosto che una base di gene di gene. L'analista deve essere attento quando si interpretano le informazioni da un numero limitato di sonde. Per esempio, ci possono essere 5 o meno sonde che sono ben informative su una particolare isoforma. In questo caso, l'analista sarà necessario determinare se il comportamento di queste sonde è sufficientemente coerenza in modo che i risultati sono affidabili.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eseguire in tempo reale qPCR il RNA isolato17 in campioni raccolti per analizzare i geni rapidamente decadente, come c-Myc e un gene lentamente decadente come GAPDH, conquistare la fiducia quello deperimento di trascrizione tariffe sono state rilevate con precisione. Nota: Per ulteriore conferma, isoforma-specifici in tempo reale qPCR sonde possono essere sviluppati e utilizzati per monitorare l'abbondanza di isoforme specifiche nel tempo21.</li>
</ol>
5.Determinazione costante del tasso di decadimento
<ol>
	<li>Per ogni timepoint, registro-trasformare i valori di abbondanza per ogni trascrizione (gene-specifico o isoforma-specifici). Nota: Log-trasformando i valori convertirà curve di decadimento esponenziale alle linee che possono essere in forma con un decadimento lineare modello22.</li>
	<li>Misura il profilo di espressione per ogni trascrizione (gene-specifico o isoforma-specifici) per un modello di decadimento lineare. La formula di tale modello è f (t) = C - r * t. In questa equazione, C è una costante che rappresenta l'importo di partenza di una trascrizione, r è il tasso di declino e t è il tempo dall'inizio dell'esperimento. Da questa equazione, determinare il tasso di decadimento come r*ln(10) (Vedi riferimento11). Nota: Il pacchetto di software di maSigPro è un approccio basato su regressione progettato per rilevare differenze di profilo di espressione gene significativo nel tempo corso dati23. Codice di esempio e i risultati per maSigPro sono disponibili presso: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>Filtrare i geni che non riescono a montare un modello log-lineare decadimento. Questa operazione può essere eseguita con un test ANOVA F. Nota: il test F si basa sulla statistica F, che è definita come la variazione tra campioni si intende diviso per la variazione all'interno di campioni. Correggere i valori di p per i confronti multipli applicando il lineare step-up Benjamini e Hochberg falsi scoperta procedura24. Un q-valore maggiore di 0,05 con il F-test può essere utilizzato come un cut-off per i geni che non riescono a montare un modello log-lineare decadimento.</li>
	<li>Eseguire un test ANOVA F per determinare le trascrizioni con un termine di interazione significativa tra una condizione di ciclo cellulare categorico e tempo (tasso di falsi scoperta, FDR &#60; 0.05).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.

Quiescenza può essere indotta da segnali esterni, tra cui il ritiro di mitogeni o del siero, la mancanza di adesione cellulare e l'inibizione del contatto. Inibizione da contatto, uno dei più possibili metodi per indurre la quiescenza, è un processo altamente evolutivamente conservato in cui cellule uscire il ciclo proliferativo cellulare in risposta al contatto della cellula--cellula. Qui ci concentriamo sulla inibizione da contatto come un esempio di un metodo per indurre la quiescenza. Gli studi precedenti hanno segna...

Livelli allo stato stazionario di trascrizioni riflettono il contributo di sintesi di trascrizione e di decadimento di trascrizione. Regolato e coordinato trascrizione decadimento è un importante meccanismo per il controllo dei processi biologici1,2,3,4. Ad esempio, tassi di decadimento di trascrizione hanno dimostrati di contribuire per la serie temporale di eventi che seguono l'attivazione dalla citochina infiammatoria fattore di necrosi tumorale5.
Precedentemente abbiamo indicato che la transizione tra proliferazione e quiescenza in fibroblasti umani primari è associata con i cambiamenti dei livelli di trascrizione di molti geni6. Alcuni di questi cambiamenti riflettono le differenze nell'attività dei fattori di trascrizione tra questi due Stati.
Cambiamenti nel tasso di decadimento di una trascrizione possono anche contribuire ai cambiamenti del livello di espressione di un trascritto in due diversi stati7,8. Basato sui nostri risultati precedenti che la transizione tra proliferazione e quiescenza è associata con i cambiamenti nei livelli di più microRNA9, abbiamo chiesto se c'è anche un contributo dal decadimento di differenziale trascrizione nei cambiamenti espressione genica in proliferazione contro fibroblasti quiescenti.
Al fine di monitorare la stabilità di trascrizione, abbiamo determinato il tasso di decadimento delle trascrizioni genoma in proliferazione contro cellule quiescenti. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo monitorato tassi di decadimento in proliferazione contro fibroblasti quiescenti introducendo un inibitore della trascrizione nuovo e monitoraggio della frequenza in cui singole trascrizioni scomparse nel tempo. Il vantaggio di questo approccio è che, rispetto ai metodi che consentono di monitorare semplicemente espressione genica globale, inibendo la sintesi di nuova trascrizione, saremo in grado di determinare il tasso di decadimento per queste trascrizioni separatamente dal prezzo al quale sono trascritti.
ActD trattamento per inibire la trascrizione di nuovo e determinare i tassi di decadimento di trascrizione è applicato con successo in molteplici studi precedenti. ActD è stato usato per sezionare l'importanza della stabilità di RNA nei cambiamenti in abbondanza di trascrizione che derivano dal trattamento con citochine pro-infiammatorie5. Un approccio simile è stato utilizzato anche per sezionare le differenze nel tasso di decadimento di trascrizione in proliferazione contro cellule C2C12 differenziate come essi adottano un muscolo differenziato fenotipo10. Come altro esempio, global mRNA emivite inoltre sono state rilevate in pluripotenti e cellule staminali embrionali del mouse differenziato11. In questi esempi, la degradazione del mRNA ha dimostrato di essere importante per la regolazione di abbondanza di trascrizione e per la transizione delle cellule agli Stati differenti delle cellule.
Applicare i metodi descritti di seguito, abbiamo scoperto le variazioni nei tassi di decadimento di trascrizione in circa 500 geni quando si confrontano i fibroblasti proliferanti e quiescenti stati12. In particolare, abbiamo scoperto che gli obiettivi del microRNA miR-29, che è downregulated in cellule quiescenti, sono stabilizzati quando le cellule di transizione di quiescenza. Qui descriviamo la metodologia che abbiamo usato per determinare i tassi di decadimento in cellule proliferanti e quiescenti. Questa metodologia è utile per confrontare i tassi di decadimento mRNA globali in due distinti ma simili condizioni quando sono cercati informazioni rapidamente decadente geni. Potrebbe essere utilizzato anche per affrontare altre questioni, quali l'effetto delle condizioni di coltura delle cellule sul decadimento di trascrizione, per esempio, in due dimensioni contro tre culture dimensionale. Tassi di decadimento possono essere determinato genoma con metodi come microarrays o RNA-seq. in alternativa, in tempo reale qPCR o Macchiarsi nordico può essere utilizzato per determinare i tassi di decadimento su base gene di gene o isoforma di isoforma. Queste tariffe quindi possono essere utilizzate per calcolare il tempo di dimezzamento di ciascun gene monitorato e per identificare geni con i tassi di decadimento che sono diversi in due condizioni.

<table><tbody><tr><td>Centrifughe per provette per microcentrifuga in grado di raggiungere 12.000 x g e 4&deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura per l'esecuzione di gel di agarosio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre sterili per colture tissutali e provette</td><td></td><td></td><td></td>coniche</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>VWR</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili, pipettatori e puntali per pipette per colture tissutali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, puntali per pipette e provette monouso e prive di RNA confezionati singolarmente per l'isolamento e l'analisi dell'RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanti monouso da indossare quando si maneggiano reagenti e campioni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>di RNA RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Per la decontaminazione delle superfici di lavoro da provette</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>Eppendorf da RNase da 2,0 ml</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA Soluzione 10X</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-07</td><td></td></tr><tr><td>Sterile PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1410-2 mg</td><td>inibisce la trascrizione</td></tr><tr><td>Sterile DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-761-00ML</td><td>solvente per actinomicina D</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN19400225</td><td>MP Biomedicals, Inc</td></tr><tr><td>prodotto Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618500</td><td>grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td>grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Glicogeno privo di RNasi (20 mg/ml soluzione acquosa)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>vettore per la precipitazione dell'RNA</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1907</td><td>rimuove il DNA con DNasi, quindi, in una fase successiva,&nbsp; inattiva il DNA e rimuove i cationi bivalenti</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN820721</td><td>MP Biomedicals, Inc colorante</td></tr><tr><td>di caricamento per gel di RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>adatto anche per denaturare l'elettroforesi</td></tr><tr><td>Millenium RNA markers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7150</td><td>Scala RNA</td></tr><tr><td>Kit Spike-in RNA monocolore</td><td>Tecnologia Agilent</td><td>5188-5282</td><td>Esempio di controllo spike-in per l'analisi di microarray Agient</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>grado di biologia molecolare, per tampone TAE</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>per tampone TAE</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>grado di elettroforesi, per gel</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7637</td><td>per biologia molecolare</td></tr><tr><td>Consorzio per i controlli dell'RNA Mix di spine per RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4456740</td><td>Controllo spike-in per RNA Seq</td></tr><tr><td>TruSeq Kit di preparazione della libreria di mRNA a filamenti A (48 campioni, 12 indici)</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td>per RNA Seq</td></tr><tr><td>Piastra PCR a 96 pozzetti da 0,3 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0600</td><td>per qPCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Guarnizioni adesive Microseal B MSB1001</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>per qPCR in tempo reale</td></tr><tr><td>senza Rnase/Dnasi Serbatoi di reagenti</td><td>VWR</td><td>89094-662</td><td>per qPCR in tempo reale</td></tr><tr><td>senza Rnase/Dnasi Otto strisce e tappi per provette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12230</td><td>per qPCR</td></tr> <tr><td>in tempo realeSuperScript Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td>per qPCR in tempo reale</td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>per qPCR in tempo reale</td></tr></tbody></table>

determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescenza è uno stato temporaneo, reversibile, in cui le cellule hanno cessato la divisione cellulare, ma conservano la capacità di proliferare. Gli studi multipli, compreso il nostro, hanno dimostrato che la quiescenza è associato con diffuse cambiamenti nell'espressione genica. Alcuni di questi cambiamenti si verificano attraverso i cambiamenti nel livello o attività di fattori di trascrizione associati a proliferazione, come E2F e MYC. Abbiamo dimostrato che la degradazione del mRNA può anche contribuire a cambiamenti nell'espressione genica tra cellule proliferanti e quiescenti. In questo protocollo, descriviamo la procedura per stabilire la proliferazione e quiescenti colture di fibroblasti cutanei umani del prepuzio. Descriviamo quindi le procedure per l'inibizione di nuova trascrizione nelle cellule proliferanti e quiescenti con actinomicina D (ActD). ActD trattamento rappresenta un approccio semplice e riproducibile per dissociare nuova trascrizione dal decadimento di trascrizione. Uno svantaggio di ActD trattamento è che il corso di tempo deve essere limitato a un breve lasso di tempo perché ActD colpisce la vitalità cellulare. Livelli della trascrizione sono monitorati nel tempo per determinare i tassi di decadimento di trascrizione. Questa procedura permette l'identificazione di geni e isoforme che presentano decadimento differenziale in proliferazione contro fibroblasti quiescenti.

Precedentemente abbiamo riferito i risultati delle analisi di microarray dei tassi di decadimento di trascrizione in fibroblasti umani primari proliferanti e inibito a contatto sopra un corso di 8 ore tempo12. Una lista di geni con un significativo cambiamento nella stabilità di trascrizione confrontando fibroblasti proliferanti e contatto-inibito è fornita nella tabella supplementare 1. Le intensità di fluorescenza in tempo zero e sopra un corso d...

Descriviamo un protocollo per la generazione di proliferazione e fibroblasti cutanei umani primari quiescenti, monitoraggio tassi di decadimento di trascrizione e l'individuazione di geni differenzialmente decadente.

Determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare i tassi di decadimento del trascritto nei fibroblasti proliferanti e quiescenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare, come ad esempio se i cambiamenti nell'espressione genica derivano da cambiamenti nel tasso di decadimento del trascritto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce informazioni sul tasso di decadimento del trascritto, non solo sull'abbondanza del trascritto.Per iniziare il protocollo, stabilire colture proliferanti e quiescenti di fibroblasti. I fibroblasti proliferanti devono essere tripsinizzati regolarmente. Le colture quiescenti possono essere stabilite consentendo alle placche di raggiungere la confluenza con cambi regolari del mezzo.Aggiungere ActD 150 microlitri al terreno preriscaldato 10 millilitri per tutte le piastre di coltura cellulare replicate biologiche. Aggiungere ActD a una concentrazione di 15 microgrammi per millilitro di terreno. Mescola bene la soluzione.Aspirare il vecchio terreno e aggiungere alle cellule un terreno contenente ActD. Per raccogliere il campione del punto di tempo zero, aspirare delicatamente il terreno ActD e pipettare tra cinque e 10 millilitri di PBS preriscaldato su una piastra da 100 millimetri, cinque millilitri di soluzione per una piastra da 100 millimetri, due millilitri per un pozzetto di una piastra a sei pozzetti e un millilitro per un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Aspirare delicatamente il PBS.Quindi aggiungere la soluzione di isotiocianato di fenolo-guanidina direttamente alla piastra di coltura tissutale. Pipettare più volte la miscela di cellule della soluzione di isotiocianato fenolo-guanidina su e giù per ottenere una miscela omogenea. Raccogli ogni punto temporale dopo che è trascorso il periodo di tempo appropriato, utilizzando il metodo descritto in precedenza.Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti per garantire la completa dissoluzione dei complessi proteici dell'RNA. Successivamente, introdurre le trascrizioni controllate con spike-in che possono essere rilevate con la metodologia utilizzata. Introdurre questi controlli in ciascun campione a una quantità e concentrazione note.Utilizzando una pipetta, trasferire la miscela di soluzione di isotiocianato di fenilguanidina in una provetta da microcentrifuga da 2,0 millilitri. Quindi aggiungere 0,2 millilitri di cloroformio alla miscela di soluzione di isotiocianato di fenilguanidina per ogni millilitro di soluzione di isotiocianato di fenilguanidina utilizzata. Agitare energicamente la provetta da microcentrifuga per 15 secondi e quindi incubare l'isotiocianato di fenilguanidina cloroformio.Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 12.000 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Il campione deve essere separato in tre strati. Trasferire lo strato acquoso in una nuova provetta da microcentrifuga da 2,0 millilitri utilizzando una micropipetta e fare attenzione a non disturbare l'interfase durante questo processo.Scartare l'interfase e le frazioni organiche. Quindi aggiungere un volume uguale di 2-propanolo alla frazione acquosa e capovolgere la provetta 10 volte. Aggiungere fino a un microlitro di 20 milligrammi per millilitro di glicogeno acquoso per 20 microlitri di campione, soprattutto se si prevede che la resa sia bassa.Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni. Assicurarsi che alla fine della rotazione, l'RNA sia precipitato per formare un pallino sul fondo del tubo.Con una pipetta, rimuovere ed eliminare il surnatante, prestando particolare attenzione a non disturbare il pellet di RNA bianco. Aggiungere un millilitro di etanolo al 75% per un millilitro di reagente in soluzione di isotiocianato di fenilguanidina per lavare il pellet. Centrifugare i campioni a 12.000 volte g per 10 minuti.Dopo aver rimosso la maggior parte del surnatante, utilizzare una pipetta per rimuovere quanto più etanolo possibile, ma non disturbare il pellet. Centrifuga i campioni per pellettare tutto l'etanolo in eccesso. Il pellet di RNA è meno compatto in questa fase e tende a muoversi.Dopo la centrifuga, rimuovere tutto l'etanolo in eccesso dal tubo senza disturbare il pellet. Lasciare asciugare il pellet di RNA all'aria per cinque minuti. Aggiungere 50 microlitri di acqua priva di nucleasi al pellet di RNA e risospendere il pellet in acqua priva di nucleasi.Trattare i campioni di un microlitro di Deanasi per rimuovere il DNA e quindi inattivare la Deanasi e i cationi. Conservare i campioni di RNA in provette da microcentrifuga da 2,0 millilitri a meno 80 gradi Celsius. Quantifica l'RNA e controlla la purezza dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro.Dopo aver verificato la purezza, analizzare l'RNA con un gel di agarosio all'1% per visualizzare l'estensione della degradazione. Due bande chiare che rappresentano l'rRNA 18S e 28S dovrebbero essere chiaramente visibili. Se queste bande non sono visibili, l'RNA può essere degradato.Successivamente, monitorare l'abbondanza del trascritto nelle aliquote di RNA raccolte rispetto allo standard interno spiked-in utilizzando la qPCR in tempo reale. Possono essere utilizzati anche microarray, sequenziamento dell'RNA o northern blot. Le intensità di fluorescenza nel tempo corrispondono all'espressione genica.Mentre i fibroblasti diventano inibiti dal contatto, il collagene 3A1 che codifica per la trascrizione, un gene molto importante per la creazione della matrice extracellulare depositata durante la guarigione delle ferite, diventa più stabile e non decade così rapidamente. Non dimenticare che lavorare con il fenolo può essere estremamente pericoloso ed è importante non lasciare che tocchi la pelle. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare i tassi di decadimento del trascritto nei fibroblasti proliferanti e quiescenti.I cambiamenti nel tasso di decadimento del trascritto possono essere un importante meccanismo di triangolazione genica.

determining-genome-wide-transcript-decay-rates-proliferating

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Descriviamo metodi photobleaching tra cui Recovery fluorescenza Dopo photobleaching (FRAP) e Perdita Fluorescence In photobleaching (FLIP) per monitorare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in staminali embrionali (ES) cellule. Cromatina proteine ​​dinamica, che è considerato uno dei mezzi per studiare la plasticità cromatina, è aumentata in cellule pluripotenti.

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

RNA polimerasi II cinetica trascrizionali sono misurate su specifici geni nelle cellule viventi. mRNA trascritto dal gene di interesse sono fluorescente tag e l'utilizzo di recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) la cinetica in vivo di allungamento della trascrizione si ottengono.

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

L'RNA cellulare totale fornisce un modello povero per studiare variazioni a breve termine in sintesi dell'RNA e il decadimento nonché la cinetica di RNA processing. Qui, descriviamo marcatura metabolica di RNA trascritto recente con 4 thiouridine seguito da biotinylation tiolo-specifica e purificazione dell'RNA trascritto appena consentano di superare queste limitazioni.

Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

Il livello di stato stazionario di specifici mRNA è determinata dalla velocità di sintesi e decadimento del mRNA. Velocità di degradazione mRNA genome-wide o dei tassi di decadimento di specifici mRNA può essere misurata determinando emivita mRNA. Questo protocollo si concentra sulla misurazione del mRNA tassi di decadimento in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

Questo protocollo descrive un metodo per determinare la proteina emivite in singole cellule aderenti, utilizzando impulsi etichettatura e time-lapse imaging di fluorescenza di proteine di fusione SNAP-tag.

Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti

Neurodevelopmental processi come proliferazione, migrazione e neuriti sono spesso perturbati in malattie neuropsichiatriche. Così, vi presentiamo protocolli per in modo rapido e riproducibile valutare questi processi neurodevelopmental in umano iPSC-derivati NPC. Questi protocolli permettono anche di valutare gli effetti di fattori di crescita e di terapeutica sullo sviluppo di NPC.

Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

Questo protocollo descrive l'uso combinatoria di ChIP-seq, 4sU-seq, totale RNA-seq e profilatura per linee cellulari e cellule primarie del ribosoma. Esso consente di tenere traccia delle modifiche in fattore di trascrizione binding, trascrizione de novo , elaborazione di RNA, fatturato e traduzione nel corso del tempo e la visualizzazione il corso generale degli eventi in cellule attivate e/o cambiare rapidamente.

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Qui, presentiamo uno strumento che può essere utilizzato per studiare la modulazione posttranscriptionale di una trascrizione nelle cellule epiteliali alveolare primarie utilizzando un sistema di espressione inducibile accoppiato a una tecnica di elettroporazione pipetta.

Sistema di espressione plasmide controllato da Transcriopzionalmente per l'analisi della stabilità delle trascrizioni dell'mRNA nelle cellule epiteliali primarie

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per l'etichettatura metabolica di cellule senescenti e non in divisione con SILAC pulsato, analisi di spettrometria di massa non mirata e un calcolo semplificato delle emivite proteiche.

Misurazione dei tassi di turnover proteico in cellule coltivate senescenti e non in divisione con etichettatura metabolica e spettrometria di massa

Questo protocollo misura quantitativamente la stabilità e l'emivita degli RNA potenziatori intergenici e intragenici nelle cellule staminali embrionali di topo utilizzando il trattamento con Actinomicina D, RT-qPCR e analisi di regressione non lineare. Strategie di normalizzazione specifiche per posizione sono incorporate per modellare accuratamente la dinamica del decadimento dell'eRNA in modo dipendente dal contesto.

Valutazione Quantitativa Ottimizzata della Stabilità dell'RNA Potenziatore nelle Cellule Staminali Embrionali di Topo

Questo articolo presenta un protocollo LysoTracker per cellule vive per misurare il rimodellamento lisosomico durante la senescenza nei fibroblasti umani IMR-90.

Profilazione lisosomica con LysoTracker per la valutazione quantitativa della senescenza cellulare nei fibroblasti umani

Scopri come monitorare i tassi di decadimento dei trascritti in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti. Questo metodo permette di distinguere tra abbondanza e stabilità degli RNA, offrendo nuove prospettive sulla regolazione dell'espressione genica.

Determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti

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