Determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti
2 gennaio 2018
Descriviamo un protocollo per la generazione di proliferazione e fibroblasti cutanei umani primari quiescenti, monitoraggio tassi di decadimento di trascrizione e l'individuazione di geni differenzialmente decadente.
L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare i tassi di decadimento del trascritto nei fibroblasti proliferanti e quiescenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare, come ad esempio se i cambiamenti nell'espressione genica derivano da cambiamenti nel tasso di decadimento del trascritto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce informazioni sul tasso di decadimento del trascritto, non solo sull'abbondanza del trascritto.
Per iniziare il protocollo, stabilire colture proliferanti e quiescenti di fibroblasti. I fibroblasti proliferanti devono essere tripsinizzati regolarmente. Le colture quiescenti possono essere stabilite consentendo alle placche di raggiungere la confluenza con cambi regolari del mezzo.
Aggiungere ActD 150 microlitri al terreno preriscaldato 10 millilitri per tutte le piastre di coltura cellulare replicate biologiche. Aggiungere ActD a una concentrazione di 15 microgrammi per millilitro di terreno. Mescola bene la soluzione.
Aspirare il vecchio terreno e aggiungere alle cellule un terreno contenente ActD. Per raccogliere il campione del punto di tempo zero, aspirare delicatamente il terreno ActD e pipettare tra cinque e 10 millilitri di PBS preriscaldato su una piastra da 100 millimetri, cinque millilitri di soluzione per una piastra da 100 millimetri, due millilitri per un pozzetto di una piastra a sei pozzetti e un millilitro per un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Aspirare delicatamente il PBS.
Quindi aggiungere la soluzione di isotiocianato di fenolo-guanidina direttamente alla piastra di coltura tissutale. Pipettare più volte la miscela di cellule della soluzione di isotiocianato fenolo-guanidina su e giù per ottenere una miscela omogenea. Raccogli ogni punto temporale dopo che è trascorso il periodo di tempo appropriato, utilizzando il metodo descritto in precedenza.
Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti per garantire la completa dissoluzione dei complessi proteici dell'RNA. Successivamente, introdurre le trascrizioni controllate con spike-in che possono essere rilevate con la metodologia utilizzata. Introdurre questi controlli in ciascun campione a una quantità e concentrazione note.
Utilizzando una pipetta, trasferire la miscela di soluzione di isotiocianato di fenilguanidina in una provetta da microcentrifuga da 2,0 millilitri. Quindi aggiungere 0,2 millilitri di cloroformio alla miscela di soluzione di isotiocianato di fenilguanidina per ogni millilitro di soluzione di isotiocianato di fenilguanidina utilizzata. Agitare energicamente la provetta da microcentrifuga per 15 secondi e quindi incubare l'isotiocianato di fenilguanidina cloroformio.
Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 12.000 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Il campione deve essere separato in tre strati. Trasferire lo strato acquoso in una nuova provetta da microcentrifuga da 2,0 millilitri utilizzando una micropipetta e fare attenzione a non disturbare l'interfase durante questo processo.
Scartare l'interfase e le frazioni organiche. Quindi aggiungere un volume uguale di 2-propanolo alla frazione acquosa e capovolgere la provetta 10 volte. Aggiungere fino a un microlitro di 20 milligrammi per millilitro di glicogeno acquoso per 20 microlitri di campione, soprattutto se si prevede che la resa sia bassa.
Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni. Assicurarsi che alla fine della rotazione, l'RNA sia precipitato per formare un pallino sul fondo del tubo.
Con una pipetta, rimuovere ed eliminare il surnatante, prestando particolare attenzione a non disturbare il pellet di RNA bianco. Aggiungere un millilitro di etanolo al 75% per un millilitro di reagente in soluzione di isotiocianato di fenilguanidina per lavare il pellet. Centrifugare i campioni a 12.000 volte g per 10 minuti.
Dopo aver rimosso la maggior parte del surnatante, utilizzare una pipetta per rimuovere quanto più etanolo possibile, ma non disturbare il pellet. Centrifuga i campioni per pellettare tutto l'etanolo in eccesso. Il pellet di RNA è meno compatto in questa fase e tende a muoversi.
Dopo la centrifuga, rimuovere tutto l'etanolo in eccesso dal tubo senza disturbare il pellet. Lasciare asciugare il pellet di RNA all'aria per cinque minuti. Aggiungere 50 microlitri di acqua priva di nucleasi al pellet di RNA e risospendere il pellet in acqua priva di nucleasi.
Trattare i campioni di un microlitro di Deanasi per rimuovere il DNA e quindi inattivare la Deanasi e i cationi. Conservare i campioni di RNA in provette da microcentrifuga da 2,0 millilitri a meno 80 gradi Celsius. Quantifica l'RNA e controlla la purezza dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro.
Dopo aver verificato la purezza, analizzare l'RNA con un gel di agarosio all'1% per visualizzare l'estensione della degradazione. Due bande chiare che rappresentano l'rRNA 18S e 28S dovrebbero essere chiaramente visibili. Se queste bande non sono visibili, l'RNA può essere degradato.
Successivamente, monitorare l'abbondanza del trascritto nelle aliquote di RNA raccolte rispetto allo standard interno spiked-in utilizzando la qPCR in tempo reale. Possono essere utilizzati anche microarray, sequenziamento dell'RNA o northern blot. Le intensità di fluorescenza nel tempo corrispondono all'espressione genica.
Mentre i fibroblasti diventano inibiti dal contatto, il collagene 3A1 che codifica per la trascrizione, un gene molto importante per la creazione della matrice extracellulare depositata durante la guarigione delle ferite, diventa più stabile e non decade così rapidamente. Non dimenticare che lavorare con il fenolo può essere estremamente pericoloso ed è importante non lasciare che tocchi la pelle. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare i tassi di decadimento del trascritto nei fibroblasti proliferanti e quiescenti.
I cambiamenti nel tasso di decadimento del trascritto possono essere un importante meccanismo di triangolazione genica.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per la generazione di fibroblasti dermici primari umani sia in fase proliferativa che quiescente. Si concentra sul monitoraggio dei tassi di degradazione dei trascritti e sull'identificazione di geni con degradazione differenziale, fornendo informazioni sulle dinamiche dell'espressione genica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Molecolare
- Biologia Cellulare
- Espressione Genica
Sfondo
- Comprendere i tassi di degradazione dell'RNA messaggero è fondamentale per chiarire la regolazione dell'espressione genica.
- I fibroblasti costituiscono un modello per lo studio dei processi cellulari nei tessuti umani.
- Lo stato proliferativo e quello quiescente dei fibroblasti possono influenzare i risultati dell'espressione genica.
- Questo protocollo mira a distinguere gli effetti del decadimento trascrizionale dall'abbondanza semplice del trascritto.
Scopo dello studio
- Monitorare i tassi di degradazione dei trascritti in diversi stati delle colture di fibroblasti.
- Indagare come le variazioni nell'espressione genica siano correlate ai tassi di degradazione dei trascritti.
- Fornire un metodo affidabile per lo studio della dinamica dell'espressione genica nei fibroblasti.
Metodi Utilizzati
- Stabilimento di colture di fibroblasti proliferanti e quiescenti.
- Regolare tripsinizzazione dei fibroblasti proliferanti.
- Stabilimento di colture quiescenti basato sulla confluenza, con cambi del mezzo.
- Monitoraggio dei tassi di degradazione dell'RNA messaggero mediante protocolli sperimentali.
Risultati principali
- Identificazione di geni con degradazione differenziale tra stati proliferativi e quiescenti.
- Approfondimenti sulla relazione tra degradazione dell'RNA messaggero e variazioni dell'espressione genica.
- Dimostrazione dei vantaggi della misurazione dei tassi di degradazione degli RNA messaggeri.
- Fornitura di un protocollo dettagliato per studi futuri in biologia molecolare.
Conclusioni
- Il protocollo distingue efficacemente tra abbondanza dei trascritti e velocità di degradazione.
- I risultati contribuiscono a una comprensione più approfondita della regolazione dell'espressione genica.
- Questo metodo può essere applicato a diversi studi in biologia molecolare e cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La misurazione su scala genomica dei tassi di degradazione dell'RNA messaggero in fibroblasti umani in proliferazione e in quiescenza consente ai team biofarmaceutici di distinguere i meccanismi regolatori responsabili delle variazioni nell'espressione genica al di là del controllo trascrizionale. Questo approccio supporta la riduzione dei rischi meccanicistici e aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi, chiarendo se le differenze osservate nell'espressione genica siano dovute a una stabilità alterata dell'mRNA o a un'attività trascrizionale modificata. L'integrazione del profilo di degradazione dell'mRNA in fasi precoci di scoperta orienta la selezione e la priorizzazione del portafoglio verso bersagli rilevanti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della regolazione dell'espressione genica distinguendo tra effetti trascrizionali e post-trascrizionali.
- Supporta la validazione funzionale delle sequenze bersaglio identificando geni con stabilità dell'mRNA alterata in condizioni rilevanti per la malattia.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando il contributo del decadimento dell'RNA messaggero al fenotipo.
- Migliora la fiducia predittiva nella selezione di bersagli dotati di profili regolatori robusti.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce sistemi biologici validati per analisi trascrittomiche e funzionali successive.
- Fornisce misurazioni quantitative dei tassi di decadimento per la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi.
- Permette lo screening di composti o perturbazioni genetiche che influenzano la stabilità dell'mRNA.
- Consente il riutilizzo della piattaforma per studi comparativi tra diversi stati cellulari o condizioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le firme del decadimento dei trascritti a stati cellulari rilevanti per la malattia, al fine di scoprire biomarcatori traducibili in ambito clinico.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica monitorando i meccanismi regolatori.
- Riduce i rischi nelle decisioni di avanzamento confermando la rilevanza meccanicistica dei bersagli candidati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'iniziale verifica delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica, fornendo una capacità riutilizzabile per l'analisi trascrittomica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi isolando il decadimento trascrizionale come variabile regolatoria.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili delle velocità di decadimento per lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Permette il confronto statistico delle velocità di decadimento tra stati proliferativi e quiescenti.
- Ricerca traslazionale: Collega le variazioni della velocità di decadimento a fenotipi cellulari rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro standardizzato adattabile a diversi modelli cellulari e condizioni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla regolazione genica.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni del decadimento dei trascritti standardizzate, riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza del capitale chiarificando i meccanismi regolatori.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di target con profili regolatori validati, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nell'estrazione dell'RNA e nell'analisi quantitativa dei trascritti.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per qPCR, microarray o sequenziamento dell'RNA.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i gruppi di lavoro nella manipolazione dei campioni e nella raccolta dei punti temporali.
- Adattabile a diversi tipi cellulari, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per diversi sistemi biologici.
- Limitato dalla tossicità dell'actinomicina D, che restringe il periodo temporale per la misurazione del decadimento.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
ActD Time Course
2:13
Isolation of Total RNA from Phenol-guanidine Isothiocyanate Solution Lysate
5:16
Analysis of Transcript Abundance
6:02
Results: Clear Contrast in Transcript Decay Between Proliferating and Quiescent Fibroblasts
6:28
Conclusion
