Determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare i tassi di decadimento del trascritto nei fibroblasti proliferanti e quiescenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare, come ad esempio se i cambiamenti nell'espressione genica derivano da cambiamenti nel tasso di decadimento del trascritto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce informazioni sul tasso di decadimento del trascritto, non solo sull'abbondanza del trascritto.

Per iniziare il protocollo, stabilire colture proliferanti e quiescenti di fibroblasti. I fibroblasti proliferanti devono essere tripsinizzati regolarmente. Le colture quiescenti possono essere stabilite consentendo alle placche di raggiungere la confluenza con cambi regolari del mezzo.

Aggiungere ActD 150 microlitri al terreno preriscaldato 10 millilitri per tutte le piastre di coltura cellulare replicate biologiche. Aggiungere ActD a una concentrazione di 15 microgrammi per millilitro di terreno. Mescola bene la soluzione.

Aspirare il vecchio terreno e aggiungere alle cellule un terreno contenente ActD. Per raccogliere il campione del punto di tempo zero, aspirare delicatamente il terreno ActD e pipettare tra cinque e 10 millilitri di PBS preriscaldato su una piastra da 100 millimetri, cinque millilitri di soluzione per una piastra da 100 millimetri, due millilitri per un pozzetto di una piastra a sei pozzetti e un millilitro per un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Aspirare delicatamente il PBS.

Quindi aggiungere la soluzione di isotiocianato di fenolo-guanidina direttamente alla piastra di coltura tissutale. Pipettare più volte la miscela di cellule della soluzione di isotiocianato fenolo-guanidina su e giù per ottenere una miscela omogenea. Raccogli ogni punto temporale dopo che è trascorso il periodo di tempo appropriato, utilizzando il metodo descritto in precedenza.

Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti per garantire la completa dissoluzione dei complessi proteici dell'RNA. Successivamente, introdurre le trascrizioni controllate con spike-in che possono essere rilevate con la metodologia utilizzata. Introdurre questi controlli in ciascun campione a una quantità e concentrazione note.

Utilizzando una pipetta, trasferire la miscela di soluzione di isotiocianato di fenilguanidina in una provetta da microcentrifuga da 2,0 millilitri. Quindi aggiungere 0,2 millilitri di cloroformio alla miscela di soluzione di isotiocianato di fenilguanidina per ogni millilitro di soluzione di isotiocianato di fenilguanidina utilizzata. Agitare energicamente la provetta da microcentrifuga per 15 secondi e quindi incubare l'isotiocianato di fenilguanidina cloroformio.

Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 12.000 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Il campione deve essere separato in tre strati. Trasferire lo strato acquoso in una nuova provetta da microcentrifuga da 2,0 millilitri utilizzando una micropipetta e fare attenzione a non disturbare l'interfase durante questo processo.

Scartare l'interfase e le frazioni organiche. Quindi aggiungere un volume uguale di 2-propanolo alla frazione acquosa e capovolgere la provetta 10 volte. Aggiungere fino a un microlitro di 20 milligrammi per millilitro di glicogeno acquoso per 20 microlitri di campione, soprattutto se si prevede che la resa sia bassa.

Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni. Assicurarsi che alla fine della rotazione, l'RNA sia precipitato per formare un pallino sul fondo del tubo.

Con una pipetta, rimuovere ed eliminare il surnatante, prestando particolare attenzione a non disturbare il pellet di RNA bianco. Aggiungere un millilitro di etanolo al 75% per un millilitro di reagente in soluzione di isotiocianato di fenilguanidina per lavare il pellet. Centrifugare i campioni a 12.000 volte g per 10 minuti.

Dopo aver rimosso la maggior parte del surnatante, utilizzare una pipetta per rimuovere quanto più etanolo possibile, ma non disturbare il pellet. Centrifuga i campioni per pellettare tutto l'etanolo in eccesso. Il pellet di RNA è meno compatto in questa fase e tende a muoversi.

Dopo la centrifuga, rimuovere tutto l'etanolo in eccesso dal tubo senza disturbare il pellet. Lasciare asciugare il pellet di RNA all'aria per cinque minuti. Aggiungere 50 microlitri di acqua priva di nucleasi al pellet di RNA e risospendere il pellet in acqua priva di nucleasi.

Trattare i campioni di un microlitro di Deanasi per rimuovere il DNA e quindi inattivare la Deanasi e i cationi. Conservare i campioni di RNA in provette da microcentrifuga da 2,0 millilitri a meno 80 gradi Celsius. Quantifica l'RNA e controlla la purezza dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro.

Dopo aver verificato la purezza, analizzare l'RNA con un gel di agarosio all'1% per visualizzare l'estensione della degradazione. Due bande chiare che rappresentano l'rRNA 18S e 28S dovrebbero essere chiaramente visibili. Se queste bande non sono visibili, l'RNA può essere degradato.

Successivamente, monitorare l'abbondanza del trascritto nelle aliquote di RNA raccolte rispetto allo standard interno spiked-in utilizzando la qPCR in tempo reale. Possono essere utilizzati anche microarray, sequenziamento dell'RNA o northern blot. Le intensità di fluorescenza nel tempo corrispondono all'espressione genica.

Mentre i fibroblasti diventano inibiti dal contatto, il collagene 3A1 che codifica per la trascrizione, un gene molto importante per la creazione della matrice extracellulare depositata durante la guarigione delle ferite, diventa più stabile e non decade così rapidamente. Non dimenticare che lavorare con il fenolo può essere estremamente pericoloso ed è importante non lasciare che tocchi la pelle. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare i tassi di decadimento del trascritto nei fibroblasti proliferanti e quiescenti.

I cambiamenti nel tasso di decadimento del trascritto possono essere un importante meccanismo di triangolazione genica.