Name: Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Impara il metodo del tubo rullo modificato per la coltura a lungo termine di fette di cervello di roditori con imaging ripetitivo ad alta risoluzione. Questa tecnica preserva la viabilità neuronale e consente il monitoraggio delle stesse popolazioni cellulari nel tempo per studiare lo sviluppo neuronale e i disturbi neurodegenerativi.

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Il metodo del tubo rullo descritto qui consente la coltura a lungo termine e di imaging ad alta risoluzione dal vivo del tessuto di cervello affettato. Un grosso problema con la tecnica di fetta come applicato qui è nel montaggio e manutenzione delle fette. Rivestimenti di vetrino coprioggetto che supportano fetta adesione, promuovere la fetta assottigliamento migliorando la conseguenza dei neurites e migrazione delle cellule fuori la fetta; così, abbiamo evitato l'uso di questi substrati. L'inserimento di gruppi amminic...

Colture primarie di neuroni dissociati dalle regioni del cervello del roditore sono un importante strumento usato dai ricercatori per osservare le risposte alla patologico implicato stimoli. Tuttavia, tali studi hanno lo svantaggio di guardando i neuroni in 2D solo e senza loro glial sistema di supporto. Inoltre, a meno che non coltivate in condizioni di densità molto alta (640 neuroni/mm2 o circa il 16% della superficie) in cui esso diventa impossibile seguire la conseguenza casuale di un dendrite o assone per più di una breve distanza dal suo corpo cellulare, hippocampal vitalità neuronale oltre 4 settimane diminuisce significativamente1, limitando l'uso di colture dissociate per gli studi estesi delle patologie età-correlate. Alla coltura delle fette preparati dal cervello del roditore è un'opzione attraente che supera queste limitazioni mantenendo un'architettura cellulare organizzata e vitalità per settimane o mesi. Condizioni per il mantenimento di molte regioni differenti del cervello del roditore nella fetta di cultura sono stati descritti2.
Due metodi principali sono ampiamente usati per la coltura a lungo termine di fette del cervello: coltura su membrane all' interfaccia aria-liquido3 o coltura sulle lamelle in provette sigillate permesso di ruotare in un incubatore a rullo per fornire aerazione4. Fette coltivate sulle membrane possono essere imaged direttamente con microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione utilizzando un microscopio dritto e acqua immersione obiettivi5. In alternativa, fette coltivate sulle membrane sono stati trasferiti a piatti di fondo di vetro per ottenere una buona risoluzione delle spine dendritiche usando un microscopio invertito6. Tuttavia, entrambi i metodi di imaging fette coltivate sulle membrane sono sistemi aperti che richiedono modifiche medie e spesso utilizzano antimicotico e/o antibiotici per prevenire o ridurre la contaminazione5,6. Fette su una membrana all'interfaccia aria-medio mantengono eccellente morfologia e sopravvivenza, ma tornando a posizioni precise durante la formazione immagine ripetitiva ad alto ingrandimento è estremamente difficile a meno che l'esperimento è seguito solo piccoli gruppi di cellule esprimendo un marcatore fluorescente. Sebbene fette coltivate sulle membrane sono stati utilizzati con espressione virale-mediata di transgeni5,6, protocolli di biosicurezza potrebbero richiedere un sistema di coltura chiuso essere impiegato per alcuni vettori virali che sono utilizzati per esprimendo la fluorescente tagged proteine e reporter di fisiologia cellulare. Inoltre, obiettivi di immersione richiedono una decontaminazione tra i campioni che verranno seguite nella cultura5. Una delle principale applicazioni del culture interfaccia membrana sta combinando imaging ad alta risoluzione con elettrofisiologia a singola volta punti7.
Il metodo del tubo rullo con lamelle all'interno del tubo di plastica non consente alcun elettrofisiologia o imaging ad alta risoluzione senza rimuovere il vetrino coprioggetti. Pertanto, questo metodo è stato applicato più spesso a studi a lungo termine in cui sono state fatte osservazioni post-fissazione,8. Qui descritto è un metodo che utilizza la tecnica della coltura tubo rullo ma sui tubi forati-out con fette sulle lamelle che possono essere imaged in modo ripetitivo per finchè le culture vengono mantenuto. Il sistema chiuso non richiede alcun cambiamento medio per l'imaging e utilizza vetrini coprioggetti fotoincisioni per fornire fiducial marchi che consentono di imaging ad alto ingrandimento, dopo giorni o settimane, i precisi campi precedentemente imaged.
Applichiamo questo metodo per esaminare i cambiamenti nel roditore ippocampo, una regione del cervello più importanti coinvolta nella memoria e l'apprendimento. L'ippocampo roditore è spesso studiata come un modello per patologiche o età-correlate cambiamenti osservati durante lo sviluppo di danno conoscitivo9, come quelle che si verificano in annuncio. Il nostro metodo è particolarmente adatto per studiare i cambiamenti patologici che si sviluppano all'interno di una singola fetta nel tempo in risposta ai cambiamenti ambientali, come aumenti di peptidi Aβ, che è caratteristica della AD8. Una patologia connessa con il cervello umano e del roditore dell'annuncio è la presenza di aggregati cofilina-actina e le bacchette, quest'ultimi contiene fasci di filamenti in cui cofilina e actina sono presenti un 1:1 rapporto molare10,11, 12. canne sono state osservate in fisse fette dell'ippocampo del ratto dopo il trattamento di Aβ, così come all'interno di una fetta di cervello del roditore vivo esprimendo cofilina-GFP sottoposti ad ipossia8, e possono contribuire alla disfunzione sinaptica ad esempio ad e di colpo. Qui usiamo questo nuovo metodo di coltura per osservare il decorso e la distribuzione all'interno di fette di proteine fluorescenti chimeriche esogene espresse introdotte da virus diversi. Utilizziamo quindi l'espressione specifica di un neurone di un costrutto di reporter cofilina di seguire lo sviluppo della cofilina rod e aggregata patologia nelle fette hippocampal in risposta al trattamento con oligomeri solubili di Aβ (Aβo).

<table><tbody><tr><td>Fondi da piastre di coltura da 15 cm</td><td>VWR Scientific</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>Viti a macchina con testa a croce (#10-32)</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td>2,5" di lunghezza e 3/16" di diametro</td></tr><tr><td>Rondelle piatte #10</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vite a macchina (#10-32)</td><td>Occhielli in gomma ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ferramenta</td><td></td> ACE <td>5/16", spessore; 5/8", diametro foro; 1.125", diametro esterno</td></tr><tr><td>tubo in polietilene (5/16"; OD, 3/16"; ID)</td> <td>ACE Hardware</td><td></td><td>Tagliato a 1,8 "di lunghezza</td></tr><tr><td>Rondella di sicurezza # 10</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trapano a colonna, 5 velocità&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>ProTech Modello 1201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Tubi a lato piatto VWR</td><td></td><td>62407-076</td><td></td></tr><tr><td>Punte da trapano, 3 mm, 6 mm e 15 mm&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>Diablo marca freud</td><td>Punte da trapano per il taglio della plastica.</td></tr><tr>Punte da trapano per legno, lima per legno <td>Ace Hardware</td><td></td><td></td>da <td>1,5 cm e 1 mm</td></tr><tr>, clip a molla <td>Ace Harware</td><td></td><td></td><td>rotonde da 1/4",</td></tr><tr><td>utensile per sbavatura con testa girevole</td><td></td> Ace Hardware <td></td> da 16 mm, foglio adesivo in silicone Ace Hardware 26307 <td></td>da 5"</tr><tr><td>(Secure Seal)</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>666581</td><td>spessore 0,5 mm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perforatrice da 6 mm</td><td>Office Perforatrice Max</td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 12 mm</td><td>thepunchbunch.com</td><td></td><td></td></tr> vetrini coprioggetti fototecnologici al <tr><td>70% etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, diametro 12 mm</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>1916-91012</td><td></td></tr><tr><td>Bruciatore</td><td></td><td></td><td></td>Bunsen</tr><tr><td>Etanolo Assoluto Acqua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanopura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-amminopropiltrietossilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont Forcipe</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Tritatutto McIlwain Ted</td><td>Pella, Inc.</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Lame di rasoio a doppio taglio</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman</td><td>VWR</td><td>28450-182</td><td>Tagliata in cerchi di 5,8 cm di diametro</td></tr><tr><td>Poli-cloro-trifluoro-etilene (Aclar)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10501-10</td><td>Tagliare in cerchi di 5,8 cm di diametro</td></tr><tr><td>#21 Lama chirurgica</td><td>VWR Scientific</td><td>25860-144</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Spatola, acciaio inossidabile con estremità conica</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Gey</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Glucosio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td> Soluzione al <td>25% (p/v), filtro da 0,2 mm sterilizzato</td></tr><tr><td>Plasma di pollo</td><td>Cocalico Biologicals</td><td>30-0300-5L</td><td>Reidratare in acqua sterile, centrifugare a 2500 x g 30 min a 4 &deg; C, congelare rapidamente le aliquote in azoto liquido e conservarle -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Trombina, topica (bovina)</td><td>Pfizer</td><td>Thrombin-JMI</td><td>Aliquote di congelamento rapido in azoto liquido a 1.000 unità internazionali/mL in diluente fornito e conservare a -80 °C. Utilizzare a 250 unità/mL.</td></tr><tr><td>Sistema di rulli cellulari</td><td>Bellco Biotech</td><td>SciERA</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a rulli</td><td>Forma Modello</td><td>3956</td><td></td></tr><tr><td>N21-MAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AR008</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>200 mM Glutammina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>glucosio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>Soluzione al 25% (p/v), filtro da 0,2 mm sterilizzato</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888-022&nbsp;</td><td>Terreno completo: 48 mL di Neurobasal A, 1 mL di N21-MAX, 0,625 mL di 200 mM di glutammina, 0,180 mL di glucosio al 25%, 0,250 mL di penne/streptococco 100x.</td></tr><tr><td>Packaging lentivirus di terza generazione</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>159 K cutoff filtri centrifughi (Centricon)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di clonazione lentivirale (InFusion)</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids 30323, 50856, 51279</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colorante per la vitalità delle cellule neuronali (NeuO)</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>1801</td><td>Scongelare una volta e congelare rapidamente in 4 &micro; L aliquote. Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivi per microscopio</td><td>Olympus</td><td>aria: 4X, 20; olio: 40X, 60X,</td><td></td></tr> <tr><td>sistema confocale a disco rotante</td><td>Yokagawa</td><td>CSU22</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Fotocamera EMCCD</td><td>Fotometria</td><td>Cascade II</td><td></td></tr><tr><td>Lineare codificato (x,y), piezoelettrico z stadio superiore piatto</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser per microscopi e integrazione</td><td>Innovazioni</td><td></td><td></td>di imaging intelligente</tr><tr><td>HEK293T cellule</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Plasmina umana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1867</td><td>0,002 U/mL in albumina sierica bovina allo 0,1% (filtro sterilizzato da 0,2 mm), congelamento rapido in azoto liquido e conservazione a -80 &deg;C.</td></tr></tbody></table>

metodo del tubo rullo modificate per imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Fette del cervello del roditore coltivate sono utili per studiare il comportamento cellulare e molecolare dei neuroni e cellule gliali in un ambiente che conserva ancora molte delle loro interazioni normale in vivo . Fette ottenute da una varietà di linee di topi transgenici o uso di vettori virali per l'espressione di proteine fluorescente etichettate o reporter in fettine di cervello di tipo selvaggio consentono per imaging ad alta risoluzione da microscopia di fluorescenza. Sebbene diversi metodi sono stati sviluppati per l'imaging di fettine di cervello, che unisce la cultura fetta con la possibilità di eseguire ripetitivo imaging ad alta risoluzione di cellule specifiche a fette dal vivo nel corso di lunghi periodi di tempo ha posto problemi. Questo è particolarmente vero quando vettori virali sono usati per l'espressione di proteine esogene poiché questo è meglio farlo in un sistema chiuso per proteggere gli utenti e di evitare la contaminazione incrociata. Semplici modifiche apportate al metodo di coltura a rulli tubo cervello fetta che consentono per imaging ad alta risoluzione ripetitivo delle fette sopra molte settimane in un sistema chiuso sono segnalate. Coltura fette su vetrini coprioggetti fotoincisioni consente l'utilizzo dei marchi fiducial rapidamente e precisamente riposizionare il palco per il campo identico di immagine nel tempo prima e dopo i trattamenti differenti. Sono riportati alcuni esempi per l'utilizzo di questo metodo combinato con colorazione neuronale specifica espressione per osservare i cambiamenti nell'architettura di fettine di ippocampo, espressione di un neurone virale-mediata di proteine fluorescenti e lo sviluppo di patologia cofilina, che precedentemente è stata osservata nell'ippocampo del morbo di Alzheimer (annuncio) in risposta al trattamento della fetta con oligomeri del peptide amiloide-β (Aβ).

Per determinare con precisione come fiducial contrassegni possono essere utilizzati per creare una nuova immagine delle stesse cellule all'interno dei campi stessi nel corso del tempo, abbiamo esaminato fette coltivate su vetrini coprioggetti fotoincisioni (Figura 6A). I neuroni sono stati visualizzati tramite colorazione con un colorante vitale (100 nM per 2 h; non macchia le cellule non neuronali), che scompare da neuroni nel tempo senza da...

Presentato qui è un metodo di tubo rullo modificate per la coltura e fette di imaging ad alta risoluzione intermittente del cervello del roditore sopra molte settimane con riposizionamento preciso sulle lamelle di fotoincisioni. Vitalità neuronale e fetta morfologia sono ben tenute. Vengono fornite applicazioni di questo sistema completamente chiusa usando i virus per espressione specifica del tipo di cella.

Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

L'obiettivo generale di questo metodo modificato del tubo a rullo per la coltura di fette cerebrali è quello di fornire un sistema di coltura chiuso per la sopravvivenza a lungo termine delle fette, con la capacità di imaging ripetitivo in florescenza ad alta risoluzione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello sviluppo neuronale e nei disturbi neurodegenerativi che richiedono l'osservazione degli stessi neuroni nel tempo, come la localizzazione delle proteine chiave coinvolte nella formazione o nella perdita delle sinapsi.I principali vantaggi di questa tecnica sono il sistema di coltura completamente chiuso che consente l'uso sicuro dei virus per l'espressione proteica e l'uso di vetrini coprioggetti fotoincisi per localizzare le stesse cellule per l'imaging. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo coltivando fette su vetrini coprioggetti all'interno di tubi a rullo, ma avevamo bisogno di un modo migliore per visualizzare i cambiamenti che si verificano nelle fette viventi nel tempo. L'uso diffuso di vettori virali per esprimere transgeni e popolazioni cellulari specifiche per l'imaging al microscopio ci ha spinto a sviluppare

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Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all'interno intatto tessuto nervoso.

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

In questo protocollo, che aggiorniamo i recenti progressi nel campo dell'imaging...

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Questo video mostra un metodo modificato del tubo di rotella per la coltura a lungo termine di fette di cervello da un modello di roditore. In primo luogo, le fette di cervello vengono attaccate ai vetrini. Quindi, vengono prelevati i tubi a rullo a lato piatto con un foro sul lato piatto e i vetrini coprioggetti vengono posizionati sul foro utilizzando dischi adesivi. Infine, un mezzo nutritivo e una miscela di anidride carbonica e aria vengono aggiunti alla provetta e le provette vengono...

Un metodo modificato del tubo a rullo per la coltura a lungo termine di fette di cervello di roditore

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Imaging confocale di neuroni in migrazione in una coltura di fette organotipiche del cervello embrionale di topo utilizzando In Utero Elettroporazione. J. Vis. Exp. (2017) Questo video mostra la microscopia confocale time-lapse per osservare la migrazione radiale del neurone corticale dalla zona subventricolare alla placca corticale tramite scaffold gliali radiali in fette di cervello embrionale di topo trasdotte.

Imaging time-lapse della migrazione radiale dei neuroni corticali in fette di cervello embrionale di topo trasdotto

Viene descritta una tecnica per studiare le cellule NG2 e gli oligodendrociti utilizzando un sistema di coltura a fette del proencefalo e del cervelletto.  Questo metodo consente di esaminare le dinamiche di proliferazione e differenziazione delle cellule all'interno della linea degli oligodendrociti, dove l'ambiente extracellulare può essere facilmente manipolato mantenendo la citoarchitettura tissutale.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

L'utilizzo di più angoli per tagliare il cervello di topo cucciolo, miglioriamo su una fetta cerebrale acuto precedentemente descritto, che cattura le connessioni tra le maggiori strutture mesencefalo e proencefalo uditive.

Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Descriviamo un protocollo per l'espressione specifica del tipo di cellula del sensore basato su FRET codificato geneticamente ATeam1.03YEMK nelle colture di sezioni organotipiche del prosencefalo del topo. Inoltre, mostriamo come utilizzare questo sensore per l'imaging dinamico dei livelli di ATP cellulare in neuroni e astrociti.

Imaging di ATP intracellulare in fette di tessuto organicino del cervello del topo utilizzando il sensore basato su FRET ATeam1.03YEMK

Vi presentiamo un protocollo per etichettare e analizzare i neuroni piramidali, che è fondamentale per valutare potenziali alterazioni morfologiche nei neuroni e nelle spine dendritiche che possono essere alla base di anomalie neurochimiche e comportamentali.

Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Impara il metodo del tubo rullo modificato per la coltura a lungo termine di fette di cervello di roditori con imaging ripetitivo ad alta risoluzione. Questa tecnica preserva la viabilità neuronale e consente il monitoraggio delle stesse popolazioni cellulari nel tempo per studiare lo sviluppo neuronale e i disturbi neurodegenerativi.

Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso (Video) | JoVE Journal

Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

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