Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

L'obiettivo generale di questo metodo modificato del tubo a rullo per la coltura di fette cerebrali è quello di fornire un sistema di coltura chiuso per la sopravvivenza a lungo termine delle fette, con la capacità di imaging ripetitivo in florescenza ad alta risoluzione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello sviluppo neuronale e nei disturbi neurodegenerativi che richiedono l'osservazione degli stessi neuroni nel tempo, come la localizzazione delle proteine chiave coinvolte nella formazione o nella perdita delle sinapsi.

I principali vantaggi di questa tecnica sono il sistema di coltura completamente chiuso che consente l'uso sicuro dei virus per l'espressione proteica e l'uso di vetrini coprioggetti fotoincisi per localizzare le stesse cellule per l'imaging. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo coltivando fette su vetrini coprioggetti all'interno di tubi a rullo, ma avevamo bisogno di un modo migliore per visualizzare i cambiamenti che si verificano nelle fette viventi nel tempo. L'uso diffuso di vettori virali per esprimere transgeni e popolazioni cellulari specifiche per l'imaging al microscopio ci ha spinto a sviluppare un sistema chiuso per proteggere gli utenti ed eliminare la contaminazione degli obiettivi del microscopio.

La capacità di seguire nel tempo l'identica popolazione di cellule all'interno di fette di cervello consente studi sullo sviluppo di cambiamenti patologici e alterazione sinaptica in modelli di roditori di disturbi neurologici umani. Per iniziare, preparare la cremagliera del tubo del rullo e creare una maschera per facilitare la perforazione di un foro nei tubi del rullo come descritto nel protocollo di testo allegato. Usando la dima, tenere in posizione un tubo di coltura di plastica di un centimetro, con il lato piatto, in modo che il lato piatto sia rivolto verso l'alto.

Quindi praticare un foro di sei millimetri di diametro con il centro a un centimetro dal fondo e centrato tra i lati del tubo. Con l'utensile di sbavatura girevole, levigare i bordi del foro e praticare quattro scanalature sul bordo interno del foro per facilitare lo svuotamento del foro durante la rotazione. Quindi, sciacquare i tubi con etanolo al 70% e poi asciugarli all'aria in una cabina di sicurezza biologica.

Sterilizzare i tubi in dischi di gomma siliconica adesiva perforati da 12 millimetri per 40 minuti sotto la lampada UV. Dopo 20 minuti riposizionare i tubi e i dischi in modo che tutte le superfici esposte siano sterilizzate. Quindi staccare il supporto bianco dal disco adesivo, allineare i fori e fissare la gomma siliconica all'esterno del tubo.

Una volta ottenute le fette, posizionare due microlitri di plasma di pollo al centro del lato fotoinciso di un vetrino coprioggetti preparato. Allargare leggermente il plasma per ottenere una macchia di tre o quattro millilitri di diametro. Quindi usa una spatola sterile a punta stretta per sollevare una fetta di cervello preparata.

Usa una pinza chiusa per mantenere la fetta sulla punta della spatola mentre sollevi la fetta. Toccare con la spatola la macchia di plasma sul vetrino coprioggetti e con la pinza chiusa spingere la fetta sul vetrino coprioggetti. Aggiungere un sottile strato di plasma di pollo sul vetrino coprioggetti prima di posizionare la fetta e una quantità minima di plasma trattato con trombina per coprire la fetta.

Se la fetta galleggia, non rimarrà aderente quando la nuvola viene rimossa. Successivamente, mescolare 2,5 microlitri di plasma e 2,5 microlitri di trombina in una provetta separata. Posizionare rapidamente 2,5 microlitri di questa miscela sopra e intorno alla fetta e pipettare delicatamente su e giù per mescolarla.

Rimuovere la copertura di plastica trasparente dal lato esposto dell'adesivo in gomma siliconica precedentemente fissato al tubo del rullo. Quindi posizionare il vetrino coprioggetti con la fetta di cervello sull'adesivo allineando la fetta all'interno del foro. Per garantire l'adesione, applicare una pressione morbida e uniforme sul vetrino coprioggetti con il pollice, premendo uniformemente il vetrino coprioggetti verso il basso e tenendolo premuto per circa un minuto mentre lo si trasferisce nella cabina di sicurezza biologica.

La pressione sul vetrino coprioggetti per farlo aderire al tubo senza perdite deve essere giusta e mantenuta abbastanza a lungo da eliminare i canali d'aria nel saliente. Troppa pressione romperà il vetrino. In una cabina di sicurezza biologica, aggiungere 0,8 millilitri di terreno di coltura neurobasale a completo a ciascuna provetta.

Quindi far scorrere una miscela di 5% di anidride carbonica e 95% di aria attraverso una pipetta Pasteur sterile di cotone tappata e tenuta saldamente da una pinza. Utilizzare questa funzione per lavare il tubo del rullo con la miscela di gas e tappare rapidamente il tubo quando viene estratto dalla pipetta. Quindi etichettare le provette con il numero della fetta e il numero del rack.

Inserire le provette in una cremagliera a rulli; garantendo che siano geometricamente equilibrati. Se c'è un numero dispari di tubi, aggiungere tubi vuoti per bilanciare. Posizionare le griglie in un'incubatrice a rulli a 35 gradi Celsius, con i rulli che ruotano la cremagliera a rulli a una velocità compresa tra 10 e 13 giri all'ora.

Inclinare l'incubatrice all'indietro di circa 5 gradi sollevando la parte anteriore su una tavola. Trasferisci una provetta con una coltura a fette in un supporto per provette su misura come quello mostrato qui. Quindi posizionare il supporto del tubo nell'adattatore del tavolino per mantenere il vetrino perpendicolare all'obiettivo durante l'imaging.

Quindi, spingere il cursore sull'adattatore del tavolino contro il tubo per tenerlo in posizione. Utilizzando un obiettivo quattro volte in trans-illuminazione a campo chiaro, mettere a fuoco il periodo della griglia fotoincisa sotto la fetta. Per la sessione di imaging iniziale, eseguire rapidamente la scansione intorno alla fetta per individuare e registrare il numero per le varie regioni in cui si desidera un imaging con ingrandimento più elevato.

Una volta identificate le regioni di interesse, spostare il palco sul primo quadrato della griglia contenente una regione di interesse. Quindi passa all'obiettivo di errore di forza 20 e individua un segno fiduciale. Quindi passa a un obiettivo di potenza superiore, localizza lo stesso segno fiduciale e registra le posizioni x e y del palco.

Sposta il palco per trovare gli altri campi di interesse nelle vicinanze e registra i loro offset x e y dal segno fiducial. Le posizioni di offset consentono di individuare in modo coerente la stessa posizione del vetrino coprioggetto quando si riprende la fetta, anche se l'impostazione originale x, y del segno di riferimento cambia quando il tubo o l'adattatore del tavolino vengono rimossi e sostituiti. Cattura un'immagine Z-stick all'interno di ciascun campo selezionato utilizzando il controllo dell'obiettivo del microscopio o un controllo del tavolino piezoelettrico, se disponibile.

Utilizzando un colorante vitale neuronale, la pila confocale di immagini mostrata qui, evidenzia l'architettura 3D sia dei neuriti che del corpo cellulare, ma la macchia è esclusa dal nucleo. Per esaminare i cambiamenti dipendenti dal tempo nella morfologia della fetta di crescita e nella vitalità all'interno delle fette durante la coltura a lungo termine, la stessa fetta è stata marcata con colorante vitale neuronale fluorescente una volta alla settimana, 24 ore prima dell'imaging. Per dimostrare la riproducibilità dell'imaging delle cellule identiche nel tempo, lo stesso campo di una fetta marcata con colorante vitale neuronale il giorno 13, è stato ripreso nei giorni 14, 15, 16 e 17.

La posizione di tre celle in ogni giorno è indicata da un simbolo sopra il nucleo. Oltre al colorante vitale neuronale, le proteine fluorescenti mediate da virus possono essere utilizzate con questo sistema per marcare le cellule. In questo caso, sia un reporter sensibile al calcio che i bastoncelli contenenti cofilina possono essere identificati chiaramente 10 giorni dopo l'infezione.

L'implementazione di successo di questa procedura richiede la preparazione anticipata di tutti i tubi, i vetrini coprioggetti e le soluzioni. Anche essere in grado di ottenere fette in un breve intervallo post-mortem è fondamentale per il successo e richiede molta pratica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 90 minuti per ottenere 12-18 fette di ippocampo da un cucciolo di topo, compresi i tempi per la dissezione e la piastra.

Seguendo questa procedura, le fette di cervello possono essere infettate in vari momenti con virus per ottenere l'espressione specifica del tipo di cellula di proteine marcate in fluorescenza o il silenzio per l'espressione genica con un piccolo RNA interferente o un RNA a forcina corta per sondare la funzione genica. Non dimenticare che lavorare con i virus ricombinanti può essere pericoloso e che quando si lavora con questi reagenti è necessario prendere sempre precauzioni come indossare una protezione per gli occhi.