Name: Misurare leffetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri come valutare la tossicità chimica su Caenorhabditis elegans per studi di tossicologia e sviluppo farmaceutico. Questo metodo conveniente ed economico permette di misurare effetti su crescita e riproduzione.

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Questo studio è stato sostenuto dall'assegno di ricerca intramurale Korea Institute of Science e Technology (2E27513) e l'alta sul valore aggiunto cibo tecnologia sviluppo programma (IPET) finanziato il Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (315067-03).

Nota: l'intero esperimento deve essere eseguita in un laboratorio isolato pulito mantenuto a 20 ° C con basso accumulo di polvere e con riduzione al minimo della contaminazione durante la movimentazione batterica e vite senza fine. Per questo scopo, esperimenti devono essere eseguiti sotto la fiamma di una lampada di alcol o utilizzando un banco pulito.
 1. manutenzione di c. elegans e uovo preparazione per il Test di chimica <ol><li>Maintain c. elegans N2 (var. Bristol) su una piastra di agar NGM alimentata con live OP50 Escherichia coli a 20 ° C 12 , 13.</li>
	<li>Preparare uova di età-sincronizzati utilizzando candeggina soluzione trattamento 5 o il tempo delle uova di covata metodo 6 , 14 , 15. 
	Nota: prima di preparazione di uovo, cappotto con la piastra NGM etoposide-contenente inattivati OP50 Escherichia coli come descritto di seguito. E. coli inattivati OP50 è utilizzato per ridurre al minimo l'attività metabolica di e. coli 6 , 16.</li>
</ol> 2. Preparazione di inattivati Escherichia coli OP50 al Feed C. elegans durante la prova di tossicità <ol><li>preparare 500 mL di terreno di doppio lievito tryptone (DYT) come descritto nella tabella 1 e inoculare una singola colonia di e. coli OP50 coltivati su un agar di Luria-Bertani (LB) piastra 5.</li>
	<li>Incubare il OP50 di Escherichia coli in un incubatore d'agitazione per 14 h a 37 ° C e 150 giri/min.</li>
	<li>Dopo centrifugazione a 3.220 x g e a 20 ° C per 30 minuti, rimuovere il surnatante tutto DYT mezzo e aggiungere una pre-miscela di 25 mL di buffer di S, 250 µ l di 1 M MgSO 4 e 25 µ l di colesterolo 5 mg/mL (disciolto in etanolo). Tutte queste soluzioni sono sterile.</li>
	<li>Risospendere i batteri e trasferirli in un tubo di plastica usa e getta da 50 mL.</li>
	<li>Per l'inattivazione termica, incubare il sedimento OP50 di Escherichia coli in un bagnomaria per 30 min a 65 ° C.</li>
	<li>Raffreddare fino a temperatura ambiente e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo. Questo può essere immagazzinato per fino a un mese.</li>
</ol> 3. Preparazione di NGM piastre contenenti sia 1% DMSO o 750 µM Etoposide <ol><li>preparare due bottiglie di vetro pulito 200 mL. Aggiungere 0,6 g di NaCl, 0,5 g di peptone, 3,4 g di agar agar e 195 mL di acqua distillata e un agitatore magnetico per una bottiglia. Aggiungere un agitatore magnetico per altre la bottiglia vuota.</li>
	<li>Bottiglie di autoclave questi due per 15 min a 121 ° C e quindi raffreddare le bottiglie in un bagno d'acqua per 30 minuti a 55 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 0,2 mL di 1 M CaCl 2, 0,2 mL di colesterolo 5 mg/mL, 0,2 mL di 1 M MgSO 4 e 5 mL di 1 M KPO 4 (tutte queste soluzioni sono sterili) e poi mescolarle mediante agitazione magnetica su una piastra calda a 55 ° C.</li>
	<li>Dividere il mezzo NGM misto in due bottiglie con lo stesso volume (100 mL ciascuno). Successivamente, aggiungere 1 mL di DMSO per una bottiglia, mescolarlo nuovamente utilizzando l'agitazione magnetica. Conservare l'altra bottiglia in un bagno di acqua a 55 ° C fino al passaggio successivo. Aliquotare 3 mL di terreno contenenti DMSO a ogni 35 x 10 mm 2 piastra di Petri. Circa 33 contenenti DMSO NGM piastre possono essere realizzate da questo passaggio.</li>
	<li>Mescolare l'altra bottiglia utilizzando l'agitazione magnetica, aggiungere 1 mL di 75mm etoposide (stock dissolto in DMSO), mescolare di nuovo e ripetere la procedura di aliquota (punto 3.4). Circa 33 etoposide (750 µM)-contiene tavole NGM può essere fatto da questo passaggio. 
	Nota: In correlato precedente carta 6, abbiamo testato 0, 250, 500 e 1.000 µM di etoposide. Base a tali dati, abbiamo scelto il 750 µM di etoposide dose in questo paper.</li>
	<li>Cool giù le piastre NGM contenenti sostanze chimiche a temperatura ambiente lasciandoli a temperatura ambiente per circa 3 h e conservarli a 4 ° C fino all'utilizzo. 
	Nota: Nel caso di prodotti chimici sensibili alla luce, bloccare la luce per ridurre al minimo la decomposizione indotta dalla luce. 
	Nota: Facoltativamente, rendere un piatto normale di NGM senza prodotti chimici per l'analisi, che può essere eseguita utilizzando due diversi trattamenti chimici condizioni come descritto di seguito di deposizione delle uova.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di e. coli OP50 inattivati al calore (come descritto nella sezione 2) e pubblicizza su ogni piastra NGM. Lasciar asciugare durante la notte in un'incubatrice di c. elegans a 20 ° C per il test chimico</li>
</ol> 4. Misura della crescita di c. elegans <ol><li>trasferimento l' età-sincronizzato di c. elegans uova alla piastra NGM completata con 1% DMSO o 750 µM etoposide.</li>
	<li>Incubare c. elegans in un incubatore a 20 ° C per 4 giorni. Osservare i vermi utilizzando un microscopio stereo e prendere le immagini al microscopio ogni giorno. Solitamente 20 ingrandimenti (obiettivo obiettivo 1x, ingrandimento zoom 2x e obiettivo oculare 10x) sono adatto per l'osservazione di crescita di c. elegans. Anche prendere un'immagine microscopica di micrometro per microscopio per la calibrazione di dimensione verme. 
	Nota: Inedia riguarda il test di tossicità. Di conseguenza, nutrire con batteri sufficienti o regolare il trasferito c. elegans uovo numeri all'inizio. Osservare fino a 3 giorni per escludere la possibilità di morire di fame.</li>
	<li>Misurare la lunghezza di corpo di c. elegans trattati con DMSO o etoposide in ciascun punto di tempo utilizzando il software ImageJ. 
	Nota: Per ogni misurazione del campione, 50 vermi sono sufficienti per l'analisi statistica.
	<ol><li>In ImageJ, aprire l'immagine al microscopio fase micrometro (&#39; File &#39; &#8594; &#39; aperto &#39;). 
		Nota: L'immagine di micrometro e immagini di vite senza fine (passo 4.2) devono essere lo stesso ingrandimento.</li>
		<li>Trascinare una linea di 1.000 µm sull'immagine di calibrazione del micrometro utilizzando &#39; linea retta &#39; strumento.</li>
		<li>Clic &#39; Analyze &#39; &#8594; &#39; Imposta scala &#39; e 1.000 e µm in ingresso il &#39; noto distanza &#39; casella e &#39; unità di lunghezza &#39; scatola, rispettivamente. Verifica &#39; Global &#39; e fare clic su &#39; OK &#39;.</li>
		<li>Aprire le immagini di vite senza fine (&#39; File &#39; &#8594; &#39; aperto &#39;). Disegnare una linea lungo la caratteristica di ogni verme utilizzando &#39; linea a mano libera &#39; strumento. Ottenere i dati di lunghezza del corpo facendo &#39; Analyze &#39; &#8594; &#39; misura &#39;.</li>
		<li>Ripetere questi passaggi per 50 worm.</li>
	</ol></li></ol> 5. C. elegans uovo posa Assay uova <ol><li>Incubare l'età-sincronizzati sul NGM piastra contenente DMSO o etoposide per 64 h (prima della nascita prima) fino allo stadio adulto giovane a 20 ° C. 
	Nota: È facoltativo utilizzare i vermi da esperimenti di misura la crescita. È conveniente fare la misura di crescita e uovo saggio posa insieme.</li>
	Piastre di <li>trasferire 5 vermi adulti per il nuovo NGM senza prodotti chimici (condizione 1, trattamento chimico entro un certo periodo di tempo, dalle uova alla fase adulta giovane) o nuova piastra NGM contenente il pretrattamento chimico stesso (condizione 2, l'esposizione continua di prodotti chimici attraverso il periodo sperimentale nel complesso) e poi li Incubare per 24 h. 
	Nota: Si consiglia di rendere replica utilizzando piastre NGM 3-5 per ogni trattamento; questi replica può essere utilizzato per l'analisi statistica.</li>
	<li>Trasferire alla nuova piastra NGM come descritto sopra e contare il numero di uova ogni giorno. Contare i vermi che strisciò fuori, è deceduto ed erano internamente tratteggioa cura di</li>
	<li>Ripetere questi passaggi fino a quando i vermi non più uova, solitamente in 5 giorni.</li>
	<li>Calcolare il numero di uova deposte a vite senza fine da ogni piatto e sommare questi valori ogni giorno per 5 giorni determinare il numero totale di uova deposte. 
	Nota: Escludere il numero di vermi che strisciò fuori ed internamente covato dal calcolo.</li>
</ol>

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<li>Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+phytochemicals+for+anticancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Lead phytochemicals for anticancer drug development.</a> Front. Plant Sci. 7, 1667(2016).</li>
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<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> J. Vis. Exp. (27), e1152(2009).</li>
<li>Weimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-Glucosamine+supplementation+extends+life+span+of+nematodes+and+of+ageing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice.</a> Nat. Commun. 5, 3563(2014).</li>
<li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK%2Fsirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).</li>
<li>Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+assessment+of+germline+chemical+toxicity+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (96), e52445(2015).</li>
<li>Hahm, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+maximum+velocity+correlates+with+healthspan+and+is+maintained+in+worms+with+an+insulin+receptor+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation.</a> Nat. Commun. 6, 8919(2015).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (95), e52321(2015).</li>
<li>Schmidt, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+acute+and+developmental+neurotoxicity+screening%3A+an+overview+of+cellular+platforms+and+high-throughput+technical+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities.</a> Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).</li>
<li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line.</a> Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo articolo, descriviamo la valutazione della tossicità delle sostanze chimiche in c. elegans, un nematode del terreno, utilizzando etoposide come un esempio di tossico. Per questo scopo, abbiamo utilizzato due condizioni sperimentali. Nel primo set, c. elegans sono state coltivate su etoposide contenente tavole dalle uova alla fase adulta giovane, e quindi i vermi sono stati ammessi a deporre le uova sulle piastre di NGM normale senza prodotti chimici. Nel secondo set sperimentali, c. elegan...

Valutazione tossicologica è essenziale per lo sviluppo di prodotti farmaceutici, nutraceutici e cosmeceutici, come pure la valutazione del rischio di varie tossine ambientali. Il modello di roditore è uno dei più popolari in vivo sistemi sperimentali per questo studio di tossicologia; in alternativa, gli organismi non derivanti da mammiferi come c. elegans sono anche ampiamente utilizzati. Modelli di valutazione tossicologica non derivanti da mammiferi sono favorevoli a causa non solo animale questioni etiche, ma anche la loro convenienza e utilità considerando il rapporto costo-efficacia, manutenibilità, velocità e riproducibilità1,2 ,3,4.
C. elegans, un suolo tondo verme, è stato sfruttato come animale modello in vari ricerca fondamentale e applicata, chimica e biologia. È un lungo 1 mm, trasparente nematode, che semplicemente è tenuto in solido o liquido Nematode crescita Media (NGM) alimentati con il ceppo batterico Escherichia coli OP50. C. elegans ha un ciclo di vita breve, e il selvaggio-tipo N2 c. elegans depone circa 300 uova. Di conseguenza, si propaga facilmente per essere utilizzati come materiali sperimentali3,4,5. C. elegans è stato anche ampiamente utilizzato negli studi tossicologici di molti farmaci e inquinanti ambientali6,7,8,9.
Poiché molti farmaci antitumorali destinazione rapida divisione delle cellule tumorali, essi possono anche danneggiare le cellule normali quali midollo osseo, epitelio intestinale e cellule del follicolo pilifero si dividono rapidamente. Ad esempio, farmaci antitumorali inibitori di topoisomerasi target il processo di replica del DNA delle cellule tumorali; di conseguenza, essi inibiscono anche le cellule normali si dividono rapidamente. Ogni organismo vivente ha le topoisomerasi e questi topoisomerase inibitori più probabile impatto ambientale degli ecosistemi6,10,11. Così, una piattaforma di valutazione tossicologica di droga utilizzando un animale modello è utile per sia lo sviluppo di prodotti farmaceutici e valutazione del rischio ambientale.
In questo articolo, descriviamo i protocolli dettagliati per testare la tossicità di etoposide, che è un agente anticancro di clinico che obiettivi topoisomerasi II, come un prodotto chimico tossico di modello c.elegans. Per questo scopo, descriveremo il metodo di misurazione della dimensione corporea e il numero totale di uova deposte in c. elegans trattati con etoposide.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Affymetrix, USA</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Wild type</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma, USA</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma, USA</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Image J software (ver 1.4)</td><td>Natinoal Institute of Health, USA</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Fotocamera per microscopio</td><td>Jenopitk, Progress Gryphax, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck, USA</td><td>107213</td><td></td></tr><tr><td>35 & volte; 10 mm Piastra di Petri</td><td>SPL Life Sciences, Corea del Sud</td><td>10035</td><td></td></tr><tr><td>90 & 15 mm Petri</td><td>dish SPL Life Sciences, Corea del Sud</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon, Giappone</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Valutazione tossicologica è cruciale per la comprensione degli effetti delle sostanze chimiche sugli organismi viventi nei campi di scienze biologiche di base e applicata. Un suolo non mammiferi tondo verme Caenorhabditis elegans, è un organismo modello prezioso per gli studi di tossicologia grazie alla sua comodità e la mancanza di problemi di etica animale confrontato con sistemi animali mammiferi. In questo protocollo, è descritta una procedura dettagliata di valutazione tossicologica delle sostanze chimiche in c. elegans . Una clinica della droga anticancro, etoposide, che gli obiettivi umani topoisomerasi II e inibisce la replicazione del DNA delle cellule tumorali umane, è stata selezionata come un prodotto chimico di test del modello. Età-sincronizzato di c. elegans uova sono stati esposti a solfossido dimetilico (DMSO) o etoposide, e quindi la crescita di c. elegans è stata monitorata ogni giorno per 4 giorni tramite l'osservazione del microscopio stereo. Il numero totale di uova di cui da c. elegans trattati con DMSO o etoposide è stato contato anche utilizzando il microscopio stereo. Etoposide trattamento significativamente influenzato la crescita e la riproduzione di c. elegans. Tramite il confronto del numero totale di uova deposte da vermi con periodi differenti di trattamento di sostanze chimiche, può essere deciso che la tossicità delle sostanze chimiche sulla riproduzione di c. elegans è reversibile o irreversibile. Questi protocolli possono essere utili per sia lo sviluppo di varie droghe e valutazione del rischio di tossici ambientali.

Il trattamento di etoposide (24-96 h) ha ritardato significativamente la crescita di c. elegans. Dopo 96 h di incubazione, etoposide-trattati worm è cresciuto a 0,86 mm di lunghezza del corpo, mentre i vermi veicolo-trattati è cresciuto a 1,04 mm (Figura 1). Ritardo della crescita è stata osservata anche apparentemente sotto osservazione stereo microscopio (Figura 2). Abbiamo iniziato a vedere le uova dai vermi veicolo-t...

Un protocollo di base per valutare la tossicità delle sostanze chimiche in un animale di modello, elegans di Caenorhabditis, è descritto. Il metodo è conveniente ed utile per lo sviluppo di prodotti farmaceutici anche per quanto riguarda la valutazione del rischio di vari inquinanti ambientali.

Misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'effetto di sostanze chimiche, come l'inibitore della topoisomerasi etoposide, sulla crescita e la riproduzione dell'animale modello Caenorhabditis elegans. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tossicologia, come la valutazione tossicologica per lo sviluppo di farmaci e la valutazione del rischio di sostanze tossiche per l'ambiente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la tossicità di varie sostanze chimiche può essere verificata in sistemi non mammiferi, quindi questa tecnica è conveniente ed economica.A dimostrare la procedura sarà So Young Lee, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare, prepara due bottiglie di vetro pulite da 200 millilitri aggiungendo 0,6 grammi di cloruro di sodio, 0,5 grammi di peptone, 3,4 grammi di agar, 195 millilitri di acqua distillata e un agitatore magnetico a una bottiglia. Quindi aggiungere un agitatore magnetico all'altra bottiglia vuota.Autoclavare le bottiglie per 15 minuti a 121 gradi Celsius, quindi raffreddare le bottiglie a bagnomaria per 30 minuti a 55 gradi Celsius. Successivamente, alla bottiglia piena, aggiungere 0,2 millilitri di cloruro di calcio molare, 0,2 millilitri di colesterolo da cinque milligrammi per millilitro, 0,2 millilitri di solfato di magnesio molare e cinque millilitri di fosfato di potassio molare. Quindi mescolare la soluzione mescolando magneticamente su una piastra calda a 55 gradi Celsius.Versare metà del mezzo NGM miscelato nella bottiglia vuota da 200 millilitri. Quindi aggiungere un millilitro di DMSO a una bottiglia e utilizzare l'agitazione magnetica per mescolare di nuovo. Conservare l'altra bottiglia a bagnomaria a 55 gradi Celsius.Quindi aliquotare tre millilitri del terreno contenente DMSO in piastre di Petri da 35 x 10 millimetri. Togli l'altra bottiglia dal bagnomaria e usa l'agitazione magnetica per mescolarla. Quindi aggiungere un millilitro di etoposide da 75 millimolari.E dopo aver mescolato di nuovo, ripetere la procedura di aliquotazione. Raffreddare le piastre NGM contenenti sostanze chimiche lasciandole a temperatura ambiente per circa tre ore e conservarle a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per il test chimico, distribuire 100 microlitri di E.coli OP50 inattivato termicamente su ciascuna piastra NGM.Lasciare asciugare le piastre per una notte in un'incubatrice di C.elegans a 20 gradi Celsius. Trasferire gli ovuli di C. elegans sincronizzati per l'età in una piastra NGM integrata con DMSO all'1% o etoposide da 750 micromolari. Metti il C.elegans in un'incubatrice a 20 gradi Celsius per quattro giorni.Osserva e scatta immagini microscopiche di C.elegans al microscopio stereoscopico ogni giorno. Inoltre, acquisire un'immagine microscopica del microscopio da tavolino per la calibrazione delle dimensioni del verme. Per misurare la lunghezza corporea di C.elegans trattati con DMSO o etoposide in ogni punto temporale, in ImageJ, aprire l'immagine del micrometro del tavolino del microscopio.Quindi, utilizzando lo strumento Linea retta, trascinare una linea di 1.000 micrometri sull'immagine. Fare clic su Analizza, quindi su Imposta scala e immettere 1.000 e micrometri rispettivamente nelle caselle Distanza nota e Unità di lunghezza. Quindi seleziona Globale e fai clic su OK. Aprire le immagini del worm utilizzando File e quindi Apri.Quindi, utilizzando lo strumento Linea a mano libera, tracciare una linea lungo la caratteristica di ciascun verme. Per ottenere i dati sulla lunghezza del corpo, fare clic su Analizza e quindi su Misura. Ripeti questi passaggi per 50 vermi.Incubare le uova sincronizzate per l'età sulla piastra NGM contenente DMSO o etoposide a 20 gradi Celsius per 64 ore fino allo stadio di giovane adulto. Trasferire cinque vermi adulti su nuove piastre NGM senza sostanze chimiche o nuove piastre NGM contenenti lo stesso pretrattamento chimico e incubarli per 24 ore. Trasferisci gli adulti su nuove piastre NGM, come appena dimostrato, e conta il numero di uova ogni giorno.Inoltre, conta i vermi che sono strisciati via, sono morti o si sono schiusi internamente. Eseguire calcoli secondo il protocollo di testo. Come mostrato qui, il trattamento con etoposide a 24-96 ore ha ritardato significativamente la crescita di C.elegans.Dopo 96 ore di incubazione, i vermi trattati con etoposide sono cresciuti fino a 0,86 millimetri di lunghezza corporea, mentre i vermi trattati con veicolo sono cresciuti fino a 1,04 millimetri. Il ritardo della crescita è stato osservato anche sotto osservazione al microscopio stereoscopico, come si vede in queste immagini di vermi trattati con etoposide, rispetto ai vermi trattati con controllo. Dopo 72 ore di incubazione, sono state osservate le uova dei vermi trattati con il veicolo.Al contrario, gli ovuli sono stati osservati dopo 96 ore di trattamento con etoposide, sollevando la possibilità che il trattamento con etoposide abbia ritardato il primo momento di nascita di C.Elegans. Come illustrato in questi grafici, è stata osservata una diminuzione del numero totale di uova mediante trattamento con etoposide quando i giovani vermi adulti sono stati coltivati, in presenza o in assenza di un trattamento continuo con etoposide. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se eseguita correttamente.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la tossicità chimica in C.elegans, un nematode modello.

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