Il transwell migration assay
La migrazione delle cellule in risposta a segnali chimici è cruciale per lo sviluppo, l'immunità e gli stati patologici come il cancro. Per quantifica…
Il test di migrazione transwell è una tecnica classica che consente agli scienziati di quantificare il movimento cellulare. La migrazione si riferisce alla capacità di una cella di spostarsi singolarmente o in cluster. I movimenti cellulari sono resi possibili attraverso una precisa ristrutturazione del loro citoscheletro e la migrazione di solito avviene in risposta a stimoli che fungono da segnali.
Oggi discuteremo il test di migrazione transwell, che utilizza una semplice configurazione della camera per valutare la migrazione in risposta ai segnali di attrazione.
Inizieremo fornendo alcune informazioni di base sulla camera transwell.
L'apparato è stato progettato per la prima volta dal Dr. Stephen Boyden nel 1961, che lo ha usato per studiare la migrazione dei leucociti. Pertanto, questo metodo è anche noto come test della camera di Boyden.
In una semplice camera di Boyden, la parete esterna è dei pozzi, come quelli di una piastra a 96 pozzi. All'interno di ogni pozzetto, viene posizionato un transwell, che è un inserto cilindrico. L'inserto ha una membrana in policarbonato di una dimensione dei pori definita. Quando viene posizionato nel pozzo, divide la camera in due scomparti. Il compartimento superiore è dove verranno seminate le cellule il cui comportamento migratorio deve essere studiato e il serbatoio inferiore è dove viene posizionata la soluzione di chemioattrattivo. Per definizione, un chemioattrattante è una molecola che ha la capacità di promuovere la motilità cellulare "attirando le cellule".
A causa di queste forze attrattive, le cellule nel compartimento superiore migrano attraverso i pori nel serbatoio inferiore. Se le cellule hanno proprietà aderenti, come alcune cellule di melanoma, dopo il movimento si "attaccheranno" alla parte inferiore della membrana. In questo caso, la membrana può essere fissata, macchiata e le cellule possono essere contate al microscopio. D'altra parte, le cellule non aderenti, come lo sperma, migreranno nel serbatoio inferiore. In questo caso, le cellule nella soluzione del serbatoio possono essere contate con l'aiuto di un emocitometro.
Sebbene la configurazione per questo test sia semplice, ci sono diverse cose che è necessario considerare prima dell'esperimento. Esaminiamo alcuni di loro.
A partire dalla soluzione di semina, è necessario assicurarsi che la densità sia ottimizzata per osservare la migrazione cellulare. Troppo poche cellule possono provocare una migrazione non rilevabile e densità maggiori sovrappopolano la membrana, rendendo difficile enumerare la migrazione. La seconda considerazione è la dimensione dei pori dell'inserto. Dovrebbe essere scelto con cura a seconda del tipo di cella. Se la dimensione dei pori è troppo piccola, le cellule non saranno in grado di passare.
In alternativa, se la dimensione dei pori è troppo grande, le cellule cadranno semplicemente, il che non è migrazione. Infine, bisogna essere consapevoli della concentrazione di chemioattrattari e del tempo di incubazione da tenere per la migrazione, poiché questi sono interdipendenti. La concentrazione ottimale con un tempo di incubazione appropriato durante il quale viene mantenuto il gradiente di concentrazione tra i compartimenti, induce la migrazione cellulare a causa della chemio-attrazione. Al contrario, le incubazioni prolungate possono essere accompagnate da un equilibrio di chemioattrattante in tutta la camera che porta alla perdita di gradiente chimico, che può confondere l'analisi dei risultati ottenuti.
Con queste considerazioni in mente, discutiamo di un protocollo utilizzato per misurare la migrazione delle cellule aderenti.
Le cellule da dosare sono preparate in un mezzo privo di proteasi, poiché le proteasi possono denaturare importanti recettori di membrana e, in ultima analisi, influenzare la migrazione. Dopo che le cellule sono state preparate, la sospensione deve essere diluita a una densità di semina ottimale. Per preparare la camera, i pozzetti trans sono posti in pozzetti su una piastra multiwell. La sospensione cellulare deve essere pipettata nel vano trans senza toccare la membrana o introdurre bolle d'aria.
La soluzione di chemioattante viene pipettata nel serbatoio inferiore, assicurandosi che la soluzione tocchi la membrana dell'inserto. Il tempo di incubazione per la migrazione dipenderà dalle considerazioni sperimentali. Dopo l'incubazione, le membrane vengono fissate immergendo l'inserto nel 70% di etanolo. Dopo aver permesso all'inserto di asciugarsi, viene aggiunta la soluzione di colorazione cellulare.
Successivamente, le cellule vengono incubate per circa 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, gli inserti vengono lavati con l'aiuto del tampone di lavaggio. Infine, la membrana può essere asportata e posizionata su un vetrino per microscopio. Le cellule sul lato inferiore della membrana rappresentano il numero di cellule che sono migrate in presenza e assenza di chemioattrattivi.
Dal momento che, ora hai un'idea del protocollo, diamo una breve occhiata a come i ricercatori stanno usando questo metodo nelle loro esplorazioni.
Una delle applicazioni più comuni di questo test è quella di valutare le proprietà chemioattrattarie di composti sconosciuti. Qui, gli scienziati erano interessati a esaminare i percorsi di nuoto degli spermatozoi di rana in presenza di allurina, che è una sostanza secreta dalle uova di anfibio. Per fare questo, hanno prima pipettato gli spermatozoi di rana attivi nella parte superiore degli inserti transwell. In fondo, hanno aggiunto allurina. Dopo aver permesso alle cellule di migrare, hanno contato gli spermatozoi nella soluzione del serbatoio al microscopio. Usando questa tecnica, sono stati in grado di generare una curva concentrazione-risposta che raffigura l'effetto della concentrazione di allurina sulla migrazione degli spermatozoi.
Quando una cellula viene attaccata da agenti patogeni, invia chemioattrattivi per reclutare cellule immunitarie che migrano, si attaccano e successivamente risolvono le infezioni. Per testare questo fenomeno, questi scienziati hanno coltivato cellule epiteliali sul lato inferiore degli inserti. Successivamente, hanno infettato queste cellule con diversi ceppi di batteri. Infine, hanno introdotto cellule immunitarie nella camera superiore. È noto che le cellule infette producono diversi chemioattrattivi che inducono la migrazione delle cellule immunitarie. I risultati di questo esperimento hanno dimostrato diversi gradi di migrazione dei neutrofili in risposta a diversi tipi di infezione batterica.
Infine, l'invasione delle cellule tumorali e le metastasi attraverso la matrice extracellulare hanno sempre incuriosito i biologi cellulari. Qui, gli scienziati volevano determinare come specifici chemioattrattivi possono contribuire a tale migrazione attraverso una matrice 3D. Hanno geneticamente modificato due pool separati di cellule: uno che esprime una proteina fluorescente verde e un'altra fluorescente rossa. Hanno quindi pipettato una matrice extracellulare mimica verso la parte superiore dei transwell.
Una volta solidificati, hanno invertito il transwell e seminato due pool di cellule nella parte inferiore della membrana. Successivamente, hanno sostituito l'inserto nella piastra multiwell e pipettato la soluzione chemioatttante nella camera superiore. Ciò ha causato lo spostamento delle celle nella parte inferiore verso l'alto e attraverso la matrice 3D. Con l'aiuto dell'imaging confocale, questi ricercatori hanno ricostruito la migrazione cellulare in 3D e hanno distinto i modelli di migrazione di due gruppi di cellule.
Hai appena visto il video di JoVE sul test di migrazione transwell. Con la comprensione dei componenti e del protocollo di questo metodo, ora sai perché è così ampiamente usato dai biologi cellulari. Nonostante la semplicità di questa configurazione, la gamma di configurazioni che questo metodo può adattare lo rende indispensabile per gli studi di motilità cellulare. Come sempre, grazie per aver guardato!
Il test di migrazione transwell è una tecnica classica che consente agli scienziati di quantificare il movimento cellulare. La migrazione si riferisce alla capacità di una cella di spostarsi singolarmente o in cluster. I movimenti cellulari sono resi possibili attraverso una precisa ristrutturazione del loro citoscheletro e la migrazione di solito avviene in risposta a stimoli che fungono da segnali.
Oggi discuteremo il test di migrazione transwell, che utilizza una semplice configurazione della camera per valutare la migrazione in risposta ai segnali di attrazione.
Inizieremo fornendo alcune informazioni di base sulla camera transwell.
L'apparato è stato progettato per la prima volta dal Dr. Stephen Boyden nel 1961, che lo ha usato per studiare la migrazione dei leucociti. Pertanto, questo metodo è anche noto come test della camera di Boyden.
In una semplice camera di Boyden, la parete esterna è dei pozzi, come quelli di una piastra a 96 pozzi. All'interno di ogni pozzetto, viene posizionato un transwell, che è un inserto cilindrico. L'inserto ha una membrana in policarbonato di una dimensione dei pori definita. Quando viene posizionato nel pozzo, divide la camera in due scomparti. Il compartimento superiore è dove verranno seminate le cellule il cui comportamento migratorio deve essere studiato e il serbatoio inferiore è dove viene posizionata la soluzione di chemioattrattivo. Per definizione, un chemioattrattante è una molecola che ha la capacità di promuovere la motilità cellulare "attirando le cellule".
A causa di queste forze attrattive, le cellule nel compartimento superiore migrano attraverso i pori nel serbatoio inferiore. Se le cellule hanno proprietà aderenti, come alcune cellule di melanoma, dopo il movimento si "attaccheranno" alla parte inferiore della membrana. In questo caso, la membrana può essere fissata, macchiata e le cellule possono essere contate al microscopio. D'altra parte, le cellule non aderenti, come lo sperma, migreranno nel serbatoio inferiore. In questo caso, le cellule nella soluzione del serbatoio possono essere contate con l'aiuto di un emocitometro.
Sebbene la configurazione per questo test sia semplice, ci sono diverse cose che è necessario considerare prima dell'esperimento. Esaminiamo alcuni di loro.
A partire dalla soluzione di semina, è necessario assicurarsi che la densità sia ottimizzata per osservare la migrazione cellulare. Troppo poche cellule possono provocare una migrazione non rilevabile e densità maggiori sovrappopolano la membrana, rendendo difficile enumerare la migrazione. La seconda considerazione è la dimensione dei pori dell'inserto. Dovrebbe essere scelto con cura a seconda del tipo di cella. Se la dimensione dei pori è troppo piccola, le cellule non saranno in grado di passare.
In alternativa, se la dimensione dei pori è troppo grande, le cellule cadranno semplicemente, il che non è migrazione. Infine, bisogna essere consapevoli della concentrazione di chemioattrattari e del tempo di incubazione da tenere per la migrazione, poiché questi sono interdipendenti. La concentrazione ottimale con un tempo di incubazione appropriato durante il quale viene mantenuto il gradiente di concentrazione tra i compartimenti, induce la migrazione cellulare a causa della chemio-attrazione. Al contrario, le incubazioni prolungate possono essere accompagnate da un equilibrio di chemioattrattante in tutta la camera che porta alla perdita di gradiente chimico, che può confondere l'analisi dei risultati ottenuti.
Con queste considerazioni in mente, discutiamo di un protocollo utilizzato per misurare la migrazione delle cellule aderenti.
Le cellule da dosare sono preparate in un mezzo privo di proteasi, poiché le proteasi possono denaturare importanti recettori di membrana e, in ultima analisi, influenzare la migrazione. Dopo che le cellule sono state preparate, la sospensione deve essere diluita a una densità di semina ottimale. Per preparare la camera, i pozzetti trans sono posti in pozzetti su una piastra multiwell. La sospensione cellulare deve essere pipettata nel vano trans senza toccare la membrana o introdurre bolle d'aria.
La soluzione di chemioattante viene pipettata nel serbatoio inferiore, assicurandosi che la soluzione tocchi la membrana dell'inserto. Il tempo di incubazione per la migrazione dipenderà dalle considerazioni sperimentali. Dopo l'incubazione, le membrane vengono fissate immergendo l'inserto nel 70% di etanolo. Dopo aver permesso all'inserto di asciugarsi, viene aggiunta la soluzione di colorazione cellulare.
Successivamente, le cellule vengono incubate per circa 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, gli inserti vengono lavati con l'aiuto del tampone di lavaggio. Infine, la membrana può essere asportata e posizionata su un vetrino per microscopio. Le cellule sul lato inferiore della membrana rappresentano il numero di cellule che sono migrate in presenza e assenza di chemioattrattivi.
Dal momento che, ora hai un'idea del protocollo, diamo una breve occhiata a come i ricercatori stanno usando questo metodo nelle loro esplorazioni.
Una delle applicazioni più comuni di questo test è quella di valutare le proprietà chemioattrattarie di composti sconosciuti. Qui, gli scienziati erano interessati a esaminare i percorsi di nuoto degli spermatozoi di rana in presenza di allurina, che è una sostanza secreta dalle uova di anfibio. Per fare questo, hanno prima pipettato gli spermatozoi di rana attivi nella parte superiore degli inserti transwell. In fondo, hanno aggiunto allurina. Dopo aver permesso alle cellule di migrare, hanno contato gli spermatozoi nella soluzione del serbatoio al microscopio. Usando questa tecnica, sono stati in grado di generare una curva concentrazione-risposta che raffigura l'effetto della concentrazione di allurina sulla migrazione degli spermatozoi.
Quando una cellula viene attaccata da agenti patogeni, invia chemioattrattivi per reclutare cellule immunitarie che migrano, si attaccano e successivamente risolvono le infezioni. Per testare questo fenomeno, questi scienziati hanno coltivato cellule epiteliali sul lato inferiore degli inserti. Successivamente, hanno infettato queste cellule con diversi ceppi di batteri. Infine, hanno introdotto cellule immunitarie nella camera superiore. È noto che le cellule infette producono diversi chemioattrattivi che inducono la migrazione delle cellule immunitarie. I risultati di questo esperimento hanno dimostrato diversi gradi di migrazione dei neutrofili in risposta a diversi tipi di infezione batterica.
Infine, l'invasione delle cellule tumorali e le metastasi attraverso la matrice extracellulare hanno sempre incuriosito i biologi cellulari. Qui, gli scienziati volevano determinare come specifici chemioattrattivi possono contribuire a tale migrazione attraverso una matrice 3D. Hanno geneticamente modificato due pool separati di cellule: uno che esprime una proteina fluorescente verde e un'altra fluorescente rossa. Hanno quindi pipettato una matrice extracellulare mimica verso la parte superiore dei transwell.
Una volta solidificati, hanno invertito il transwell e seminato due pool di cellule nella parte inferiore della membrana. Successivamente, hanno sostituito l'inserto nella piastra multiwell e pipettato la soluzione chemioatttante nella camera superiore. Ciò ha causato lo spostamento delle celle nella parte inferiore verso l'alto e attraverso la matrice 3D. Con l'aiuto dell'imaging confocale, questi ricercatori hanno ricostruito la migrazione cellulare in 3D e hanno distinto i modelli di migrazione di due gruppi di cellule.
Hai appena visto il video di JoVE sul test di migrazione transwell. Con la comprensione dei componenti e del protocollo di questo metodo, ora sai perché è così ampiamente usato dai biologi cellulari. Nonostante la semplicità di questa configurazione, la gamma di configurazioni che questo metodo può adattare lo rende indispensabile per gli studi di motilità cellulare. Come sempre, grazie per aver guardato!
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Q1: What is the transwell migration assay and why is it used in cell biology?
The transwell migration assay, also called the Boyden chamber assay, is a classical technique designed in 1961 to quantify cell movement in response to chemical cues. It uses a simple chamber setup with a polycarbonate membrane separating two compartments. Scientists seed cells in the top chamber and place chemoattractant solution below, then count migrated cells to measure cell motility and cell invasion and chemo attraction responses.
Q2: How does the transwell chamber separate cells and chemoattractants?
The transwell chamber consists of a cylindrical insert with a polycarbonate membrane of defined pore size placed inside a multiwell plate well. This membrane divides the chamber into two compartments: the top compartment holds cells to be studied, and the bottom reservoir contains chemoattractant solution. Cells migrate through the membrane pores toward the attracting chemical gradient in the lower compartment.
Q3: What factors must be optimized before running a transwell migration assay?
Three critical factors require optimization: cell seeding density must be balanced to detect migration without overpopulation; pore size must match the cell type so cells can pass through without falling through; and chemoattractant concentration with appropriate incubation time must maintain a chemical gradient. Prolonged incubation can equilibrate the chemoattractant throughout the chamber, eliminating the gradient and confounding results.
Q4: How are adherent cells counted after migration in a transwell assay?
After incubation, the transwell membrane is fixed by dipping the insert into 70% ethanol and allowed to dry. Cell staining solution is then applied for approximately 30 minutes at room temperature. Following washing with buffer, the membrane is excised and placed on a microscope slide. Cells on the membrane's underside represent those that migrated and can be counted microscopically.
Q5: Why is protease-free medium used when preparing cells for the transwell assay?
Protease-free medium is essential because proteases can denature important membrane receptors that are critical for cell migration. Damaged receptors would impair the cell's ability to respond to chemoattractant signals, compromising the accuracy of migration measurements and potentially underestimating or misrepresenting the cell's true migratory capacity.
Q6: What are common research applications of the transwell migration assay?
Researchers use the transwell assay to evaluate chemoattractant properties of unknown compounds, test immune cell recruitment in response to infection, and study cancer cell invasion through extracellular matrices. The assay's adaptability allows scientists to examine migration in various contexts, from simple 2D membrane assays to complex 3D matrix invasion studies using fluorescent cell tracking.
Q7: How do adherent and non-adherent cells differ in transwell migration assays?
Adherent cells, like melanoma cells, stick to the membrane's underside after migration and are counted by fixing, staining, and microscopic observation of the membrane. Non-adherent cells, like sperm, migrate into the bottom reservoir solution and are counted using a hemocytometer. The counting method depends on the cell type's inherent adhesive properties.