Multiplex Cytokine Profilatura degli Splenocytes stimolati Mouse utilizzando una piattaforma basata su Cytometric Bead Immunoassay

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare più bersagli di citochine contemporaneamente in surnatanti di coltura tissutale raccolti da splenociti di topo stimolati utilizzando un test immunologico basato su biglie multiplex e un citometro a flusso. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio, quali sono i profili di citochine unici che orchestrano la risposta immunitaria nel contesto di specifici stati patologici? Il vantaggio principale di questa tecnica è che la quantificazione simultanea di più anellidi può essere eseguita utilizzando volumi di campione molto inferiori rispetto ai formati ELISA tradizionali, riducendo allo stesso tempo il legame aspecifico.

A dimostrare la procedura sarà Nicholas Johnsen, un ricercatore associato del nostro team di sviluppo prodotti. Iniziare questa procedura con la preparazione del campione biologico come descritto nel protocollo di testo. Per preparare le perle premiscelate immobilizzate con anticorpi, sonicare il flacone di perle premiscelate per un minuto in un bagno di sonicatore a temperatura ambiente.

Quindi vorticare per 30 secondi prima dell'uso. Se non è disponibile alcun bagno di sonicazione, aumentare il tempo di vortice a un minuto. Per la preparazione standard, aggiungere 250 microlitri di tampone di saggio per ricostituire il cocktail liofilizzato di citochine Th di topo standard.

Mescolare agitando brevemente e lasciare riposare la fiala a temperatura ambiente per 10 minuti. Trasferire il cocktail standard in una provetta da microcentrifuga in polipropilene etichettata C7. Questo sarà utilizzato come standard superiore. Etichettare sei provette per microcentrifuga in polipropilene da C1 a C6. Aggiungere 75 microlitri di tampone per test a ciascuna di queste provette.

Quindi, trasferire 25 microlitri dello standard superiore, C7, nel tubo C6 e mescolare bene a vortex. Questo sarà lo standard C6. Continuate a eseguire da una a quattro diluizioni seriali, utilizzando un nuovo puntale per pipetta per ogni provetta per aggiungere 25 microlitri dello standard precedente ai 75 microlitri di tampone del saggio nella provetta standard più bassa successiva.

Segui ogni aggiunta con un vortice. Utilizzare il tampone di analisi come standard di zero picogrammi per millilitro. Per eseguire il test, lasciare che tutti i reagenti si riscaldino a temperatura ambiente prima dell'uso.

In questa dimostrazione vengono utilizzate piastre filtranti in polipropilene. È assolutamente essenziale che la piastra sia mantenuta in posizione verticale durante l'intera procedura di analisi, comprese le fasi di lavaggio, per evitare di perdere le perle. Pre-bagnare la carta da filtro aggiungendo 100 microlitri di tampone di lavaggio 1X a ciascun pozzetto e lasciare riposare le piastre per un minuto a temperatura ambiente.

Rimuovere il volume del tampone utilizzando il collettore del vuoto. Eliminare il tampone di lavaggio in eccesso dal fondo della piastra premendo la piastra su una pila di salviette di carta pulite. Quindi, posizionare la piastra sopra il coperchio della piastra rovesciata.

Per i campioni di surnatante per colture cellulari, aggiungere 25 microlitri di tampone per il saggio a tutti i pozzetti. Aggiungere 25 microlitri di ogni standard ai pozzetti standard. Infine, aggiungere 25 microlitri di ciascun campione ai pozzetti del campione.

Agitare le perle miste per 30 secondi. Quindi, aggiungere 25 microlitri di perline miscelate a ciascun pozzetto, agitando il flacone di perline a intermittenza per evitare che le perle si depositino. Sigillare la piastra con un sigillante per piastre.

Una volta sigillata, avvolgere l'intera piastra, compreso il coperchio della piastra rovesciata, con un foglio di alluminio. Posizionare la piastra su uno shaker, fissarla e agitare a circa 500 giri/min per due ore a temperatura ambiente. Senza invertire, posizionare la piastra sul collettore del vuoto e applicare il vuoto come prima.

Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio 1X a ciascun pozzetto. Rimuovere il contenuto dei pozzetti della piastra di saggio mediante filtrazione sotto vuoto. Tamponare il tampone di lavaggio in eccesso dal fondo della piastra con un tampone assorbente o della carta assorbente prima di ripetere questo passaggio ancora una volta.

Quindi, aggiungere 25 microlitri di anticorpi di rilevamento a ciascun pozzetto. Dopo aver sigillato la piastra con un sigillante per piastre nuovo, avvolgere l'intera piastra, compreso il coperchio della piastra rovesciata, con un foglio di alluminio. Posizionare la piastra su uno shaker per piastre e agitare a circa 500 giri/min per un'ora a temperatura ambiente.

Senza passare l'aspirapolvere, aggiungere 25 microlitri di reagente streptavidina ficoeritrina direttamente in ciascun pozzetto. Sigillare e avvolgere il piatto come prima. Quindi, posizionare la piastra su uno shaker e agitare a circa 500 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver ripetuto due volte la fase di filtrazione sottovuoto, aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio 1X a ciascun pozzetto. Risospendere le perle su uno shaker per un minuto. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire i campioni dalla piastra filtrante alle provette FACS per leggere i campioni su un citometro a flusso.

Avviare il citometro a flusso e il software di acquisizione secondo le istruzioni del produttore fornite con lo strumento. Creare un grafico a punti con dispersione diretta sull'asse X e dispersione laterale per l'asse Y. Imposta la dispersione diretta e la dispersione laterale sulla modalità lineare.

Agitare la fiala di perle grezze inclusa nel kit per 30 secondi per risospendere le perline. Trasferire 400 microlitri di perle grezze in un nuovo tubo FACS. Impostare la portata del citometro a flusso su un valore basso.

Far funzionare le perle grezze, regolando attentamente il guadagno e la tensione per la dispersione diretta e la dispersione laterale in modo che entrambe le popolazioni di dimensioni di queste perle siano visibilmente separate e facili da controllare. Regolare la soglia di dispersione diretta per escludere eventi indesiderati. Nel grafico a dispersione diretta rispetto a quella laterale, disegnare un gate che includa tutte le popolazioni di perline.

Visualizzare le popolazioni di gated bead dal grafico a dispersione diretta rispetto a quello a dispersione laterale sul secondo grafico a punti con PE sull'asse X e APC per l'asse Y. Regolare la tensione PMT per il canale di fluorescenza APC in modo che il segnale APC per tutte le popolazioni di microsfere abbia un'intensità di fluorescenza mediana, o MFI, compresa tra 10 e 5.000. Quindi, agitare la fiala di perline di configurazione in PE per 30 secondi per risospendere le perline.

Trasferire 400 microlitri di perle di PE ri-sospese in un nuovo tubo FACS. Sostituire il tubo delle perle grezze nel citometro a flusso con il tubo delle perle in PE. Regolare la tensione del tubo fotomoltiplicatore per l'impostazione del canale di fluorescenza PE in modo che l'MFI delle perle di PE rientri nell'intervallo specifico del lotto indicato sulla fiala delle perline di PE.

Per eseguire l'acquisizione dei dati, impostare il numero di eventi del bead da acquisire a circa 300 per anolyte. Agitare ogni campione per cinque secondi prima dell'analisi. Quindi, leggi gli esempi.

Durante la lettura dei campioni, impostare prima il citometro a flusso in modalità di configurazione e attendere che la popolazione di microsfere si stabilizzi prima di passare alla modalità di acquisizione. Esporta solo gli eventi controllati anziché gli eventi totali prima di eseguire l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. Le curve standard rappresentative per gli anoliti target sono state generate utilizzando il pannello di citochine T helper di topo.

I saggi eseguiti correttamente dimostreranno curve con ampi intervalli dinamici, come mostrato qui. Le curve standard devono essere eseguite ogni volta che viene eseguito il saggio. Gli splenociti di topo sono stati coltivati in varie condizioni per 48 ore.

Sono stati raccolti i surnatanti di coltura, quindi sono state quantificate le concentrazioni di 13 bersagli utilizzando il pannello di citochine T helper di topo. I profili differenziali di espressione delle citochine, in risposta alle condizioni di stimolazione, sono chiaramente visibili. Una volta padroneggiata, la tecnica di laboratorio di questa tecnica può essere completata in meno di cinque ore e mezza se eseguita correttamente.

I tempi di acquisizione dei dati e di analisi a valle variano a seconda del numero di campioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo protocollo, quantificare le concentrazioni di anoliti in campioni biologici utilizzando un test immunologico citometrico basato su microsfere. Ciò include la preparazione dei reagenti, le fasi di incubazione e la configurazione del citometro a flusso per l'acquisizione dei dati.