Name: Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Scopri la dissezione e la colorazione whole-mount di silique e fiori di Arabidopsis per studiare lo sviluppo riproduttivo. Questo metodo consente lo screening rapido di molteplici stadi di sviluppo in biologia vegetale.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Università di Zurigo, un IEF Marie Curie Grant (grant no. TransEpigen-254797 di A.H.), un Advanced Grant del Consiglio europeo della ricerca (grant no. Medea-250358 di U.G.) e un progetto di ricerca e sviluppo tecnologico (grant MecanX a U.G.) da SystemsX.ch, l'iniziativa Svizzera in biologia dei sistemi.

1. fiore e anemofila fissazione
<ol><li>Silique da piante e fiori raccolto sincronizzate all'apertura del primo fiore. Nota: Nelle circostanze sperimentali utilizzati qui, piante iniziano la fioritura circa 21 giorni dopo il trapianto da piastre di Murashige e Skoog (MS) al suolo. Semi sono stratificate per 3 – 4 giorni a 4 ° C e germinato/coltivate su piastre di MS a 22 ° C/16 h luce e 18 ° C/8 h scura per 8 a 10 giorni, prima del trapianto le piantine sul suolo ricco di sostanze nutritive in vasi tenuti sotto le stesse condizioni (Figura 1). Il numero delle ripetizioni dipende l'obiettivo specifico della ricerca, ma è consigliabile un minimo di 5 infiorescenze (da 5 piante individuali) per ogni trattamento. Se i fiori sono l'unità sperimentale, si raccomanda un minimo di 10 fiori per replicare.</li>
	<li>Tagliare le infiorescenze o fiori (Figura 1E-H) utilizzando forbici piccole (ad es., forbicine per le unghie) e metterli immediatamente in un tubo del microcentrifuge (per la fissazione di infiorescenza/fiore singolo) o un tubo conico (per le fissazioni collettive) che contiene appena fatta di Carnoy, metanolo/acido acetico o FPA50 fissativi (a seconda dell'applicazione, vedere di seguito) sul ghiaccio. Nota: I campioni dovrebbero essere completamente sommerso nel fissativo.</li>
	<li>Lasciare il tessuto all'interno il fissativo per 4 h a tutta la notte a 4 ° C. Nota: L'infiltrazione di vuoto può essere utilizzato per accelerare la penetrazione del fissativo nel tessuto, ma questo può essere dannoso per preservare la struttura del tessuto. Gli autori non implementano infiltrazione vuoto.</li>
	<li>Rimuovere il fissativo, aggiungere abbastanza etanolo al 70% per coprire i campioni e restituirli a 4 ° C per almeno 24 h; campioni possono rimanere a tempo indeterminato in questa soluzione. Dopo la rimozione dell'etanolo, procedere immediatamente alla fase successiva; dissezione o schiarimento di SDS.</li>
</ol>2. dissezione sotto lo stereomicroscopio
<ol><li>Messo appena fatte etanolo al 70% in vetro di un orologiaio, collocato su un piccolo piatto di Petri per supporto.</li>
	<li>
Posto l'infiorescenza/fiore/anemofila su questo appena reso fissativo e sezionare sotto lo stereomicroscopio usando pinze e una siringa con un ago.
	<ol>
<li>Utilizzare di un orologiaio vetro o un dispositivo simile che consente di essere totalmente coperto con etanolo (consigliato) per la dissezione delle infiorescenze e lacerando organi floreali di fiori maturi (sepali, petali e stami può essere sezionato in questa fase i campioni ) per evitare il rischio di campioni secchi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sezionare la silique e piccoli boccioli di fiori su una diapositiva come descritto di seguito.
	<ol>
<li>Mettere da parte il vetro di orologiaio con campioni pre-trattati e utilizzare una normale diapositiva per la dissezione finale.</li>
		<li>Spostare il campione di interesse alla diapositiva e aggiungere 10 µ l di etanolo al 70%. Lavora velocemente sulla dissezione finale e aggiungere 10 µ l di etanolo, se necessario, per mantenere il campione umido senza liquido in eccesso.</li>
		<li>Per il rilascio di granuli di polline da stami, vedi punto 5.1. Per la dissezione carpelli ed ovuli, seguire la procedura descritta nella Figura 2. Questa procedura si applica a tutte le fasi di sviluppo del carpello, compresa la fase di sviluppo di silique verde. Nota: Non aggiungere etanolo se c'è sufficiente al riporto di etanolo dal movimento dei campioni; campioni molto piccoli di dissezione è molto più facile in una minima quantità di liquido. Tenere sempre solo gli organi di interesse (sepali, petali, stami, carpelli, ovuli, semi o grani di polline) sulla diapositiva. Questa procedura garantisce uno spessore uniforme tra la diapositiva e il vetrino coprioggetti, corrispondente allo spessore dell'organo in esame, risultante in una maggiore omogeneità e quindi l'efficienza per gli esami al microscopio (maggior numero di esemplari di destinazione sullo stesso piano focale).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare un piccolo pezzo di carta assorbente per assorbire e rimuovere quanto più etanolo come possibile. Rapidamente, procedere al passaggio successivo (sezione 3, 4 o 6) prima il campione si asciuga fuori.</li>
</ol>3. base di idrato di cloralio schiarimento e combinato di schiarimento-colorazione
Nota: I migliori risultati per schiarimento basati su cloralio idrato si ottengono con FPA50 fissata materiale.
<ol><li>Posto 20 µ l di soluzione di compensazione (cloralio idrato/glicerolo, modificato medio di Hoyer, 4½ di Herr o soluzioni IKI-4½ di Herr) sulla diapositiva esemplare-cuscinetto. Usando un paio di siringhe con aghi hypodermal, posizionare i campioni secondo le necessità di ridurre lo spazio tra di loro e lanciando quelli dove l'organo di interesse si affaccia verso il basso. Rimuovere qualsiasi bolla d'aria rimanente utilizzando l'ago.</li>
	<li>Abbassare un vetrino coprioggetti lateralmente e delicatamente posizionarlo, premendo molto delicatamente e attendere che la soluzione di schiarimento riempie lo spazio in mezzo. Aggiungere la soluzione di compensazione minima, se necessario, per riempire tutto lo spazio sotto il vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Porre il vetrino su un supporto per diapositive e lasciarlo sotto la cappa. Procedere per le osservazioni al microscopio dopo almeno 4 ore e durante i seguenti 4 – 5 giorni.</li>
</ol>4. combinato Alexander di colorazione e Herr 4½ schiarimento delle antere
Nota: Il protocollo originale di Alexander si basa sul rilascio di granuli di polline sulla diapositiva prima della colorazione. Un efficiente e più informativo, Alexander macchiatura e procedura di cancellazione è la colorazione dei granuli di polline maturi all'interno antere maturi ma non deiscenti per volta.
<ol><li>Scegliere appena raccolte boccioli di fiori che sta tentando di aprire con antere non deiscenti. Nota: Non prendere più giovani germogli di fiore perché Alexander macchiatura è inteso per i grani di polline maturi e non macchia in modo efficiente i granuli di polline immaturi. È consigliato un minimo di 5 fiori per trattamento raccolto dalle infiorescenze e diverse piante.</li>
	<li>Preparare una piastra a 96 pozzetti con soluzione di abbastanza Alexander per sommergere il bocciolo di un fiore. Esporre le antere rimuovendo i sepali e petali e immergerli nella soluzione di Alexander. Mantenere i campioni sotto la cappa per 1 – 3 h.</li>
	<li>Sostituire la soluzione di Alexander con soluzione 4½ di Herr e posizionare la piastra multi-pozzetto sotto la cappa per un'incubazione overnight.</li>
	<li>Usando il forcipe, spostare delicatamente i boccioli dei fiori sgomberati su una nuova diapositiva. Poiché può verificarsi alcune riporto soluzione di Alessandro, è possibile utilizzare una carta assorbente per rimuovere tanto schiarimento soluzione possibile.</li>
	<li>Sezionare gli stami e rimuovere tutti gli altri tessuti. Seguire i passaggi nella sezione 3 utilizzando soluzione 4½ di Herr.</li>
</ol>5. rimuovere l'esina da granelli di polline
Nota: Si consiglia di utilizzare il fissativo di Carnoy per colorazione DAPI.
<ol><li>Seguire le procedure di fissazione e sezionamento descritte nelle sezioni 1 e 2. Ormai, uno dovrebbe avere uno a molti stami su diapositiva all'interno di una minima quantità di etanolo al 70%.</li>
	<li>Utilizzare una carta assorbente per eliminare l'etanolo in eccesso e aggiungere 5-10 µ l di soluzione di DAPI. Utilizzando un paio di siringhe con aghi, rilasciare i grani di polline all'interno di quella piccola quantità di soluzione (ad esempio, utilizzare una siringa per immobilizzare lo stame e l'altro di rilasciare i grani di polline). Se la soluzione si asciuga, aggiungere un altro 5 µ l di DAPI.</li>
	<li>Rimuovere tutti i detriti dello stamen è un passo fondamentale, tale che solo i granuli di polline sono lasciati tra il vetrino e il coprioggetto.</li>
	<li>Porre un coprivetrino sulla diapositiva esemplare-cuscinetto abbassando lateralmente e aggiungere la quantità minima di soluzione DAPI necessaria a riempire lo spazio. Posizionare un dito indice il coprivetrino e senza schiacciare troppo tanto fare un rapido, costante e breve movimento scorrevole. Nota: Per misurare la forza necessaria e l'ampiezza del movimento scorrevole, questo passaggio dovrebbe essere praticato più volte, verificando i risultati ogni volta sotto il microscopio.</li>
	<li>Se necessario, aggiungere soluzione DAPI e posto la diapositiva in una finestra di umida al buio a 4 ° C per 15 min a 1 h. procedere per osservare i campioni sotto fluorescenza grandangolari o microscopia confocale entro 24 h. tentare di combinare questa procedura con SDS compensazione per verificare ulteriormente migliorare menti possono essere ottenuti.</li>
</ol>6. sodio dodecil solfato (SDS) di compensazione
Nota: A seconda dell'organo floreale da analizzare e sulle competenze del ricercatore di sezionare esemplari molto morbidi e piccoli, il SDS trattamento può essere effettuato sia prima (per ricercatori esperti) o dopo la dissezione passo (per meno esperti i ricercatori) il metanolo-acetico fissata materiale.
<ol><li>Utilizzare il vetro di un orologiaio, un vetrino concavo o un tubo del microcentrifuge per incubare i campioni sezionati o non sezionato in SDS 1% e 0,2 N NaOH soluzione durante la notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Maneggiare con cura perché il campione è molto morbido e ha un aspetto trasparente. Risciacquare più volte con acqua. Nota: I resti della soluzione SDS potrebbero portare a precipitazioni durante l'aggiunta di soluzione colorante, ad esempio, anilina blu.</li>
	<li>Per campioni non sezionato, seguire la procedura di dissezione descritta nella sezione 2, utilizzando acqua invece di etanolo al 70%. Dopo dissezione del tessuto desiderato, rimuovere eventuali residui e detriti e l'acqua in eccesso con carta assorbente, quindi aggiungere 20 – 40 µ l di soluzione colorante e procedere con il passaggio 6.5.</li>
	<li>Per i campioni sezionati, spostare il campione dalla soluzione di lavaggio e posizionare su un vetrino pulito e aggiungere 20 – 40 µ l di soluzione colorante.</li>
	<li>Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto sul vetrino abbassando lateralmente. Fare attenzione a non per schiacciare la preparazione. Se il tessuto è troppo morbido, luogo qualsiasi sottile separatore in tra il vetrino e il coprioggetto agli angoli (ad es., nastro o un vetrino coprioggetto rotto), lasciando uno spazio di cameristica tra diapositiva e il vetrino coprioggetti, tale che il vetrino coprioggetto non schiacciare il campione.</li>
	<li>Inserire tutte le diapositive all'interno di una casella di umida, coprirlo con un foglio di alluminio e posizionarlo a 4 ° C per almeno 1 h. Procedi per osservare il campione utilizzando widefield fluorescenza o microscopia confocale entro 24 h.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'esistenza di molti boccioli di fiori all'interno di una singola infiorescenza di Arabidopsis, che coprono tutte le fasi di sviluppo del fiore, offre un'opportunità unica per studi mirati alla caratterizzazione di un effetto di un trattamento o una caratteristica inerente allo sviluppo contemporaneamente attraverso le diverse fasi dello sviluppo del fiore. Un buon punto di riferimento tra le diverse singole piante è l'apertura del primo fiore dell'infiorescenza principale. Piante sono trattate in modo tale che ...

I fiori sono tra i più importanti definizione organi delle angiosperme. Piante da fiore è comparso circa 90 milioni anni fa1e così in fretta che loro aspetto rapido è stato descritto come un "abominevole mistero" di Charles Darwin2diversificato. Gli interessi dei ricercatori di pianta in sviluppo fiorale sono diversi. Alcune ricerche si sono concentrate sulla comprensione l'origine evolutiva del fiore nel suo insieme, o l'evoluzione delle specifiche proprietà anatomiche, strutturali e funzionali di fiori3,4,5,6 . La variazione alta in floral forma e struttura, nonché le modalità di riproduzione sessuale e asessuale affidamento su di loro, fare il fiore una struttura altamente complessa. Ciò ha portato a diversi sforzi per caratterizzare le caratteristiche strutturali e di anatomia degli organi floreali, utilizzando tecniche di microscopico dell'elettrone e della luce che potrebbero combinarsi con le indagini genetiche e molecolari7. Inoltre, come la fonte di frutti e semi, i fiori sono di fondamentale importanza per l'alimentazione umana e animale. Di conseguenza, la caratterizzazione dello sviluppo del fiore e frutta ha molte implicazioni per la ricerca applicata, compresa la sicurezza di cibo per una popolazione umana sempre maggiore e strategie di conservazione ecologica sotto un cambiamento di ambiente8 , 9 , 10.
Lo sviluppo del fiore in Arabidopsis inizia con induzione a fiore e la trasformazione del meristema vegetativo di un meristema infiorescenza (gruppo di fiori). Primordia fiore vengono avviate lateralmente sul fianco del meristema infiorescenza11. I primordi dell'organo floreale formano progressivamente in verticilli concentrici dall'esterno al centro del fiore e alla fine trasformarsi in sepali, petali, stami e carpelli7. Questi organi floreali soddisfano distinta nutritiva, protettiva e funzionale (ad es., attrazione impollinatore) ruoli in diverse specie vegetali, con gli organi sessuali, sostenere lo sviluppo dei gametofiti maschili e femminili, rispettivamente12 , 13. i gametofiti, a sua volta, ciascuna differenziano un paio di uomo (sperma) e gameti femminili (uovo e centrale delle cellule), che uniscono al momento doppia fertilizzazione per formare la prossima generazione, lo zigote e l'endosperma primario, un terminale del tessuto di sostegno del sviluppo dell'embrione14,15. Frutta e semi di sviluppo supportano la crescita, maturazione e conservazione dell'embrione e, alla fine, la sua dispersione. Un'ampia ricerca è stata eseguita per caratterizzare lo sviluppo dell'embrione e del fiore in diverse specie di piante, soprattutto nelle specie modello Arabidopsis7,16,17.
Analisi al microscopio precoce dello sviluppo del fiore erano basati su elaborazione del campione richiede tempo e osservazione tecniche, come la paraffina o l'incorporamento di resina e di sezionamento, combinato con la luce o la microscopia elettronica. Queste tecniche microscopiche tradizionale sono stati spesso utilizzate in combinazione con le indagini genetiche molecolari, quali analisi microscopiche di mutanti, la localizzazione di RNA tramite l'ibridazione in situ o immuno-rivelazione di proteine. Recenti progressi nella microscopia di fluorescenza grandangolari e confocale, nelle analisi di immagine computerizzata 3D in state-of-the-art e il continuo perfezionamento dei metodi molecolari che può essere utilizzato su campioni di intero-monta minimamente trattati, ha portato ad un'esigenza di tecniche di elaborazione del campione efficiente e minimale che sono preferenzialmente favorevoli ad analisi quantitative. Negli ultimi anni, significativi progressi compiuti nello sviluppo di tecniche di compensazione sull'esemplare animale intero-monta. Che rendono il campione trasparente utilizzando i reagenti di zucchero-base acquosa o di urea (ad es., scala, SeeDB, CUBIC)18,19,20, o rimuovendo selettivamente i lipidi (usando il detersivo SDS) dopo incorporamento di campioni in idrogel stabili; la rimozione dei lipidi può essere raggiunto mediante diffusione passiva (ad esempio, modifica chiarezza protocollo21, patto-PARS-cerchi22) o attivamente mediante elettroforesi (originale chiarezza protocollo23 e ACT-PRESTO24). Incoraggiato da questo progresso veloce, alcune tecniche derivate stanno emergendo anche per utilizzo in impianti.
In questo articolo di metodi focalizzato sul modello Arabidopsis, descriviamo la procedura per la corretta dissezione di boccioli di fiori, fiori e giovani silique e lo schiarimento dei campioni del intero-monta per la diversa colorazione e utilizzando le procedure di osservazione classica o un recente metodo di compensazione basati su SDS. Vengono forniti esempi per amido, callosio e macchiatura della cromatina. Anche se queste procedure potrebbero essere necessario ulteriori miglioramenti e adeguamenti quando utilizzato con altre specie, ci auguriamo di che essi porranno le basi per ulteriori ricerche su questi metodi semplici ma fondamentali che sono il punto di partenza di molti progetti di ricerca.

<table><tbody><tr><td>Reagenti e materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Scharlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>acido acetico</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Acido</td></tr><tr><td>acetico glaciale</td> di grado di <td>biologia</td>molecolare <td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Scharlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Acido propionico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>Idrato di cloralio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Gomma arabica</td><td>Fluka</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>Acido lattico</td><td>Fluka</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607-250ML</td><td>Abbiamo usato fenolo liquido (usa la densità per trovare il volume richiesto per la tua soluzione)</td></tr><tr><td>Olio di chiodi di garofano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Roth</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Iodio</td><td>Fluka</td><td>57665</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di potassio</td><td>Merck</td><td>5043</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green</td><td>Fluka</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Acido fucsin</td><td>Fluka</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>Arancio G</td><td>Sigma</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sodio di-idrogeno fosfato</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>Sbiancante fluorescente 28</td></tr><tr><td>Auramine</td><td>Chroma</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>tossico</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Blu anilina</td><td>Merck</td><td>1275</td><td></td></tr><tr><td>MS medio</td><td>Carolina</td><td>19-57030</td><td></td></tr><tr><td>Substrato ricco di sostanze nutritive</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr><tr><td>Vetro</td><td></td><td></td> da orologiaio <td>Nessuna marca specifica</td></tr><tr><td>15 ml di provette da centrifuga falcon</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumond</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Ago di preparazione</td><td>BD</td><td>BD Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>bordi tagliati</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>Una</td><td></td><td></td><td>scatola di plastica con tovagliolo di carta umido e supporti scorrevoli all'interno</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fissativi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Fissativo <td></td><td></td> di <td>Carnoy (Farmer)</td><td>Etanolo assoluto : acido acetico glaciale, 3:1 (ml:ml)</td></tr><tr><td>Metanolo/acido acetico fissativo</td><td></td><td></td><td>50 % (v/v) metanolo, 10 % (v/v) acido acetico glaciale in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>FPA50 fissativo</td><td></td><td></td><td>Formalina, acido propionico, 50% etanolo; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td></tr><tr><td><forte>Soluzioni di chiarificazione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrato di cloralio/glicerolo</td><td></td><td></td><td>Idrato di cloralio : glicerolo : acqua, 8:1:2 (g:ml:ml). Può essere utilizzato per tutte le fasi di sviluppo dei fiori e per lo sviluppo della silique con la microscopia DIC. Il miglior fissativo è la gomma</td></tr> arabica <tr><td></td><td></td><td></td> FPA50 modificata a base di formalina <td>7,5 g, cloralio idrato 100 g, glicerolo 5 ml, acqua 30 ml. Può essere utilizzato per tutte le fasi di sviluppo dei fiori e per lo sviluppo della silique con la microscopia DIC. Il miglior fissativo è il</td></tr><tr>fluido <td></td><td></td> schiarente FPA50<td>Herr's 4&frac12;</td> a base di formalina<td>, acido lattico, idrato di cloralio, cristalli di fenolo, olio di chiodi di garofano, xilene; 2:2:2:2:1, in peso. Può essere utilizzato per tutte le fasi di sviluppo dei fiori (in particolare per lo sviluppo degli stami) e per lo sviluppo della silique con la microscopia DIC. Il miglior fissativo è la</td>soluzione</tr><tr><td></td><td></td><td>SDS/NaOH</td> FPA50 a base di formalina <td>Mix-diluire la SDS e la soluzione madre di NaOH all'1% di SDS / 0,2 N NaOH (diluizione 10x). Per tutte le fasi di sviluppo dei fiori e della silique. Il miglior fissativo è il fissativo metano/acido acetico; Possono essere utilizzati anche gli altri due fissativi. Può essere combinato con calcofluor, auramina, DAPI e soluzione colorante blu all'anilina.</td></tr><tr><td>Soluzione madre</td><td></td><td></td> SDS <td>10 % (p/v) di sodio dodecil solfato. Sciogliere 10 g di solfato di sodio dodecilfato in 80 ml di acqua deionizzata e portare a 100 ml con acqua deionizzata.</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> madre di NaOH <td>2 N Soluzione di NaOH: sciogliere 4 g di NaOH in 40 ml di acqua deionizzata e portare a 100 ml con acqua deionizzata</td></tr><tr><td><forte>Soluzioni combinate di chiarificazione e colorazione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr's IKI-4&frac12;</td><td></td><td></td><td>A uno standard 4&frac12; (9 g in totale) aggiungere: 100 mg di iodio, 500 mg di ioduro di potassio. Questa soluzione di chiarificazione può essere utilizzata per tutte le fasi di sviluppo dei fiori e per lo sviluppo della silique, sia per aumentare il contrasto che per caratterizzare la dinamica dell'amido. Utilizza FPA50 per l'analisi strutturale e il fissativo di Carnoy per l'analisi quantitativa dell'amido.</td></tr><tr><td>Colorazione</td><td></td><td></td> Alexander <td>Etanolo 95% 10 ml, verde malachite (1% in 95% EtOH) 1 ml, acido fucsina (1% in ddH2O) 5 ml, arancia G (1% in ddH2O) 0,5 ml, fenolo 5 g, cloralio idrato 5 g, acido acetico glaciale 2 ml, glicerolo 25 ml. Questa pulizia/colorazione da sola o in combinazione con il 4&frac12 di Herr; può essere utilizzata per valutare l'aborto del polline in fiori con granuli di polline maturi e tricellulari. Si utilizza su materiale non fisso appena levigato.</td></tr><tr><td>Soluzioni coloranti </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor soluzione</td><td></td><td></td><td>Calcofluor 0,007% in acqua (g:ml). Originariamente utilizzato come sbiancante ottico. Può essere utilizzato per la colorazione di cellulosa, polisaccaridi carbossilati e calcosio nelle pareti cellulari. Frequentemente usato per colorare l'intine del granello di polline. Tutti e tre i fissativi possono essere utilizzati con questa soluzione.</td></tr><tr>Soluzione <td></td><td></td><td>di auramina</td><td>Auramina 0,01% in acqua (g:ml). Questo colorante fluorescente lipofilo può essere utilizzato per colorare cuticole, cutina ed esina, tra gli altri. Tutti e tre i fissativi possono essere utilizzati con questa soluzione</td></tr><tr>Miscela <td></td><td></td><td>Calcofluor-Auramine</td><td>Soluzione di Auramina : Soluzione Calcofluor, 3:1. Può essere utilizzato per una colorazione combinata con entrambe le soluzioni. Altre proporzioni possono essere dosate mantenendo una percentuale minore di calcofluor rispetto all'auramina.</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> DAPI <td>DAPI 0,4 ug/ml, tampone fosfato di sodio 0,1 M (pH 7), Triton-X-100 0,1%, 1 mM EDTA. Questa soluzione può essere utilizzata per colorare le diffuse cromosomiche durante la meiosi maschile e femminile e i nuclei cellulari di qualsiasi tessuto. Utilizzato frequentemente per studiare lo sviluppo dei granuli di polline. Il Carnoy e il metanolo/acido acetico sono i migliori fissativi per questa soluzione. I fissativi a base di formaldeide come l'FPA50 possono interferire con la colorazione. Eccitazione nell'UV ed emissione massima intorno ai 461 nm.</td></tr><tr><td>Tampone fosfato di sodio (0,1 M)</td><td></td><td></td><td>Recettore del protone: 0,2 M Na2HPO4, donatore di protoni: 0,2 M NaH2PO4, rapporto donatore di protoni / recettore del protone: 1,364 (per un pH 7)</td></tr><tr><td>Soluzione di blu</td><td></td><td></td> di anilina <td>0,1% (p/v) blu di anilina, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glicerolo. Questa soluzione può essere utilizzata per la colorazione di calclosio e cellulosa di molti stadi di sviluppo (ad es. deposizione di callosio in terad maschili e femminili, tappi di callosio in tubi pollinici). Eccitazione nei raggi UV ed emissione massima intorno a 455. Può anche essere eccitato a 514 nm con emissione in rosso per la colorazione del contenuto cellulare.</td></tr></tbody></table>

intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di arabidopsis

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

A causa di suoi strumenti formidabili per studi di genetica molecolare, Arabidopsis thaliana è una delle più importanti specie modello in biologia vegetale e, soprattutto, in biologia riproduttiva delle piante. Tuttavia, pianta morfologica, anatomica e le analisi ultrastrutturali tradizionalmente coinvolgono l'incorporamento richiede tempo e sezionamento procedure per campo chiaro, scansione e microscopia elettronica. Recenti progressi nella microscopia a fluorescenza confocale, state-of-the-art 3D computerizzata analisi al microscopio e il continuo affinamento delle tecniche molecolari per essere utilizzato su campioni di intero-monta minimamente trattati, ha portato ad un aumento della domanda di lo sviluppo di tecniche di elaborazione del campione efficiente e minimale. In questo protocollo, descriviamo le tecniche per la dissezione correttamente Arabidopsis fiori e silique, compensazione, tecniche di base e alcune procedure di macchiatura per intero-monta le osservazioni di strutture riproduttive.

Arabidopsis appartiene alla famiglia Brassicacea, cuscinetto infiorescenze con fiori bisessuali disposti in un corimbo (Figura 1). Ogni fiore ha quattro sepali, petali di quattro, sei stami (quattro lunghi e due brevi) e un sincarpio gineceo costituito da due carpelli congenitamente fuse (Figura 1F-H) disposti in verticilli concentrici quattro25,26</su...

In questo protocollo, abbiamo descritte le tecniche per la corretta dissezione di Arabidopsis fiori e silique, alcune tecniche di base di schiarimento e selezionato le procedure per intero-monta le osservazioni delle strutture riproduttive di colorazione.

Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Questo protocollo descrive come sezionare correttamente boccioli di fiori, fiori e giovani silique. E la successiva sgombero a montaggio intero per diverse tecniche di colorazione e osservazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della produzione di piante sessuali.Come un'analisi costantemente mutante o qualsiasi fallimento indotto dall'ambiente e dalla sperimentazione nello sviluppo e nella funzione dei fiori. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di consentire uno screening facile e veloce di molte fasi di sviluppo contemporaneamente. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di dissezione degli organi dei fiori sono difficili da apprendere perché richiedono una conoscenza preliminare dell'anatomia dei fiori e delle abilità di dissezione.Per iniziare, usa delle piccole forbici per rimuovere i fiori dalle piante sincronizzate. E inserirli immediatamente in singole provette da microcentrifuga, contenenti un fissativo appropriato. Quindi, rimuovere il fissativo e aggiungere una quantità di etanolo al 70% sufficiente a coprire completamente i campioni.Riportare i campioni a quattro gradi Celsius per almeno 24 ore. Quindi riempi un bicchiere da orologiaio con etanolo al 70% appena fatto e mettilo in una piccola capsula di Petri come supporto. Quindi posizionare l'infiorescenza nel bicchiere dell'orologiaio e assicurarsi che sia completamente coperto dall'etanolo.Usando una pinza e una siringa dotata di ago, sezionare il fiore sotto lo stereomicroscopio strappando i sepali, i petali e lo stame. Quindi mettere da parte il vetro dell'orologiaio e utilizzare un vetrino per la dissezione finale. Spostare il campione su un vetrino e aggiungere 10 microlitri di etanolo al 70% appena fatto.Fai dei tagli su ciascun lato del carpale, ruotandolo secondo necessità. Quindi rimuovere delicatamente le valvole per esporre gli ovuli. Fai un piccolo taglio netto per staccare metà del tessuto trasmittente dal recipiente e usa una pinza e un ago per strappare le due metà.Rimuovi lo stilo dello stigma e il peduncolo con tagli netti. Usando la pinza e l'ago, capovolgi delicatamente e disponi gli ovuli ancora attaccati per ottenere due file parallele. Utilizzare un piccolo pezzo di carta assorbente per rimuovere l'etanolo dal campione sul vetrino.Quindi aggiungere 20 microlitri di soluzione schiarente al vetrino. Utilizzando un paio di siringhe con aghi ipodermici, posizionare i campioni e rimuovere eventuali bolle d'aria rimanenti. Quindi, posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sul vetrino e attendere che la soluzione di pulizia riempia lo spazio tra il vetrino coprioggetti e il campione.Posizionare la diapositiva in un supporto per diapositive e lasciarla sotto la cappa aspirante. Quindi prendiamo i boccioli dei fiori appena raccolti che stanno per aprirsi con antere non deiscenti. Quindi preparare una piastra a 96 pozzetti con una quantità sufficiente di soluzione Alexander per immergere completamente i boccioli dei fiori.Rimuovi i sepali e i petali per esporre le antere e immergili nella soluzione di Alexander. Lasciare riposare la piastra sotto la cappa aspirante per una o tre ore. Quindi sostituire la soluzione Alexander con la soluzione di Herr a quattro e mezzo e incubare la piastra sotto la cappa per una notte.Il giorno successivo usa una pinza per spostare con cura le gemme eliminate su un nuovo vetrino. Quindi, sezionare gli stami e rimuovere tutti gli altri tessuti dai campioni. Quindi procedere con la chiarificazione a base di cloralio idrato e la colorazione combinata con la soluzione di Herr a quattro e mezzo.Per prima cosa sposta il fiore dal vetro dell'orologiaio al vetrino e usa una carta assorbente per rimuovere l'etanolo in eccesso. Aggiungere da cinque a 10 microlitri di soluzione DAPI. Utilizzando due siringhe con aghi ipodermici, sezionare gli stami e rimuovere tutti gli altri organi del fiore.Quindi rilasciare i granuli di polline nella soluzione DAPI. Rimuovere tutti i detriti dallo stame dal vetrino assicurandosi che rimangano solo i granelli di polline sul vetrino. La rimozione di tutti i detriti dello stame dal vetrino è il passaggio più critico per la rimozione dell'esina.Tra il vetrino e il vetrino coprioggetti devono essere lasciati solo granuli di polline. Quindi, posizionare un vetrino coprioggetto sul vetrino del cuscinetto del campione e aggiungere la quantità minima di soluzione DAPI necessaria per riempire lo spazio tra il vetrino e il vetrino coprioggetti. Posizionare delicatamente un dito indice sul vetrino coprioggetto ed eseguire un rapido e breve movimento di scorrimento.Posizionare il vetrino in una scatola umana al buio a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti. Quindi osservare il vetrino sotto florescenza ad ampio campo o microscopia confocale entro 24 ore. Spostare il campione sezionato dal vetro dell'orologiaio a una lastra di vetro con cavità riempite con SDS all'1% e una soluzione di idrossido di sodio allo 0,2%.Incubare per una notte a temperatura ambiente. La soluzione di idrossido di sodio SDS eliminerà rapidamente i campioni, facendoli apparire trasparenti in pochi minuti. Sciacquare accuratamente il campione con acqua e posizionarlo su un vetrino pulito.Quindi aggiungere da 20 a 40 microlitri di soluzione colorante al vetrino. A seconda dell'organo floreale da analizzare e delle competenze del ricercatore, questo trattamento con DS può essere effettuato prima, per i ricercatori esperti o dopo la fase di dissezione, per i ricercatori meno esperti. Posizionare quindi un vetrino coprioggetti sul vetrino facendo attenzione a non schiacciare il preparato.Quindi posizionare tutti i vetrini preparati in una scatola umana coperta con un foglio di alluminio e incubare a quattro gradi Celsius per un'ora. Infine, osservare il campione in florescenza ad ampio campo o microscopia confocale. Dopo la procedura di dissezione, descritta nel protocollo, vengono rimossi i tessuti non necessari che potrebbero ostacolare le osservazioni e si ottengono immagini più dettagliate.A seconda dell'obiettivo, la colorazione con idrato di cloralio può essere utilizzata per caratterizzare lo sviluppo precoce dei fiori a livello dell'intero bocciolo del fiore, la meiosi e la genesi della micro-gomedal nell'antera, lo sviluppo precoce dell'ovulo e la specificazione della cellula madre della megaspora, lo sviluppo go-med-ificato femminile o persino l'invasione del tubo pollinico della griglia centrale. La combinazione della colorazione Alexander e della radura di quattro e mezzo di Herr consente la valutazione dell'aborto del polline all'interno di un dato loculo o di un'antera nel suo insieme. Mentre i granuli di polline vitali mostrano un citoplasma rosso, quelli abortiti mostrano un citoplasma vuoto e alla fine hanno una forma irregolare e sono completamente schiacciati.La rimozione dell'esina si traduce in un aumento dell'intensità di colorazione dei nuclei e in maggiori dettagli nell'organizzazione della cromatina. L'utilizzo e la pulizia dell'idrossido di sodio SDS prima della colorazione ha reso l'infiorescenza trasparente. E ha portato a una maggiore colorazione della callosio all'interno dei tessuti floreali.Ha rivelato accumuli di callosio solitamente difficili da vedere. Come lo strato di Callosio che separa la cellula generativa dalla cellula vegetativa. Anche quando i granuli di polline erano ancora contenuti all'interno dell'antera.Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere eseguite in meno di 48 ore, se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i risultati dipendono in gran parte da una buona preparazione del campione, come l'uso del fissativo appropriato, l'esecuzione corretta della dissezione e l'isolamento del tessuto di interesse sul vetrino.

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