Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Questo protocollo descrive come sezionare correttamente boccioli di fiori, fiori e giovani silique. E la successiva sgombero a montaggio intero per diverse tecniche di colorazione e osservazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della produzione di piante sessuali.

Come un'analisi costantemente mutante o qualsiasi fallimento indotto dall'ambiente e dalla sperimentazione nello sviluppo e nella funzione dei fiori. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di consentire uno screening facile e veloce di molte fasi di sviluppo contemporaneamente. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di dissezione degli organi dei fiori sono difficili da apprendere perché richiedono una conoscenza preliminare dell'anatomia dei fiori e delle abilità di dissezione.

Per iniziare, usa delle piccole forbici per rimuovere i fiori dalle piante sincronizzate. E inserirli immediatamente in singole provette da microcentrifuga, contenenti un fissativo appropriato. Quindi, rimuovere il fissativo e aggiungere una quantità di etanolo al 70% sufficiente a coprire completamente i campioni.

Riportare i campioni a quattro gradi Celsius per almeno 24 ore. Quindi riempi un bicchiere da orologiaio con etanolo al 70% appena fatto e mettilo in una piccola capsula di Petri come supporto. Quindi posizionare l'infiorescenza nel bicchiere dell'orologiaio e assicurarsi che sia completamente coperto dall'etanolo.

Usando una pinza e una siringa dotata di ago, sezionare il fiore sotto lo stereomicroscopio strappando i sepali, i petali e lo stame. Quindi mettere da parte il vetro dell'orologiaio e utilizzare un vetrino per la dissezione finale. Spostare il campione su un vetrino e aggiungere 10 microlitri di etanolo al 70% appena fatto.

Fai dei tagli su ciascun lato del carpale, ruotandolo secondo necessità. Quindi rimuovere delicatamente le valvole per esporre gli ovuli. Fai un piccolo taglio netto per staccare metà del tessuto trasmittente dal recipiente e usa una pinza e un ago per strappare le due metà.

Rimuovi lo stilo dello stigma e il peduncolo con tagli netti. Usando la pinza e l'ago, capovolgi delicatamente e disponi gli ovuli ancora attaccati per ottenere due file parallele. Utilizzare un piccolo pezzo di carta assorbente per rimuovere l'etanolo dal campione sul vetrino.

Quindi aggiungere 20 microlitri di soluzione schiarente al vetrino. Utilizzando un paio di siringhe con aghi ipodermici, posizionare i campioni e rimuovere eventuali bolle d'aria rimanenti. Quindi, posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sul vetrino e attendere che la soluzione di pulizia riempia lo spazio tra il vetrino coprioggetti e il campione.

Posizionare la diapositiva in un supporto per diapositive e lasciarla sotto la cappa aspirante. Quindi prendiamo i boccioli dei fiori appena raccolti che stanno per aprirsi con antere non deiscenti. Quindi preparare una piastra a 96 pozzetti con una quantità sufficiente di soluzione Alexander per immergere completamente i boccioli dei fiori.

Rimuovi i sepali e i petali per esporre le antere e immergili nella soluzione di Alexander. Lasciare riposare la piastra sotto la cappa aspirante per una o tre ore. Quindi sostituire la soluzione Alexander con la soluzione di Herr a quattro e mezzo e incubare la piastra sotto la cappa per una notte.

Il giorno successivo usa una pinza per spostare con cura le gemme eliminate su un nuovo vetrino. Quindi, sezionare gli stami e rimuovere tutti gli altri tessuti dai campioni. Quindi procedere con la chiarificazione a base di cloralio idrato e la colorazione combinata con la soluzione di Herr a quattro e mezzo.

Per prima cosa sposta il fiore dal vetro dell'orologiaio al vetrino e usa una carta assorbente per rimuovere l'etanolo in eccesso. Aggiungere da cinque a 10 microlitri di soluzione DAPI. Utilizzando due siringhe con aghi ipodermici, sezionare gli stami e rimuovere tutti gli altri organi del fiore.

Quindi rilasciare i granuli di polline nella soluzione DAPI. Rimuovere tutti i detriti dallo stame dal vetrino assicurandosi che rimangano solo i granelli di polline sul vetrino. La rimozione di tutti i detriti dello stame dal vetrino è il passaggio più critico per la rimozione dell'esina.

Tra il vetrino e il vetrino coprioggetti devono essere lasciati solo granuli di polline. Quindi, posizionare un vetrino coprioggetto sul vetrino del cuscinetto del campione e aggiungere la quantità minima di soluzione DAPI necessaria per riempire lo spazio tra il vetrino e il vetrino coprioggetti. Posizionare delicatamente un dito indice sul vetrino coprioggetto ed eseguire un rapido e breve movimento di scorrimento.

Posizionare il vetrino in una scatola umana al buio a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti. Quindi osservare il vetrino sotto florescenza ad ampio campo o microscopia confocale entro 24 ore. Spostare il campione sezionato dal vetro dell'orologiaio a una lastra di vetro con cavità riempite con SDS all'1% e una soluzione di idrossido di sodio allo 0,2%.

Incubare per una notte a temperatura ambiente. La soluzione di idrossido di sodio SDS eliminerà rapidamente i campioni, facendoli apparire trasparenti in pochi minuti. Sciacquare accuratamente il campione con acqua e posizionarlo su un vetrino pulito.

Quindi aggiungere da 20 a 40 microlitri di soluzione colorante al vetrino. A seconda dell'organo floreale da analizzare e delle competenze del ricercatore, questo trattamento con DS può essere effettuato prima, per i ricercatori esperti o dopo la fase di dissezione, per i ricercatori meno esperti. Posizionare quindi un vetrino coprioggetti sul vetrino facendo attenzione a non schiacciare il preparato.

Quindi posizionare tutti i vetrini preparati in una scatola umana coperta con un foglio di alluminio e incubare a quattro gradi Celsius per un'ora. Infine, osservare il campione in florescenza ad ampio campo o microscopia confocale. Dopo la procedura di dissezione, descritta nel protocollo, vengono rimossi i tessuti non necessari che potrebbero ostacolare le osservazioni e si ottengono immagini più dettagliate.

A seconda dell'obiettivo, la colorazione con idrato di cloralio può essere utilizzata per caratterizzare lo sviluppo precoce dei fiori a livello dell'intero bocciolo del fiore, la meiosi e la genesi della micro-gomedal nell'antera, lo sviluppo precoce dell'ovulo e la specificazione della cellula madre della megaspora, lo sviluppo go-med-ificato femminile o persino l'invasione del tubo pollinico della griglia centrale. La combinazione della colorazione Alexander e della radura di quattro e mezzo di Herr consente la valutazione dell'aborto del polline all'interno di un dato loculo o di un'antera nel suo insieme. Mentre i granuli di polline vitali mostrano un citoplasma rosso, quelli abortiti mostrano un citoplasma vuoto e alla fine hanno una forma irregolare e sono completamente schiacciati.

La rimozione dell'esina si traduce in un aumento dell'intensità di colorazione dei nuclei e in maggiori dettagli nell'organizzazione della cromatina. L'utilizzo e la pulizia dell'idrossido di sodio SDS prima della colorazione ha reso l'infiorescenza trasparente. E ha portato a una maggiore colorazione della callosio all'interno dei tessuti floreali.

Ha rivelato accumuli di callosio solitamente difficili da vedere. Come lo strato di Callosio che separa la cellula generativa dalla cellula vegetativa. Anche quando i granuli di polline erano ancora contenuti all'interno dell'antera.

Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere eseguite in meno di 48 ore, se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i risultati dipendono in gran parte da una buona preparazione del campione, come l'uso del fissativo appropriato, l'esecuzione corretta della dissezione e l'isolamento del tessuto di interesse sul vetrino.