Name: Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dellintegrità strutturale del capside virale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Scopri metodi alternativi per distinguere particelle di norovirus infettive da non infettive mediante aptameri, scattering dinamico della luce e microscopia elettronica a trasmissione. Queste tecniche forniscono informazioni meccanistiche sull'integrità del capside virale.

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Questo lavoro è stato supportato dall'agricoltura e cibo ricerca iniziativa concorrenziale Grant n ° 2011-68003-30395 dal dipartimento dell'agricoltura degli Stati Uniti, Istituto nazionale di cibo e agricoltura attraverso il progetto NoroCORE. Finanziamenti a costo di accesso aperto è stato fornito dal dipartimento di agricoltura degli Stati Uniti. Vorremmo ringraziare Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) per gentilmente averci i capsidi purificate e Valerie Lapham per la sua assistenza con le immagini TEM. Vorremmo anche ringraziare Frank N. Barry per aiutarci a iniziare gli esperimenti presentati.

1. piastra-base legando l'analisi per valutare perdita di ordine Norovirus capside struttura superiore Nota: un protocollo ELASA molto simile a quella presentata qui è stato pubblicato 29, e simili ELASA saggi precedentemente sono stati segnalati come parte della ricerca articoli altrove 17 , 18 , 22.
<ol><li>Trattamento termico di capsidi GII.4 Sydney norovirus umano <ol><li>ottenere norovirus umano purificato proteina principale del capsid (VP1) di Sydney GII.4 (adesione: JX459908) assemblati in capsidi. 
		Nota: Capsidi nello studio sono state ottenute per gentile concessione di R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX).</li>
		<li>Diluire capsidi a 50 µ g/mL in 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7,2) ad un volume massimo di 15 µ l in singole provette PCR con tappi. Assicurarsi che il tubo contiene almeno 600 ng del capside. Assicurarsi che vi sia 600 ng del capside per ogni combinazione di trattamento-ligando.</li>
		<li>Preriscaldare il termociclatore a trattamento termico desiderato. 
		Nota: ai fini del presente protocollo, trattamento a 68 ° C per tempi diversi (0 - 25 min) è stato scelto.</li>
		<li>Preriscaldare un cycler termico aggiuntivo a 4 ° C per il raffreddamento immediato. Aggiungere tubi con la soluzione del capsid termociclatore per il tempo desiderato. Trasferire immediatamente al ciclatore pre-raffreddata 4 ° C per 5 min dopo il riscaldamento.
		Trattamento <ol><li>Include 95 ° C per 5 min come controllo del capsid denaturato. Sono soluzione capside non trattati (23 ° C) come controllo positivo. Includono PBS con nessun capside come un ulteriore controllo negativo.</li>
		</ol></li> <li>Brevemente rotazione verso il basso in una centrifuga per ottenere tutte le goccioline sul fondo del tubo e diluire le soluzioni del capsid trattati in PBS a 3 µ g/mL. Assicurarsi che vi sia almeno 200 µ l di diluito, trattato del capsid (100 µ l/pozzetto).</li>
	</ol></li> <li>Applicare 100 µ l di soluzione di capside in ciascun pozzetto, assicurando che ci sono almeno due pozzi per ogni trattamento. Inoltre, includono 2 pozzetti di controllo con 100 µ l PBS per ogni ligando; Questo fornisce l'assorbanza di fondo del dosaggio. Coprire la piastra con un coperchio, sigillo bordi con paraffina per ridurre l'evaporazione della pellicola e lasciano durante la notte su un incubatore d'agitazione a 4 ° C o per 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare il tampone bloccante facendo 5% latte scremato solidi (w/v) in PBS con 0.05% Tween 20 (PBST).</li>
	<li>Rimuovere le soluzioni del capsid trattati dalla piastra. Aggiungere 200 µ l/pozzetto di tampone bloccante. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte, sigillato a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare il ligando vincolanti soluzioni per l'aptamero biotinilati M6-2 18 , 29 e biotinilati sintetico HBGA sangue di tipo A o tipo di biotinylated H.
	<ol><li>Diluire l'aptamero biotinilato a 1 µM in acqua priva di nucleasi. Assicurarsi che ci sia una soluzione abbastanza per 200 µ l totale per ogni trattamento. Diluire il biotinilati selezionati HBGA a 30 µ g/mL in tampone bloccante. Assicurarsi che vi sia una soluzione abbastanza per 200 µ l di volume totale per ogni trattamento. 
		Nota: Per utilizzare meno HBGA, 10 µ g/mL di HBGA a 0,25% latte scremato-PBST può essere sostituito. Concentrazioni per entrambi biotinilati M6-2 e HBGA precedentemente ottimizzate e riferite.</li>
	</ol></li> <li>Rimuovere il tampone bloccante e lavare le piastre 3 volte con 200 µ l/pozzetto PBST. La piastra capovolta su carta sterile assorbente per asciugare l'umidità residua di Pat.</li>
	Soluzioni di collegamento di <li>aggiungere 100 µ l/pozzetto del ligando, assicurando che ci sono 2 pozzi per ogni combinazione di trattamento termico-ligando. Incubare la piastra coperta con un coperchio su agitatore orbitale a circa 60 giri/min per 1 h a temperatura ambiente. 
	Nota: Assicurarsi di includere 2 pozzetti ciascuna delle capsidi non trattate e completamente denaturati capsidi per ogni legante come controlli positivi e negativi, rispettivamente. Inoltre, includono 2 &#34; no capside &#34; pozzi per ogni legante come la piastra di base control.</li>
	<li>Rimuovere le soluzioni di ligando e lavare i pozzetti 3 volte con 200 µ l/pozzetto PBST. Pat la piastra capovolta su carta sterile assorbente per asciugare l'umidità residua.</li>
	Perossidasi di streptavidina-rafano, <li>aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione di 0,2 µ g/mL in PBS. Incubare per 15 min a temperatura ambiente con agitazione delicata su agitatore orbitale. 
	Nota: Diversi streptavidina-rafano perossidasi coniugati avrà diverse concentrazioni. Consultare l'utente &#39; s manuale per la gamma ideale di concentrazioni per applicazioni di ELISA dell'enzima e verificare che sia ottima.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di coniugato. Lavare 3 volte con 200 µ l/pozzetto PBST. Pat la piastra capovolta su carta sterile assorbente per asciugare l'umidità residua.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l/pozzetto 3,3 &#39;, 5,5 &#39;-substrato tetrametilbenzidina (TMB) e consentire il colore di sviluppare per pozzetti di controllo negativo di osservare 5-15 minuti per qualsiasi colore ed essere sicuri di sviluppare costantemente allo stesso orario tra piastre di replicare. Essere consapevoli della gamma assorbanza del lettore della piastra utilizzata, pure. 
	Nota: I tempi di sviluppo possono variare in base alla qualità dei ligandi/reagenti utilizzati.</li>
	<li>Arrestare lo sviluppo della reazione con acido fosforico di 100 µ l/pozzetto 1M. Leggere immediatamente piastra a 450 nm. Salvare i dati. 
	Nota: Introduzione dell'acido in genere rallenta drasticamente la reazione ma completamente non si ferma. Non lasciare la piastra si fermò per un lungo periodo di tempo prima di leggere l'assorbanza.</li>
</ol> 2. Analisi dei risultati del test basato su piastra <ol><li>salvare i dati di assorbanza crudo in un foglio di calcolo. Produrre l'assorbanza media per ogni coppia bene con il trattamento specifico e ligando. Utilizzare queste medie per tutte le successive analisi. 
	Nota: Confrontare entrambi assorbanze bene per essere sicuri che nessuna coppia di wells hanno valori significativamente disparati.</li>
	<li>Per analizzare l'integrità assoluta del capsid (tutte le associazione), sottrarre l'assorbanza crudo del &#34; no capside &#34; controllo da ogni altro valore di assorbanza del campione. 
	Nota: In alternativa, perdita di associazione a causa di perdita di più alto ordine (secondario, terziario e Quaternario) struttura possa direttamente essere analizzato. Invece di sottrarre l'assorbanza del controllo negativo (nessun capside), sottrarre il valore del controllo completamente denaturato capside. Questo consente di rimuovere tutte le associazione del segnale dovuto vincolante all'apparato non specifici così come associazione dovuto la sequenza del capside. HBGA e aptamero M6-2 visualizzare poco vincolante a capside completamente denaturato, così entrambi i metodi produce risultati simili. Falso segnale positivo attribuito all'associazione aptamer non specifico deve essere considerato quando si sceglie quale analisi utilizzare.</li>
	<li>Con le assorbanze adeguato controllo negative o denaturate, dividere il trattamento assorbanze dai loro rispettivo positivo (nessun trattamento) controllano assorbimenti e moltiplicano per 100. Questo fornisce la percentuale del segnale del capside trattato rispetto al controllo non trattato.</li>
	<li>Per stimare il livello di segnale di collegamento per ogni ligando attribuibile alla sequenza del capsid, sottrarre il &#34; no capside &#34; controllo dall'assorbanza iniziale negativo e prendere l'assorbanza rettificato del capside denaturato. Dividi questo numero per l'assorbanza rettificato del segnale di controllo positivo e moltiplicarlo per 100. Questo dà la percentuale apparente del segnale a causa del grippaggio del ligand a sequenza denaturato capside/capside.</li>
</ol> 3. Liste di distribuzione per il rilevamento di Virus aggregazione dopo il trattamento termico Nota: La procedura seguente potrebbe essere specifica per il software e strumento utilizzato, ma può essere adattato e applicato a dispositivi simili.
<ol><li>Crea una nuova dimensione SOP in liste di distribuzione dello strumento software utilizzando: materiale = proteina, Dispersant = PBS, temperatura = 25 ° C, tempo di equilibramento = 0 sec, tipo di cella = cuvetta monouso (piccolo volume, ZEN0040), angolo di misura = 173° Backscatter, Durata misura = automatico, numero di misurazioni = 3, ritardo tra misurazioni = 0 sec, elaborazione dei dati: modello di analisi = General purpose (risoluzione normale). Utilizzare le impostazioni predefinite per tutti gli altri parametri.</li>
	<li>Selezionare la freccia verde in esecuzione all'interno del software e il nome del campione.</li>
	<li>Seguire passaggi 1.1.1 attraverso 1.1.4 per il trattamento termico di VLP.</li>
	<li>Diluire il calore trattato VLPs 01:10 in PBS 1X per una concentrazione finale di 5 µ g/mL. (Opzionale) Filtrare il campione con un 1 µm dei pori per rimuovere le particelle di polvere; DLS è molto sensibile alla polvere, come particelle di grandi dimensioni a dispersione molto più luce di piccole particelle.</li>
	Cuvetta <li>trasferire 50 µ l di VLP diluito in un piccolo volume USA e getta. Inserire la cuvetta nel pozzetto di misurazione dello strumento.</li>
	<li>Iniziare la corsa e utilizzare il &#39; Correlogramma &#39;, &#39; cumulanti Fit &#39;, e &#39; i consigli esperti &#39; schede per valutare la qualità dei dati.
	<ol><li>Durante l'esecuzione, controllare che il valore di indice di polidispersione è inferiore a 0,3, che rappresenta una misura di qualità. nella &#8216; multi-view &#8217; scheda, assicurarsi che il coefficiente di correlazione è costante e vicino a, ma non più di 1, in breve tempo, e cade bruscamente a 0 in un secondo momento, caratteristico della dimensione delle particelle. Uso il &#8216; i consigli esperti &#8217; scheda per il feedback sulla qualità dei dati durante le misurazioni.</li>
		<li>Dopo la misurazione è completata, controllare nuovamente che il valore di indice di polidispersione è inferiore a 0,3. Assicurarsi che i cumulanti forma segue linea dati punti strettamente nella &#8216; cumulanti fit &#8217; Tab.</li>
	</ol></li> <li>Prendere la media del diametro della particella Z-media segnalata per ogni misurazione come la dimensione delle particelle di ciascun campione. Tracciare il diametro in nm vs temperatura in ° C.</li>
</ol> 4. DLS per rilevare Virus aggregazione in tempo reale Nota: I seguenti passaggi potrebbero essere specifici per il software e strumento utilizzato, ma può essere adattato e applicato a dispositivi simili.
<ol><li>Crea una nuova dimensione SOP in liste di distribuzione dello strumento software utilizzando: materiale = proteina, Dispersant = PBS, temperatura = come desiderato, tempo di equilibramento = 0 sec, tipo di cella = cuvette in quarzo, angolo di misura = 173° Backscatter, durata di misura = automatico, Numero di misurazioni = 50 (può essere aumentata o diminuita a seconda aggregazione tasso), ritardo tra misure = 0 sec, elaborazione dei dati: modello di analisi = più strette modalità (alta risoluzione). Utilizzare le impostazioni predefinite per tutti gli altri parametri.</li>
	<li>Selezionare la freccia in esecuzione all'interno del software per aprire e il nome di un nuovo campione e lasciare lo strumento raggiungere l'equilibrio di temperatura.</li>
	<li>Sospendere i VIP in 1X PBS in un tubo del microcentrifuge ad una concentrazione di 5 µ g/mL e un volume tra 200-500 µ l. vortice la sospensione.</li>
	<li>Rotazione verso il basso la sospensione VLP per 5-10 s in una centrifuga da tavolo per-gas. Questo aiuta a prevenire la formazione di bolle durante il trattamento termico che interferisce con la dimensione misurazioni.</li>
	<li>Trasferimento le VLP sospensione al quarzo piccolo volume cuvette-evitare bolle e pipettare lentamente contro la parete della provetta. Dopo che lo strumento ha raggiunto l'equilibrio di temperatura, inserire la cuvetta nel pozzetto di misurazione.</li>
	<li>Aspettare 10 s per la temperatura del campione equilibrare, quindi iniziare la corsa. Avviare un timer all'inizio della corsa. Interrompere il timer alla fine della prima misurazione. Prendere questa volta come il primo punto di tempo. Ottenere punti successivi di tempo dai tempi di misura registrati dal software.</li>
	<li>Iniziare la corsa e monitorare il Correlogramma, distribuzione adatta e consulenza di esperti per valutare la qualità dei dati. 
	Nota: Il PDI non necessariamente sarà che inferiore a 0,3 per queste misurazioni come il campione dovrebbe essere polidispersi durante l'aggregazione.
	<ol><li>Assicurarsi che il coefficiente di correlazione è costante e vicino a, ma non più di 1 a breve termine e scende bruscamente a uno o più periodi successivi, caratteristici della dimensione delle particelle.</li>
		<li>Assicurarsi che la distribuzione in forma segue linea dati punti strettamente.</li>
	</ol></li> <li>Analizzare i dati in formato.
	Punto <ol><li>determinare ogni volta dalla differenza di tempo tra ogni misurazione e il punto di tempo iniziale. Durate di misurazione non sono tutti esattamente uguali.</li>
		<li>Utilizzando una distribuzione di intensità, registrare le dimensioni delle cime con le più grandi zone per ciascun punto di misurazione/tempo.</li>
		<li>Tracciare i diametri di picco in nm rispetto al tempo in min.</li>
	</ol></li></ol> 5. Preparazione del campione TEM <ol><li>ottenere supporto in carbonio griglie di pellicola (nichel) progettati per TEM. 
	Nota: Consultare la struttura di nucleo su reagenti consigliati e la loro manipolazione per uso con il microscopio di impianto. Assicurarsi di memorizzare le griglie in una scatola contenente essiccante o una camera a vuoto per minimizzare l'esposizione all'umidità.</li>
	<li>Strappare circa pezzi di 5 cm x 5 cm di carta da filtro. Ottenere vetro di Petri e corretto dichiusura reverse pinzette progettate per uso in microscopia.</li>
	<li>Tagliare circa 2,5 cm x 5 cm pezzo di pellicola di paraffina. Posto sul banco.</li>
	Trattamento termico di norovirus capsidi di Sydney GII.4 <ol><li><li>seguire la procedura di trattamento termico esattamente come descritto sopra ai punti 1.1.1 - 1.1.5 tranne: utilizzare 10 mM HEPES (pH 7.4) per il trattamento invece di PBS e non diluire ulteriormente capsidi dopo il trattamento (mantenere la soluzione a 50 µ g/mL). Dispensare la goccia di intero ~ 15 µ l di soluzione di capside trattati sulla pellicola di paraffina.</li>
	</ol></li> <li>Afferrare il bordo della griglia con le pinzette, permettendo loro di chiudere sul bordo per tenere la griglia e posizionare la griglia carbonio-lato-giù sopra la goccia di soluzione trattata. Lasciare Incubare per 10 minuti consentire il capside collegare alla rete.
	<ol><li>a seconda della purezza della preparazione del capsid, aggiungere lavaggi della soluzione 10 mM HEPES, se necessario sotto forma di goccioline di µ l di 10-15 posti in linea dopo la goccia di capside trattati.</li>
		<li>Dopo 10 min, ritirare la griglia con la goccia. Posizionare la griglia quasi perpendicolare a un pezzo di carta da filtro a stoppino via la goccia. Riprendere la goccia di 10-15 µ l di tampone HEPES con la griglia, tenere premuto per 30 s, poi stoppino via con un altro pezzo di carta da filtro per WA</li>
	</ol></li> <li>Posto una goccia di 15 µ l di soluzione di acetato di uranile 2% sul film paraffina in un'area vuota.
	<ol><li>Prendere la goccia di acetato di uranile con griglia e tenere per 45 s. stoppino via l'acetato di uranile, avendo cura di togliere la maggior parte della soluzione. Posizionare il griglia carbonio-lato alto su un pezzo di carta da filtro, facendo attenzione che la griglia non &#34; bastone &#34; all'umidità sulle pinzette. Inserire la carta da filtro con la griglia su di esso in un vetro aperto di Petri. 
		Nota: Non utilizzare piastre di Petri in plastica, come le griglie saranno elettrostaticamente attratte da loro e diventano bloccate al piatto.</li>
	</ol></li> <li>Ripetere per tutti i trattamenti. Posizionare le due metà di Petri con le griglie in un essiccatore durante la notte ad asciugare prima dell'osservazione con TEM.</li>
	<li>Rivolgersi alla sede di microscopia presso la rispettiva istituzione per quanto riguarda osservando le griglie preparate. Alcuni servizi consentono all'utente di essere addestrato sul funzionamento degli impianti di &#39; strumento di s. Dettagli specifici per quanto riguarda l'installazione e l'osservazione di un microscopio specifico è bgenerici nell'ambito di questo articolo.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo e le tecniche qui descritte forniscono un mezzo per valutare il norovirus umano del capsid integrità e funzionalità. Questi metodi possono essere utilizzati per ottenere informazioni mecanicistiche gli effetti dei trattamenti di inattivazione contro il virus e potenzialmente possono completare più tradizionali metodi di valutazione di inattivazione quale analisi di RT-qPCR o placca. Per esempio, la valutazione di inattivazione chimica o fisica di saggio della placca da solo fornisce una misura del grado di ...

Norovirus umana è responsabile di un onere considerevole sanità pubblica a livello mondiale, causando malattie circa 685 milioni e 212.000 morti annualmente1, ad un costo di miliardi di dollari2,3. Oggi, quantificazione e norovirus rilevamento coinvolge amplificazione del genoma e/o piattaforme basate su ligando. Il primo è generalmente preferito quanto è più sensibile, fornisce informazioni quantitative e ha generalmente più a basso rischio di risultati falsi positivi4. La tecnica più comune norovirus rilevazione e quantificazione del genoma amplificazione è reazione a catena della polimerasi quantitativa della trascrittasi inversa (RT-qPCR). Perché esso è destinato e amplifica un piccolo segmento del genoma umano norovirus, RT-qPCR da solo non è in grado di discriminare tra infettive e particelle non infettive, come RNA genomico gratis, danneggiato capsidi contenenti genomi e capsidi con fatalmente genomi mutati/troncato possono ancora essere amplificati da RT-qPCR. Mentre due nuove in vitro tecniche colturali per norovirus umano5,6 sono state segnalate recentemente, entrambi ancora contare su RT-qPCR per quantificazione del virus e non sono ancora metodi fattibile per la routine clinica/ambientale test per i norovirus umani. Così, RT-qPCR rimane il gold standard per test clinici/ambientali.
Nel tentativo di valutare meglio lo stato di infettività delle particelle norovirus sono stati sviluppati altri metodi in vitro . Questi metodi possono essere classificati generalmente come quelli che riguardano l'integrità del capside norovirus e quelli valutando l'integrità genomica. Il primo approccio è più popolare. Un metodo comunemente usato è il pretrattamento di RNAsi prima dell'estrazione di RNA genomico virale, tuttavia questo non tiene conto per le particelle virali che rimangono intatte, ma mancano la capacità di legare i recettori/co-fattori dell'ospite, come pure le particelle virali che fatalmente hanno mutato o hanno troncato o danneggiato marginalmente genomi7. L'integrità del capsid possa anche essere valutato basato sulla capacità del virus di legarsi al norovirus umano co-receptor/co-fattori, che sono carboidrati conosciuto come antigeni di gruppo di histo-anima (HBGAs). HBGAs sono presenti in cellule epiteliali intestinali di host come parte di glicoproteine o glicolipidi (tra altri tessuti multipli) e può essere secreto nei fluidi corporei come la saliva. Batteri enterici contenenti sostanze simil-HBGA sulle loro superfici inoltre sono stati indicati per associare norovirus umano8,9,10, e tali interazioni possono promuovere norovirus infezione5. Il concetto di base dell'associazione HBGA di utilizzazione è che solo le particelle virali in grado di legare il putativo recettore/co-factor sarebbe in grado di infettare altre cellule. Gli studi multipli suggeriscono che l'associazione di HBGA basati su perlina precedente amplificazione degli acidi nucleici è un metodo promettente per infettività discriminazione11,12,13,14, 15,16. Una sfida importante per quanto riguarda HBGAs è che nessun singolo tipo HBGA possibile associare tutti i genotipi umani norovirus. Per risolvere questo problema, porcina mucina gastrica, che contiene HBGAs, è stata utilizzata al posto di carboidrati HBGA purificati nell'interesse di facilità di sintesi, coerenza e costi ridotti.
Una recente pubblicazione di Moore et al. 17 ha introdotto una serie di nuove tecniche per la stima dell'integrità umana norovirus capside. Al posto di HBGAs, Moore et al. 17 studiato il legame di un largamente reattivo dell'acido nucleico aptamero (M6-2)18 e largamente reattivo anticorpo monoclonale (NS14)19 al trattato termicamente capsidi di norovirus GII.4 Sydney (particelle virus-like o VLP) e rispetto a questo per l'associazione HBGAs sintetico. Acido nucleico aptameri sono breve (~ 20-80 nt) singolo incagliato acidi nucleici (RNA o ssDNA) che piegare in strutture tridimensionali uniche in conseguenza della loro sequenza e una destinazione. Perché sono gli acidi nucleici, sono meno costosi; facilmente chimicamente sintetizzati, purificati e modificati; e stabile al calore. Esistono parecchi rapporti di aptameri generati contro i norovirus, con alcuni di loro mostrando ampia reattività ad una varietà di ceppi18,20,21,22. A titolo di esempio, Moore et al. 17 hanno dimostrato quel aptamero M6-2 associato a capsidi norovirus umano purificato, assemblati (VLPs) e si sono comportati allo stesso modo di HBGA nell'affidamento sulle proteine del capside virale per mantenere la struttura della proteina di più alto ordine (ad es., secondaria e terziaria) per si verifichi l'associazione. D'altra parte, una percentuale significativa di legame norovirus VLP anticorpo NS14 rimase dopo capsidi erano completamente denaturati. Valutazione di norovirus associazione nello studio di Moore et al. 17 è stato fatto utilizzando un metodo semplice, basato su piastra, simile a ELISA, con l'eccezione che aptameri sono usati al posto di anticorpi (quindi il metodo è stato chiamato ELASA). Questo metodo sperimentale di throughput elevato è stato utilizzato per valutare gli effetti dei diversi trattamenti sul capside di norovirus, lavoro che è prezioso per la comprensione del meccanismo di inattivazione virale sull'esposizione a fattori di stress fisici o chimici. Tuttavia, uno svantaggio di questo metodo è la sensibilità e la mancanza di tolleranza per matrix-collegata di contaminanti a livelli più alti che causano il legame non specifico di aptameri inferiore.
Moore et al. 17 utilizzato un altro metodo, diffusione dinamica della luce (DLS), per monitorare l'aggregazione delle particelle virali in risposta ad un trattamento termico. DLS è comunemente usato per valutare la dimensione delle sospensioni di nanoparticella ed è stato esteso a proteine23,24 e virus25,26,27. L'intensità della luce diffusa dalle particelle in soluzione varia in funzione della dimensione delle particelle, consentendo per il calcolo del coefficiente di diffusione e quindi diametro della particella mediante formule ben consolidate. La tecnica di liste di distribuzione in grado di distinguere il diametro idrodinamico delle particelle disperse nanometriche, che permette la rilevazione di virus dispersi, proteine del capside individuali o dimeri e aggregati di virus basati su dimensioni27. Aggregazione di virus, rappresentato da un aumento della dimensione delle particelle, è indicativo di perdita di integrità del capside. Mentre le proteine del capside è denaturato e sua struttura interrotti, residui idrofobici diventano esposti e causano le particelle stare insieme e formare aggregati. Liste di distribuzione può essere utilizzato per misurare la dimensione delle particelle dopo un trattamento specificato o la cinetica di aggregazione in tempo reale17,28. Questo metodo ha il vantaggio di permettere l'osservazione del comportamento del capsid in soluzione ma richiede alte concentrazioni del capside purificata, che non può essere interamente rappresentativa del virus nel suo stato naturale.
L'ultimo metodo utilizzato da Moore et al. 17 era microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Sebbene questo metodo manca di sensibilità e non produce dati quantitativi, consente per la visualizzazione degli effetti di diversi trattamenti sulla struttura del capside virale. Anche se non è ancora ideale per impostazioni cliniche/ambientale, l'uso di questi metodi in combinazione è utile nella comprensione umana norovirus inattivazione. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire approfondite protocolli per l'analisi di associazione basata su piastra (ELASA), DLS, e TEM preparazione metodi utilizzati per studiare gli effetti dei trattamenti termici sul capside di norovirus nel contesto degli effetti dei trattamenti sul capside integrità come presentato in Moore et al. 17.

<table><tbody><tr><td>Saggio di legame basato su piastra per la valutazione della perdita del capside del Norovirus di ordine superiore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti, piastra EIA in polistirene medio legante</td><td>Fisher (Costar)</td><td>07-200-36</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio per piastra a 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Film di paraffina (Parafilm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7,2)</td><td>Life Technologies</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7,2) + 0,05% Polisorbato 20</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Norovirus umano purificato e assemblato GII.4 capsidi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Provette PCR individuali da 0,2 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-154G</td><td></td></tr><tr><td>2 termociclatori</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Mini centrifuga da tavolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Solidi di latte scremato</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0031B</td><td></td></tr><tr><td>Disaccaride sintetico istosangue di tipo A, biotinilato</td><td>Glycotech</td><td>01-017</td><td></td></tr><tr><td>Aptamero biotinilato M6-2 (concentrazione madre 100 &; M in acqua priva di nucleasi): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Coniugato streptavidina-perossidasi di rafano (grado ELISA), utilizziamo Life Technologies SNN2004</td><td>Life Technologies</td><td>SNN2004</td><td></td></tr><tr><td>substrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), temperatura ambiente</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>1 M acido fosforico</td><td>N/A</td><td>N/A Lettore di</td><td></td></tr><tr><td>micropiastre in grado di leggere 450 nm</td><td>Tecan</td><td>Infinite m200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Analisi dei risultati del saggio basato su piastra</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel o programma simile</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering Experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer ZSP, o strumento simile per l'analisi delle dimensioni delle particelle</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientifc</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta al quarzo</td><td>Hellma</td><td>104-002-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta monouso di piccolo volume (per ridurre l'uso di VLP)</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZEN0040</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Preparazione del campione per microscopia elettronica a trasmissione </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Griglie per microscopia elettronica al nichel con pellicola di supporto in carbonio</td><td>Ladd Research</td><td>10880-100</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette per microscopia elettronica inversa a chiusura automatica</td><td>Ted Pella</td><td>5372-NM</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro qualitativa</td><td>Sigma-Aldrich (Whatman)</td><td>WHA1002055</td><td></td></tr><tr><td>Vetro piastre di Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455743</td><td></td></tr><tr><td>100 mM di soluzione HEPES stock (pH 7,2)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2% acetato di uranile</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

metodi alternativi in vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Norovirus umana esige di sanità pubblica considerevole e perdite economiche in tutto il mondo. Emergenti in vitro anticipi di coltivazione non sono ancora applicabili per la determinazione sistematica del virus. L'attuale rilevazione e quantificazione tecniche, che si basano principalmente su amplificazione degli acidi nucleici, non discriminare infettive da particelle virali non infettive. Lo scopo di questo articolo è di presentare dettagli specifici sui recenti progressi nelle tecniche utilizzate insieme al fine di acquisire ulteriori informazioni sullo stato di infettività delle particelle virali. Una tecnica prevede la valutazione di associazione di un aptamero ssDNA norovirus a capsidi. Aptameri hanno il vantaggio di essere facilmente sintetizzati e modificato e sono poco costosi e stabile. Un'altra tecnica, dynamic light scattering (DLS), ha il vantaggio di osservare il comportamento del capsid in soluzione. La microscopia elettronica consente la visualizzazione dell'integrità strutturale dei capsidi virali. Anche se promettente, ci sono alcuni svantaggi per ogni tecnica, ad esempio aspecifici aptamero associazione alle molecole caricati positivamente da matrici di campioni, requisito del capside purificato per liste di distribuzione e la scarsa sensibilità per microscopia elettronica. Tuttavia, quando queste tecniche vengono utilizzate in combinazione, il corpo di dati prodotti fornisce informazioni più complete sull'integrità del capsid di norovirus che possono essere utilizzate per dedurre infettività, informazioni che è essenziale per una valutazione accurata dei metodi di inattivazione o interpretazione di rilevazione dei virus. Questo articolo fornisce i protocolli per l'utilizzo di questi metodi per discriminare le particelle infettive umane norovirus.

L'integrità strutturale del norovirus umano capsidi GII.4 Sydney (VLP) è stata valutata utilizzando diversi metodi di romanzo come presentato da Moore et al. 17. in primo luogo, è stato fatto un esperimento in cui l'integrità dei capsidi in funzione della loro capacità di legare un putativo recettore/co-factor (HBGA) o ssDNA aptamero (M6-2) sono stati confrontati (Figura 1). I risultati visualizzati sono stati presentati in pr...

Metodi di rilevazione sistematica che utilizzano amplificazione del genoma virale sono limitati dalla loro incapacità di discriminare infettive da particelle non infettive. Lo scopo di questo articolo è di fornire protocolli dettagliati per metodi alternativi di aiuto nella discriminazione delle particelle infettive norovirus utilizzando l'associazione aptamer, diffusione dinamica della luce e microscopia elettronica di trasmissione.

Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

L'obiettivo generale di questi metodi è ottenere ulteriori informazioni sugli effetti del trattamento sull'infettività o sull'integrità del capside del norovirus umano. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'inattivazione dei virus non rivestiti, ad esempio cosa accade alla capacità infettiva del capside virale dopo un determinato trattamento.Il vantaggio principale di questi metodi è che possono fornire ulteriori informazioni meccanicistiche sull'azione di un determinato trattamento sul virus. Sebbene questo metodo possa offrire spunti sulle strategie di inattivazione del norovirus umano, ha anche il potenziale per essere applicato ad altri virus privi di involucro, come il rhinovirus o l'epatite A.Per iniziare, diluire la proteina maggioritaria del capside del virus della gastroenterite umana purificata, assemblata in capside, fino a 50 microgrammi per millilitro in soluzione salina fosfato 1X. Utilizzare un volume massimo di 15 microlitri nei singoli tubi PCR con tappo.Assicurarsi che il tubo contenga almeno 600 nanogrammi di capside e che siano presenti 600 nanogrammi di capside per ogni combinazione di ligando trattamento. Successivame

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Fonte: Moore, M. D., et al. Metodi alternativi in vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale. J. Vis. Exp.(2017).In questo video viene illustrato come i capside virali purificati vengano sottoposti a trattamento termico, preparati e analizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per rivelare modifiche strutturali e danni indotti dal calore.

Visualizzazione di capsidi virali trattati termicamente mediante microscopia elettronica a trasmissione

Fonte: Gao, Y., et al. Generazione e Assemblaggio di Nucleocapsidi Specifici per il Virus del Virus Sinciziale Respiratorio. J. Vis. Exp. (2021)Il video dimostra l'assemblaggio in vitro di nucleocapsidi specifici per il virus a partire da un complesso purificato di nucleoproteina-fosfoproteina privo di RNA, la loro purificazione mediante cromatografia di esclusione molecolare e la validazione dell'RNA virale a lunghezza intera all'interno delle particelle assemblate.

Ricostituzione in vitro e purificazione di particelle simil-nucleocapside virali

Qui, presentiamo un protocollo che esamina passaggi specifici dell'ingresso virale per identificare e valutare nuovi agenti antivirali.

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Lo smontaggio dei nuclei del virus dell'influenza A durante l'ingresso del virus nelle cellule ospiti è un processo a più fasi. Descriviamo un metodo in vitro per analizzare le prime fasi dell'uncoating virale. In questo approccio, la centrifugazione in gradiente di velocità viene utilizzata per sezionare biochimicamente le fasi che avviano l'uncoating in condizioni definite.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Un metodo di microscopia luce correlativa (CLEM) viene applicato alle strutture intracellulari indotte da virus immagine tramite microscopia elettronica (EM) in cellule che sono già stati scelti da microscopia chiara (LM). LM ed EM sono combinati in un approccio di imaging ibrido per ottenere una visione integrata delle interazioni virus-ospite.

Microscopia a luce correlativa (CLEM) per il monitoraggio e la proteina virale di Imaging strutture in cellule di Cryo-immobilizzata associate

Scopri metodi alternativi per distinguere particelle di norovirus infettive da non infettive mediante aptameri, scattering dinamico della luce e microscopia elettronica a trasmissione. Queste tecniche forniscono informazioni meccanistiche sull'integrità del capside virale.

Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

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