Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

L'obiettivo generale di questi metodi è quello di ottenere ulteriori informazioni sugli effetti di un trattamento sull'infettività o sull'integrità del capside del norovirus umano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'inattivazione virale senza involucro. Come ciò che sta accadendo alla capacità del capside virale di infettare una cellula dopo un determinato trattamento.

Il vantaggio principale di questi metodi è che possono fornire ulteriori informazioni meccanicistiche sull'azione di un determinato trattamento sul virus. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle strategie di inattivazione del norovirus umano, ha anche il potenziale per essere applicato ad altri virus senza involucro come il rinovirus o l'epatite A.To iniziare, diluire la proteina del capside maggiore del norovirus umano purificato, assemblata in capsidi a 50 microgrammi per millilitro in soluzione salina tamponata con fosfato 1X. Utilizzare un volume massimo di 15 microlitri nelle singole provette PCR tappate.

Assicurarsi che la provetta contenga almeno 600 nanogrammi di capside e che ci siano 600 nanogrammi di capside per combinazione di ligandi di trattamento. Quindi, preriscaldare il termociclatore al trattamento termico desiderato. Quindi, preriscaldare un termociclatore aggiuntivo a quattro gradi Celsius per un raffreddamento immediato.

Aggiungere i tubi con la soluzione di capside al termociclatore per il tempo desiderato. Dopo il riscaldamento, trasferire immediatamente i tubi nel ciclatore preraffreddato a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Far girare brevemente le provette nella centrifuga per far arrivare tutte le goccioline sul fondo della provetta.

Diluire le soluzioni di capside trattate e il PBS a tre microgrammi per millilitro. Assicurarsi che ci siano almeno 200 microlitri di capside trattato diluito. Successivamente, applicare 100 microlitri di soluzione di capside su ciascun pozzetto assicurandosi che ci siano almeno due pozzetti per trattamento.

Inoltre, includere due pozzetti di controllo con 100 microlitri di PBS per ogni ligando. Ciò fornisce l'assorbanza di fondo del saggio. Coprire il piatto con un coperchio e sigillare i bordi con pellicola di paraffina per ridurre l'evaporazione.

Lasciare la piastra per una notte su un'incubatrice agitata a quattro gradi Celsius o per due ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere le soluzioni di capside trattate dalla piastra. Quindi, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di tampone bloccante.

Incubare per due ore a temperatura ambiente o sigillare a quattro gradi Celsius durante la notte. Nel frattempo, diluire l'aptamero biotinilato in un micromolare in acqua priva di nucleasi. Assicurarsi che ci sia una soluzione sufficiente per un totale di 200 microlitri per ogni trattamento.

Inoltre, diluire l'HPGA biotinilato scelto a 30 microlitri per millilitro nel tampone bloccante. Ancora una volta, assicurarsi che ci sia una soluzione sufficiente per un volume totale di 200 microlitri per ogni trattamento. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone bloccante e lavare la piastra tre volte con 200 microlitri per pozzetto di PBST.

Picchiettare il piatto a testa in giù su carta assorbente sterile per asciugare l'umidità residua. Successivamente, a 100 microlitri per pozzetto delle soluzioni leganti il ligando, assicurando che ci siano due pozzetti per combinazione di ligandi di trattamento termico, incubare la piastra coperta su un agitatore orbitale a circa 60 giri/min per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato i pozzetti, come descritto nel protocollo di testo, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di 0,2 microgrammi per millilitro di streptavidina, rafano, perossidasi e PBS.

Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente su uno shaker orbitale prima di lavare nuovamente i pozzetti. Quindi, dopo un altro lavaggio, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di substrato TMB e lasciare che il colore si sviluppi per cinque-15 minuti. Osserva i pozzetti per il colore.

Assicurarsi di sviluppare costantemente per lo stesso tempo tra le piastre replicate e prestare attenzione all'intervallo di assorbanza del lettore di piastre utilizzato. Arrestare lo sviluppo della reazione con 100 microlitri per pozzetto di acido fosforico molare. Leggere immediatamente la lastra a 450 nanometri.

Creare una nuova procedura operativa standard di dimensione nel software dello strumento DLS come descritto nel protocollo di testo. Quindi, selezionare la freccia verde di esecuzione all'interno del software e assegnare un nome al campione. Diluire le particelle simili al virus trattate termicamente o VLP da uno a 10 in 1X PBS per una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro.

Quindi, filtrare il campione con una dimensione dei pori di un micron per rimuovere le particelle di polvere. Il DLS è molto sensibile alla polvere, poiché le particelle grandi diffondono molta più luce delle particelle piccole. Trasferire 50 microlitri di VLP diluiti in una cuvetta monouso di piccolo volume.

Inserire la cuvetta nella camera del campione dello strumento. Inizia la corsa e utilizza le schede di adattamento cumulativo del correlatore e dei consigli degli esperti per valutare la qualità dei dati. Durante la corsa, verificare che la dispersione del poli del valore dell'indice sia inferiore a 0,3 che rappresenta una misura di qualità.

Nella scheda multiview, assicurarsi che il coefficiente di correlazione sia costante e vicino ma non superiore a uno in un breve periodo di tempo e scenda bruscamente a zero in un momento successivo, caratteristica della dimensione delle particelle. Utilizza la scheda dei consigli degli esperti per un feedback sulla qualità dei dati durante le misurazioni. Al termine della misurazione, controllare nuovamente che la dispersione del poligono del valore dell'indice sia inferiore a 0,3.

Assicurarsi che la linea di adattamento cumulativo segua fedelmente i punti dati nella scheda di adattamento cumulativo. Creare una nuova procedura operativa standard di dimensione nel software dello strumento DLS, come descritto nel protocollo di testo. Selezionare la freccia di esecuzione all'interno del software per aprire e denominare un nuovo campione e consentire allo strumento di raggiungere l'equilibrio della temperatura.

Trasferire la sospensione VLP in una cuvetta di quarzo di piccolo volume, evitare bolle e pipettare lentamente contro la parete della cuvetta. Dopo che lo strumento ha raggiunto l'equilibrio della temperatura, inserire la cuvetta nella camera del campione. Dopo aver atteso 10 secondi affinché la temperatura del campione si equilibri, avviare la corsa e contemporaneamente avviare un timer.

Arrestare il timer al termine della prima misurazione. Prendi questo tempo come primo punto temporale. Ottenere i punti temporali successivi dai tempi di misurazione registrati dal software.

Eseguire il trattamento termico come in precedenza, ad eccezione della sostituzione del PBS con cumuli da 10 millimolari, pH 7,4 e non diluire ulteriormente i capsidi dopo il trattamento. Quindi, pipettare l'intera goccia da 15 microlitri di soluzione di capside trattata su un film di paraffina. Afferra il bordo della griglia con una pinzetta che consente loro di chiudersi sul bordo per tenere la griglia e posizionare la griglia con il lato in carbonio rivolto verso il basso sopra la goccia di soluzione trattata.

Lasciare incubare la griglia per 10 minuti per consentire al capside di attaccarsi alla griglia. A seconda della purezza della preparazione del capside, aggiungere lavaggi della soluzione del cumulo sotto forma di goccioline da 10 a 15 microlitri poste in linea dopo la gocciolina di capside trattata. Dopo 10 minuti, raccogli la griglia con la gocciolina.

Posiziona la griglia quasi perpendicolarmente a un pezzo di carta da filtro per allontanare la gocciolina. Quindi, utilizzare la griglia per raccogliere la goccia di tampone cumuli da 10 a 15 microlitri e tenerla premuta per 30 secondi. Dopo 30 secondi di lavaggio, rimuovere con un altro pezzo di carta da filtro.

Quindi, posizionare una goccia da 15 microlitri di soluzione di acetato di uranile al due percento sul film di paraffina in un'area vuota. Raccogli la gocciolina di acetato di uranile con la griglia e tienila premuta per 45 secondi. Quindi, rimuovere l'acetato di uranile assicurandosi di rimuovere la maggior parte della soluzione.

Posiziona la griglia con il lato di carbonio rivolto verso l'alto su un pezzo di carta da filtro facendo attenzione che la griglia non si attacchi all'umidità sulle pinzette. Quindi, posizionare la carta da filtro con la griglia su di essa in una capsula di Petri di vetro aperta. Dopo aver ripetuto questo processo per tutti i trattamenti, posizionare le metà della capsula di Petri con le griglie in un essiccatore per una notte ad asciugare prima dell'osservazione con la TEM.

Il grafico seguente mostra la riduzione della capacità di legame dei capsidi del norovirus umano nel tempo quando trattati a 68 gradi Celsius. Come si può notare, il binding HPGA è il primo segnale a scomparire completamente. A questo punto, si presume che la grande maggioranza dei capsidi nella soluzione abbia perso la capacità di legare gli HPGA della cellula ospite e quindi non possa essere internalizzata nella cellula.

Il legame dell'aptamero rispecchia quello dell'HBGA, anche se è necessario un trattamento termico leggermente maggiore per rimuovere il segnale. Di seguito è mostrata una curva del coefficiente di correlazione DLS rappresentativa di dati di buona qualità. Al tempo vicino allo zero, il correlogramma è costante ad un valore vicino, ma inferiore a uno.

Quindi scende bruscamente a zero in un momento caratteristico della dimensione delle particelle. I risultati delle dimensioni di questo esperimento possono probabilmente essere attendibili. Al contrario, questa curva del coefficiente di correlazione è rappresentativa di dati di scarsa qualità.

Il correlogramma inizia con un valore superiore a uno e scende gradualmente fino a zero. I risultati di questo esperimento non devono essere utilizzati. Qui, i dati sulla dimensione delle particelle mostrano un chiaro profilo di aggregazione per i capsidi trattati a 68 gradi Celsius con super aggregati che si formano dopo circa 20 minuti.

Il momento in cui avviene la super aggregazione è caratteristico della suscettibilità delle VLP a tale trattamento. Questa figura visualizza i risultati della TEM per il trattamento termico dei capsidi di norovirus umano. Qui, i capsidi venivano trattati a 60-80 gradi Celsius da sinistra a destra.

Come si può vedere, la morfologia dei capsidi cambia chiaramente con il trattamento man mano che i capsidi si aggregano e si denaturano. Un fenomeno simile si nota per i capsidi trattati a 68 gradi Celsius da zero a 25 minuti. Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere eseguite da una a 24 ore se eseguite correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha fornito un'ulteriore strada ai ricercatori nel campo della virologia alimentare per esplorare i meccanismi e gli effetti dell'inattivazione sul capside dei norovirus umani. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la RT-PCR in tempo reale con e senza pretrattamento con RNasi, la pagina STS dei capsidi virali e i saggi di placca con virus surrogati coltivabili per ottenere una visione complessiva più completa della riduzione virale dopo un determinato trattamento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il legame del ligando, la diffusione dinamica della luce e la microscopia elettronica a trasmissione per ottenere ulteriori informazioni meccanicistiche sugli effetti del trattamento di inattivazione sul capside del norovirus umano.

Non dimenticare che lavorare con alcuni dei reagenti utilizzati può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale e seguire le migliori pratiche di sicurezza del laboratorio.