Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

L'obiettivo generale di questi metodi è ottenere ulteriori informazioni sugli effetti del trattamento sull'infettività o sull'integrità del capside del norovirus umano. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'inattivazione dei virus non rivestiti, ad esempio cosa accade alla capacità infettiva del capside virale dopo un determinato trattamento.

Il vantaggio principale di questi metodi è che possono fornire ulteriori informazioni meccanicistiche sull'azione di un determinato trattamento sul virus. Sebbene questo metodo possa offrire spunti sulle strategie di inattivazione del norovirus umano, ha anche il potenziale per essere applicato ad altri virus privi di involucro, come il rhinovirus o l'epatite A.

Per iniziare, diluire la proteina maggioritaria del capside del virus della gastroenterite umana purificata, assemblata in capside, fino a 50 microgrammi per millilitro in soluzione salina fosfato 1X. Utilizzare un volume massimo di 15 microlitri nei singoli tubi PCR con tappo.

Assicurarsi che il tubo contenga almeno 600 nanogrammi di capside e che siano presenti 600 nanogrammi di capside per ogni combinazione di ligando trattamento. Successivamente, preriscaldare il termociclatore alla temperatura desiderata per il trattamento termico. Quindi, preriscaldare un termociclatore aggiuntivo a quattro gradi Celsius per il raffreddamento immediato.

Aggiungere le provette con la soluzione di capside nel termociclatore per il tempo desiderato. Dopo il riscaldamento, trasferire immediatamente le provette nel termociclatore pre-raffreddato a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare brevemente le provette per far scendere tutte le goccioline in fondo alla provetta.

Diluire le soluzioni di capside trattate e il PBS a tre microgrammi per millilitro. Assicurarsi di avere almeno 200 microlitri di capside trattato diluito. Successivamente, applicare 100 microlitri di soluzione di capside in ciascun pozzetto, assicurandosi di avere almeno due pozzetti per ogni trattamento. In aggiunta, includere due pozzetti di controllo con 100 microlitri di PBS per ciascun ligando. Questo fornisce l'assorbanza di fondo del saggio. Coprire la piastra con un coperchio e sigillare i bordi con pellicola paraffinata per ridurre l'evaporazione. Lasciare la piastra in incubazione tutta la notte su un incubatore agitatore a quattro gradi Celsius oppure per due ore a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, rimuovere le soluzioni di capside trattate dalla piastra. Quindi, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di buffer bloccante. Incubare per due ore a temperatura ambiente oppure sigillare e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.

Nel frattempo, diluire l'aptamero biotinilato a un micromolare in acqua priva di nucleasi. Assicurarsi che ci sia una quantità sufficiente di soluzione per un totale di 200 microlitri per ogni trattamento.

Inoltre, diluire l'HPGA biotinilato scelto a 30 microlitri per millilitro nel buffer di blocco. Ancora una volta, assicurarsi che ci sia soluzione sufficiente per un volume totale di 200 microlitri per ogni trattamento.

Dopo l'incubazione, rimuovere il buffer di blocco e lavare la piastra tre volte con 200 microlitri per pozzetto di PBST. Tamponare la piastra capovolta su tovaglioli di carta sterili per asciugare l'umidità residua. Successivamente, aggiungere 100 microlitri per pozzetto delle soluzioni di legame del ligando, assicurandosi che vi siano due pozzetti per ogni combinazione ligando-trattamento termico, e incubare la piastra coperta su un agitatore orbitale a circa 60 giri al minuto per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo aver lavato le pozzette come descritto nel protocollo nel testo, aggiungere 100 microlitri per pozzetta di streptavidina perossidasi da rafano piccante a 0,2 microgrammi per millilitro in PBS.

Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata su un agitatore orbitale prima di lavare nuovamente le pozzette. Successivamente, dopo un altro lavaggio, aggiungere 100 microlitri per pozzetta di substrato TMB e lasciare sviluppare il colore per cinque-quindici minuti. Osservare le pozzette per rilevare la formazione del colore.

Assicurarsi di sviluppare in modo costante per lo stesso periodo di tempo tra le piastre replicate ed essere consapevoli dell'intervallo di assorbanza del lettore di piastre utilizzato. Arrestare lo sviluppo della reazione aggiungendo 100 microlitri per pozzetto di acido fosforico uno molare. Leggere immediatamente la piastra a 450 nanometri.

Creare una nuova procedura operativa standard per la dimensione nel software dello strumento DLS, come descritto nel protocollo testuale. Quindi, selezionare la freccia verde per l'esecuzione all'interno del software e assegnare un nome al campione.

Diluire le particelle simili a virus o VLP da uno a 10 in PBS 1X per ottenere una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro. Successivamente, filtrare il campione con un filtro avente pori di dimensione pari a un micron per rimuovere le particelle di polvere. La diffusione dinamica della luce (DLS) è molto sensibile alla polvere, poiché le particelle grandi disperdono molta più luce rispetto alle particelle piccole. Trasferire 50 microlitri delle VLP diluite in una cuvetta monouso di piccolo volume. Inserire la cuvetta nella camera del campione dello strumento. Avviare la misurazione e utilizzare le schede di analisi cumulante del correlogramma e i suggerimenti dell'esperto per valutare la qualità dei dati. Durante la misurazione, verificare che il valore dell'indice di polidispersione sia inferiore a 0,3, indicativo di una misurazione di qualità.

Nella scheda Multiview, assicurarsi che il coefficiente di correlazione sia costante e vicino, ma non superiore, a uno in un breve intervallo di tempo e diminuisca bruscamente fino a zero in un momento successivo, caratteristica tipica della dimensione delle particelle. Utilizzare la scheda Consigli esperti per ricevere un feedback sulla qualità dei dati durante le misurazioni. Al termine della misurazione, verificare nuovamente che l'indice di polidispersione abbia un valore inferiore a 0,3.

Assicurarsi che la linea di adattamento dei cumulanti segua da vicino i punti dati nella scheda di adattamento dei cumulanti. Creare una nuova procedura operativa standard per la dimensione nel software dello strumento DLS come descritto nel protocollo testuale. Selezionare la freccia di esecuzione all'interno del software per aprire e assegnare un nome a un nuovo campione e consentire allo strumento di raggiungere l'equilibrio termico.

Trasferire la sospensione di VLP in una cuvetta in quarzo di piccolo volume, evitando bolle e pipettando lentamente contro la parete della cuvetta. Dopo che lo strumento ha raggiunto l'equilibrio termico, inserire la cuvetta nella camera del campione. Dopo aver atteso 10 secondi per consentire l'equilibrazione termica del campione, avviare la misurazione e contemporaneamente avviare un cronometro.

Fermare il cronometro al termine della prima misurazione. Considerare questo tempo come il primo punto temporale. Ottenere i punti temporali successivi dai tempi di misurazione registrati dal software.

Eseguire il trattamento termico come in precedenza, sostituendo il PBS con HEPES 10 millimolare, pH 7,4, e non diluire ulteriormente i capside dopo il trattamento. Successivamente, pipettare l'intera goccia di 15 microlitri della soluzione di capside trattata su un film di paraffina. Afferrare il bordo della griglia con una pinzetta, chiudendola sul bordo per tenere ferma la griglia, e posizionare la griglia con il lato al carbonio rivolto verso il basso sulla goccia della soluzione trattata.

Lasciare in incubazione la griglia per 10 minuti per consentire l'attacco del capside alla griglia. A seconda della purezza della preparazione del capside, aggiungere lavaggi con soluzione HEPES sotto forma di gocce da 10-15 microlitri posizionate in successione dopo la goccia di capside trattato. Dopo 10 minuti, raccogliere la griglia con la goccia.

Posizionare la griglia quasi perpendicolarmente a un pezzo di carta da filtro per assorbire la goccia. Quindi, utilizzare la griglia per raccogliere la goccia di 10-15 microlitri di tampone HEPES e mantenerla per 30 secondi. Dopo 30 secondi di tempo di lavaggio, asportare la goccia con un altro pezzo di carta da filtro.

Successivamente, posizionare una goccia di 15 microlitri di soluzione al due percento di acetato di uranile sul film di paraffina in un'area vuota. Raccogliere la goccia di acetato di uranile con la griglia e mantenerla per 45 secondi. Quindi, asportare l'acetato di uranile tramite capillarità, assicurandosi di rimuovere la maggior parte della soluzione.

Posizionare la griglia con il lato di carbonio rivolto verso l'alto su un pezzo di carta filtrante, avendo cura che la griglia non aderisca all'umidità sulle pinzette. Successivamente, collocare la carta filtrante con sopra la griglia in una capsula di Petri di vetro aperta. Dopo aver ripetuto questo procedimento per tutti i trattamenti, posizionare le mezze capsule di Petri con le griglie in un essiccatore per tutta la notte per farle asciugare prima dell'osservazione al MET.

Il seguente grafico mostra la riduzione della capacità di legame dei capside del norovirus umano nel tempo quando trattati a 68 gradi Celsius. Come si può osservare, il legame con HPGA è il primo segnale a scomparire completamente. A questo punto, si ritiene che la grande maggioranza dei capside in soluzione abbia perso la capacità di legarsi alle HPGA delle cellule ospiti e quindi non possa essere internalizzata nella cellula.

Il legame dell'aptamero rispecchia quello dell'HBGA, anche se è richiesto un trattamento termico leggermente più intenso per rimuovere il segnale. Qui è mostrata una curva del coefficiente di correlazione DLS rappresentativa di dati di buona qualità. A un tempo prossimo a zero, il correlogramma è costante a un valore prossimo, ma inferiore a uno.

Poi diminuisce bruscamente a zero in un tempo caratteristico della dimensione delle particelle. I risultati sulla dimensione ottenuti da questo esperimento sono probabilmente affidabili. Al contrario, questa curva del coefficiente di correlazione è rappresentativa di dati di scarsa qualità.

Il correlogramma inizia con un valore superiore a uno e diminuisce gradualmente fino a zero. I risultati di questo esperimento non devono essere utilizzati. In questo caso, i dati sulla dimensione delle particelle mostrano un chiaro profilo di aggregazione per le capside trattate a 68 gradi Celsius, con la formazione di super aggregati dopo circa 20 minuti.

Il momento in cui si verifica la super aggregazione è caratteristico della suscettibilità dei VLP a tale trattamento. Questa figura mostra i risultati al MET per il trattamento termico dei capside del virus della gastroenterite umana. In questo caso, i capside sono stati sottoposti a trattamento a temperature comprese tra 60 e 80 gradi Celsius da sinistra a destra.

Come si può osservare, la morfologia del capside cambia chiaramente con il trattamento, poiché i capside si aggregano e si denaturano. Un fenomeno simile viene osservato per i capside trattati a 68 gradi Celsius per un periodo compreso tra zero e 25 minuti.

Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere eseguite in un periodo compreso tra 1 e 24 ore, se effettuate correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha fornito un'ulteriore possibilità ai ricercatori nel campo della virologia alimentare per esplorare i meccanismi e gli effetti dell'inattivazione sul capside dei norovirus umani. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come una RT-PCR in tempo reale con e senza pretrattamento con RNasi, elettroforesi SDS-PAGE dei capside virali e saggi di placca con virus surrogate coltivabili, al fine di ottenere una visione complessiva più completa della riduzione virale dopo un determinato trattamento. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il legame con ligandi, la diffusione dinamica della luce e la microscopia elettronica a trasmissione per ottenere ulteriori informazioni meccanistiche sugli effetti del trattamento di inattivazione sul capside del norovirus umano.

Ricordare che lavorare con alcuni dei reagenti utilizzati può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale e seguire le migliori pratiche di sicurezza in laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura.