Un metodo pratico per estrazione ed analisi con cromatografia liquida dei neurotrasmettitori della catecolamina e loro metaboliti

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare contemporaneamente tre neurotrasmettitori monoamminici e due dei loro metaboliti nelle urine del neonato tramite una comoda estrazione in fase solida accoppiata a cromatografia liquida ad alta pressione con rilevamento elettrochimico. Questo metodo è in grado di prevedere e determinare i composti bersaglio instabili in un campione completo con un funzionamento semplice in breve tempo. Gli esempi possono essere facilmente pre-puliti da un quorum a faccia solida ristretta e impacchettato con fibre e gli analiti nel campione possono essere facilmente arricchiti, disciolti e rilevati su un sistema di rivelazione elettrochimica.

L'idea di questo metodo è nata quando ci siamo resi conto che l'estrazione e l'analisi dei neurotrasmettitori catecolamine nei fluidi biologici è fondamentale per valutare la funzione resistente e le malattie correlate. Gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'esposizione alla luce deve essere evitata e il tempo di pretrattamento dovrebbe essere il più breve possibile. A dimostrare la procedura, abbiamo Lanlan Wei e Qing Han, due studenti di dottorato del nostro laboratorio.

Per iniziare, preparare due milligrammi per millilitro di soluzione madre di DPBA sciogliendo due milligrammi del composto in un millilitro di acqua distillata. Conservare la soluzione al buio a quattro gradi Celsius. Quando si preparano gli estensori dell'analita, tenere presente che la struttura chimica e le proprietà delle catecolamine sono instabili e, poiché si decompongono facilmente, gli estensori del processo di preparazione devono essere molto veloci e l'esposizione alla luce solare sottile deve essere evitata.

Pesare 1,0 milligrammi di noradrenalina, epinefrina, dopamina, MHPG, DOPAC e DHBA standard interno in provette per microcentrifuga separate da 1,5 millilitri. Aggiungere 1,0 millilitri di acqua distillata per sciogliere ciascuno dei composti, ad eccezione dell'epinefrina, che deve essere disciolta in una soluzione di acido cloridrico a 0,01 moli per litro. Far oscillare gli standard preparati al buio ad alta velocità fino a quando gli analiti non si dissolvono completamente.

Queste sono le scorte primarie e possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius per un massimo di diverse settimane. Per preparare le riserve di analita secondarie di noradrenalina, epinefrina, dopamina, DOPAC e MHPG, trasferire cinque microlitri di ciascuna riserva di analita primaria in 4.975 microlitri di acqua distillata in provette da centrifuga separate da cinque millilitri. Prepara queste soluzioni fresche ogni giorno e conservale al buio a quattro gradi Celsius fino all'uso.

Per il DHBA, trasferire cinque microlitri di materia prima in 4.995 microlitri di acqua distillata in una provetta da centrifuga da cinque millilitri e conservarla al buio separatamente a quattro gradi Celsius. Effettuare ulteriori diluizioni con l'analita secondario per creare una curva standard. Conservare le soluzioni al buio a quattro gradi Celsius e prepararle fresche ogni giorno.

Successivamente, testare la tensione ottimale del rivelatore ECD, utilizzando il calcio standard con la concentrazione corretta. Variare la tensione per trovare un valore in cui gli analiti hanno il miglior aspetto di picco. Per preparare 10 millilitri di solvente eluente, utilizzare 5,5 millilitri di acqua distillata, quindi aggiungere 1,5 millilitri di acetonitrile e tre millilitri di acido fosforico, goccia a goccia, nell'acqua.

Per preparare la fase mobile, misurare i componenti elencati nel protocollo di testo in una bottiglia pulita da un litro. Aggiungere 40 millilitri di acetonitrile e acqua distillata a 1.000 millilitri. Agitare e vibrare ad ultrasuoni per 15 minuti fino a quando la materia nella soluzione non si è completamente sciolta.

Utilizzando un pHmetro con un elettrodo di vetro, regolare il valore del pH della fase mobile a 4,21 con una soluzione satura di idrossido di sodio. Filtrare la fase mobile con una membrana microporosa in fluoruro di polivinilidene da 0,45 micron e un dispositivo di aspirazione a vuoto per rimuovere le impurità. Utilizzare la vibrazione ultrasonica per 15 minuti per degassare la fase mobile ogni volta prima dell'uso.

Quindi, agitare e centrifugare i campioni urinari a 1.510 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente per rimuovere la maggior parte dell'interferenza del particolato. Raccogli i surnatanti e scarta il sedimento per ulteriori esperimenti. Per estrarre gli analiti in modo efficace, procedere all'estrazione in fase solida con fibra impaccata, o pretrattamento PFSPE, subito dopo la centrifugazione.

Per attivare le nanofibre, premere 100 microlitri di metanolo e 100 microlitri di acqua in sequenza attraverso la colonna PFSPE utilizzando una siringa da cinque millilitri in modo lento e gocciolante. Il campione di urina deve essere miscelato con la soluzione di DPPA per migliorarne l'idrofobicità e aiutare le catecolamine e i metaboliti ad assorbire le fibre. Anche la soluzione DHBA deve essere aggiunta come standard interno.

Mescolare 100 microlitri di campione di urina con 100 microlitri di soluzione DPBA da due milligrammi per millilitro e 30 microlitri da 100 nanogrammi per millilitro di soluzione standard interna DHBA in una provetta Eppendorf da 0,5 millilitri. Quindi premere la soluzione del campione miscelato attraverso la colonna PFSPE con una siringa di plastica a gas da cinque millilitri utilizzando la forza della pressione dell'aria. Lisciviare la colonna tre volte utilizzando una siringa di plastica a gas da cinque millilitri per caricare 100 microlitri della soluzione DPBA nella colonna SPE e spingere lentamente la soluzione attraverso la cartuccia con la pressione dell'aria.

Questa fase di risciacquo è necessaria perché la soluzione DPBA è in grado di rimuovere le impurità mentre gli analiti vengono trattenuti, migliorando così la sensibilità e la selettività degli analiti. Quindi, caricare 50 microlitri di eluente sulla colonna PFSPE e spingerlo attraverso la colonna, raccogliendo l'eluato con una provetta Eppendorf da 0,5 millilitri. Accendere il degasatore HPLC per degassare l'aria nel sistema.

Prima delle analisi dei campioni, il sistema deve funzionare per più di 0,5 ore con la fase mobile per equilibrare e ridurre il rumore di base. Campionare 20 microlitri di eluato utilizzando un campionatore automatico, quindi iniettarlo nel sistema HPLC ECD. Al termine delle esecuzioni, spegnere la cella del rilevatore utilizzando l'interfaccia del rivelatore.

Non spegnere la cella con l'interruttore sul retro del rilevatore, poiché ciò potrebbe danneggiare lo strumento. Modificare manualmente la composizione della fase mobile al 10% di metanolo e al 90% di acqua. Dopo aver funzionato per almeno 30 minuti, cambiare manualmente la fase mobile in metanolo di grado HPLC.

Far funzionare il sistema per circa 15 minuti per proteggerlo nel metanolo. La mancata esecuzione di questo passaggio dopo il tempo di funzionamento consigliato potrebbe causare danni alla colonna e al rilevatore. Chiudere il flusso, quindi spegnere il degasatore.

Procedere all'analisi delle catecolamine come descritto nel protocollo di testo. Il cromatogramma di un campione di acqua addizionata con i bersagli e lo standard interno viene mostrato senza estrazione. Nella condizione HPLC del protocollo, i cinque picchi target del metodo PFSPE sono ben separati e significativamente più alti di quelli estratti da una cartuccia commerciale di acido fenilboronico.

Inoltre, il picco DOPAC non è apparso nel risultato dell'estrazione della cartuccia PBA, indicando che la colonna PBA non era in grado di estrarre DOPAC. Quando il campione di urina è stato estratto, il metodo PFSPE non solo è stato in grado di estrarre i bersagli con una buona identificazione dei picchi, ma anche di eliminare la maggior parte dell'interferenza nelle urine. Le curve di calibrazione sono state costruite per ogni composto tracciando il rapporto tra l'area del picco, mostrando una buona linearità con bassa concentrazione.

Per la convalida con campioni di urina reali, sono stati testati i campioni urinari di 28 neonati ad alto rischio e 22 neonati sani. Mentre alcune catecolamine non erano significativamente diverse tra i gruppi ad alto rischio e sani, i neonati ad alto rischio avevano quantità più elevate del metabolita MHPG rispetto al gruppo di controllo. Pertanto, il livello di MHPG urinario può essere un potenziale marcatore per l'identificazione precoce dei neonati ad alto rischio.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti. Durante il tentativo di eseguire la procedura, è importante ricordare di preparare le ceneri fresche, operare rapidamente e prevenire l'esposizione alla luce solare diretta. Anche l'aggiunta di difenilborato-soluzione acida nelle fasi di assorbimento e risciacquo è fondamentale.

A seguito di questa procedura, come misure mancanza di terminazione delle catecolamine e dei metaboliti nel plasma o nel liquido cerebrospinale. Alsliver può essere eseguito per determinare l'universalità di questo protocollo nel test degli altri fluidi biologici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per studiare la relazione tra i deficit dello sviluppo neurologico e il livello di catecolamine urinarie nei campioni dei bambini.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il metodo di estrazione in fase solida con figure nair e un semplice dispositivo, il PCE PS fibule d'aria DPBA può aiutare a ripulire i neurotrasmettitori catecolamine nei campioni di urina. Questa tecnica si estende alla diagnosi precoce della cassi a rischio di danno cerebrale nei neonati. Perché l'analisi comparativa ha rivelato differenze anormali nell'MHPG unario dei bambini autistici, indicando che i metaboliti delle catecolamine potrebbero essere importanti marcatori candidati.