Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

L'obiettivo generale di questo metodo è valutare quantitativamente la localizzazione e la distribuzione delle cellule progenitrici cardiache durante l'organogenesi cardiaca. Questo metodo può aiutare a rispondere a risposte chiave nel campo dello sviluppo cardiaco permettendoci di osservare la localizzazione delle popolazioni progenitrici cardiache durante il normale sviluppo embrionale. I principali vantaggi di questa tecnica sono che le immagini volumetriche possono fornire informazioni quantitative sulla dinamica a livello tissutale e che la pipeline di analisi può essere automatizzata per una migliore riproducibilità.

Sebbene questo metodo fornisca informazioni sull'organogenesi cardiaca precoce, può essere applicato anche allo studio generale dell'embriogenesi precoce o alla morfogenesi di altri organi di interesse. La mattina dell'ottavo giorno embrionale, disinfettare l'addome del topo gravido con etanolo al 70% e praticare un'incisione addominale sia attraverso la pelle che la parete del corpo. Iniziando sopra un ovidotto, sezionare attentamente il grasso lungo il lato dell'utero fino alla cervice.

Fai un'incisione attraverso la cervice e continua fino all'estremità superiore dell'altro taglio dell'ovidotto per rilasciare l'intero utero. Lavare il sangue in eccesso dall'utero in un piatto di 10 centimetri contenente PBS fresco e tagliare il mesometrio tra ogni deciduoma. Trasferisci gli embrioni in un piatto di sei centimetri contenente PBS fresco al microscopio da dissezione e usa una pinza sottile numero cinque per rimuovere il tessuto uterino dal tessuto deciduale.

Quindi, taglia con cura la punta della metà embrionale del deciduoma per rivelare gli embrioni, pizzicando il deciduoma per spingere ed estrarre con cura il primo embrione. Sezionare quanto più tessuto embrionale in eccesso possibile senza danneggiare la morfologia dell'animale e utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare l'embrione in una provetta da 1,5 millilitri contenente PBS fresco su ghiaccio. Quando tutti gli embrioni sono stati raccolti, aspirare il PBS da ogni provetta e sciacquare gli embrioni con PBS fresco.

Dopo aver aspirato accuratamente il PBS da ciascuna provetta, fissare gli embrioni in paraformaldeide al 4% per un'ora a temperatura ambiente, seguita da tre lavaggi con PBS fresco, quindi conservare gli embrioni a quattro gradi Celsius. Iniziare sostituendo il PBS con un millilitro di tampone bloccante per un'incubazione di quattro ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, sostituire il tampone bloccante con la miscela di anticorpi primari appropriata e il tampone bloccante diluito per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.

La mattina successiva, aspirare l'anticorpo in eccesso e lavare gli embrioni tre volte per un'ora per lavaggio in Triton 0,1% in PBS. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere la miscela di anticorpi secondari appropriata agli embrioni per un'incubazione di tre ore a temperatura ambiente, seguita da tre lavaggi come appena dimostrato. Successivamente, controcolorare gli embrioni con DAPI in PBS per 10 minuti seguiti da due lavaggi di cinque minuti, quindi sospendere lentamente gli embrioni in un mezzo di montaggio anti-sbiadimento che consente agli embrioni di equilibrarsi per almeno un'ora con un leggero movimento periodico per aiutare i campioni a cadere nella soluzione.

Prima di montare gli embrioni, fare due pile parallele di cinque o sei strati di nastro adesivo biadesivo a 15-20 millimetri di distanza su un vetrino da microscopio per embrione e posizionare una goccia da 15 microlitri di terreno anti-sbiadimento su ciascun vetrino tra le pile di nastro. Trasferire con cura un embrione in ogni goccia e utilizzare un microscopio da dissezione e una pinza fine per posizionare gli embrioni con i lati anteriori rivolti lontano dal vetrino e con l'asse del corpo in linea con l'asse lungo dei vetrini. Per posizionare i vetrini, appoggiare prima un lato del vetro su una pila di nastro biadesivo e utilizzare una pinza per abbassare delicatamente il vetrino coprioggetti fino a quando non tocca l'altra pila di nastro.

È particolarmente importante posizionare e montare con cura gli embrioni. Gli embrioni che non sono posizionati correttamente saranno molto più difficili da visualizzare e potrebbero richiedere un'ulteriore elaborazione per ottenere buoni dati quantificabili. Utilizzare una pipetta per aggiungere ulteriore mezzo anti-sbiadimento tra il vetrino e il vetrino coprioggetti per evitare che il campione si secchi durante l'imaging e selezionare l'obiettivo con l'ingrandimento più alto disponibile che consenta di catturare l'intera regione della mezzaluna cardiaca in un unico campo visivo.

Quindi imposta i parametri di imaging utilizzando le migliori pratiche di imaging standard e utilizza le frequenze di campionamento Nyquist per determinare le dimensioni dei voxel XYZ di ciascun embrione. Per analizzare le immagini degli embrioni, caricare i set di dati delle immagini grezze nel software di analisi delle immagini appropriato e aprire il primo file nella vista di superamento. I dati verranno caricati in una vista 3D nella modalità di proiezione alla massima intensità.

Aprire la finestra di regolazione del display e selezionare solo il canale di riferimento. Regolare la soglia dell'immagine in base alle esigenze. Se il rapporto segnale/rumore è troppo basso per la segmentazione, regolare la gamma.

Seguire le migliori pratiche durante l'acquisizione delle immagini è fondamentale per ottenere dati adeguati e dipenderà dalla specifica configurazione di microscopia utilizzata. Se sono necessarie regolazioni della gamma, queste immagini non devono essere utilizzate per confrontare le intensità di fluorescenza. Utilizzare la finestra di dialogo dell'algoritmo di superficie per creare una nuova superficie per il canale di riferimento e selezionare la casella di origine di interesse solo per il segmento.

Regolare la regione del riquadro di delimitazione in modo che contenga la regione di interesse delineata dalla macchia di riferimento e selezionare il canale di riferimento dal menu a discesa del canale di origine. Imposta l'arrotondamento a metà della dimensione del voxel Z e usa i cursori di soglia per regolare il limite inferiore alla sua intensità assoluta per assicurarti che la superficie non si estenda oltre il segnale del canale. Filtra gli oggetti per numero di voxel o volume, rifiutando qualsiasi oggetto di sfondo che l'algoritmo potrebbe aver generato e completa l'algoritmo.

Quindi, selezionare la superficie appena creata e scegliere la funzione di impostazione della maschera dalla finestra di modifica. Selezionare il canale sperimentale di interesse, facendo attenzione che sia selezionata la casella di controllo Duplica canale prima di applicare la maschera, e selezionare il canale della maschera solo nella finestra di regolazione della visualizzazione. Quindi crea una nuova superficie come appena dimostrato.

Per ottenere i dati volumetrici con ciascuna superficie selezionata, aprire la sottoscheda dettaglio nella scheda delle statistiche e selezionare i valori medi dal menu a discesa. Il volume totale della superficie si troverà nella colonna della somma della tabella generata. Qui, viene mostrato un embrione embrionale di topo al giorno 8,25 con cellule progenitrici cardiovascolari ventricolari positive alla GFP marcate con un anticorpo a mezzaluna anti-cardiaco come appena dimostrato.

Dopo aver selezionato il canale di riferimento per il tessuto colorato, l'intensità e la gamma vengono regolate prima di iniziare l'algoritmo di creazione delle superfici. Viene selezionata la regione di interesse e viene scelto il livello di dettaglio della superficie. La superficie iniziale è sospesa in modo da includere tutto il segnale vero nella superficie.

Viene quindi eseguito il filtraggio per rimuovere piccoli frammenti di sfondo per ottenere una superficie di riferimento finale. Selezionando la superficie di riferimento, il canale di confronto può essere duplicato e mascherato. L'intensità e la gamma per questo canale vengono regolate prima di generare una seconda superficie attraverso la stessa sequenza di passi.

Il volume totale di ogni superficie viene quindi calcolato automaticamente e può essere confrontato sia quantitativamente che visivamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la qualità degli embrioni sezionati, l'efficienza degli anticorpi, l'orientamento di montaggio e la configurazione dell'imaging influenzano la qualità dei dati finali. Oltre a questa pipeline di analisi quantitativa, è possibile eseguire altri metodi come la deconvoluzione per produrre ulteriori dati qualitativi.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnologia ha aperto la strada ai ricercatori nello sviluppo cardiaco per esplorare le dinamiche di nuove popolazioni di progenitori cardiaci durante l'embriogenesi precoce.