Name: Neutralizzando le risposte dellanticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization lInfluenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Scopri l'assaggio di microneutralizzazione per misurare le risposte anticorpali neutralizzanti contro i virus influenzali H3N2 utilizzando cellule MDCK-SIAT1. Questo metodo valuta l'immunità post-vaccinazione nei sieri umani.

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Ringraziamo Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu e MS. Ashley Burroughs dalla divisione dell'Influenza del CDC per la loro revisione critica e assistenza nella preparazione di questo manoscritto. Si ringrazia il Dr. Adrian Reber dalla divisione dell'Influenza del CDC per la sua assistenza nel preparare la grafica della Figura 3. Infine, desideriamo ringraziare il Dr. M. Matrosovich, Marburg, in Germania, per fornire le cellule MDCK-SIAT1.

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</ol>

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi. Le risultanze e le conclusioni in questa pubblicazione sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni dei centri per controllo di malattia, la prevenzione e l'agenzia di finanziamento.

Il dosaggio di MN è uno dei principali saggi utilizzati per i test sierologici dell'influenza per rilevare le risposte di anticorpi dell'influenza infezione o la vaccinazione. I titoli generati da saggi di MN sono spesso utilizzati come il risultato primario di molti studi di seroepidemiology di riossidazione. MN saggi sono anche ampiamente utilizzati per la sero-diagnosi e la valutazione dell'immunogenicità del vaccino. Internazionali inter-laboratorio studi sono stati condotti per confrontare saggi MN eseguite in più l...

Virus influenzali continuano a causare morbilità e mortalità nella popolazione umana ogni anno. HA è la glicoproteina di superficie principale di virus influenzali. Anticorpi neutralizzanti HA di targeting sono il principale meccanismo immune che correla con la protezione di infezione influenzale1,2. Emoagglutinazione inibizione (HI) saggi e saggi di MN sono due metodi ampiamente usati per misurare le risposte dell'anticorpo in sieri umani dopo di infezione o la vaccinazione influenzale3. Il test HI misura l'inibizione dell'anticorpo di emagglutinazione virus dei globuli rossi ed è considerato un saggio di surrogati. A differenza di HI, il dosaggio di MN può direttamente misurare i livelli di anticorpi nel siero umano che neutralizzano l'infezione di riossidazione in colture cellulari. Le cellule MDCK sono spesso utilizzate nell'isolamento del virus dell'influenza e MN saggi4.
Virus influenzali sono sottoposti costantemente deriva antigenica e MAIUSC, l'acquisizione di mutazioni HA proteine che possono alterare la specificità di legame del recettore del virus. Dal 2014, nuovi cluster di A(H3N2) virus è emerso e continuò a circolare fino alla stagione corrente. La maggior parte di questi virus appartenga al gruppo genetico 3C.2a e 3C.3a basato su analisi filogenetica delle proteine HA. Molti dei virus circolanti 3C.2a aveva ridotto la capacità di hemagglutinate globuli rossi e quindi non possono essere caratterizzati da HI saggi5. Saggi di neutralizzazione devono essere utilizzati per misurare le risposte dell'anticorpo a questi virus che non hemagglutinate6. Inoltre, gli studi hanno indicato che questi virus A(H3N2) contemporanei hanno alterato le proprietà di binding recettoriale rispetto ai precedenti A(H3N2) virus e tendono ad accumulare mutazioni cultura adattato e polimorfismo quando attraversate in vitro delle cellule culture7,8,9. Rispetto ai convenzionali cellule MDCK, MDCK-SIAT1 è una linea cellulare sviluppata da Matrosovich et al. mediante trasfezione stabile di cellule MDCK con cDNA di umano α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Questa linea cellulare esprime gli importi aumentati di α2, moiety 6-sialico galattosio e quantità in diminuzione di α2, acido 3-sialico moiety rispetto al padre di cellule MDCK10. Le cellule MDCK-SIAT1 sono indicate per migliorare i tassi di isolamento per A(H3N2) virus rispetto alle cellule MDCK11. Recentemente, Lin et al. ha riferito che di recente è emerso 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) dell'influenza virus umani, più fedeli repliche di virus e meglio infettività del virus sono stati raggiunti quando virus sono stati coltivati in linee cellulari MDCK-SIAT1 rispetto a cellule MDCK7. Così, le cellule MDCK-SIAT1 sono più adatti in saggi di MN per caratterizzare le risposte dell'anticorpo ai recenti cluster di A(H3N2) virus.
Qui descriviamo un'analisi di MN usando cellule MDCK-SIAT1 per misurare le risposte dell'anticorpo a contemporanea 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) virus in sieri umani. Virus coltivato in uova o da cellule può essere usato per questo test. Sieri di calore inattivato contenente anticorpi neutralizzanti sono prima diluiti serialmente, poi incubati con 100 TCID50/bene di A(H3N2) virus per consentire gli anticorpi nel siero da associare al virus. Le cellule MDCK-SIAT1 sono poi aggiunto alla miscela di anticorpo del virus e incubate per 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 per consentire il A(H3N2) virus di infettare le cellule MDCK-SIAT1 e replicare. Dopo l'incubazione durante la notte, le piastre sono fissate e la quantità di virus in ogni pozzetto è quantificata mediante un test ELISA che usando gli anticorpi monoclonali di anti-riossidazione A NP. La rilevazione di NP indica la presenza dell'infezione del virus e l'assenza di anticorpi neutralizzanti. Titolo dell'anticorpo di neutralizzazione è definita come il reciproco della più alta diluizione del siero che fornisce ≥ 50% inibizione dell'infettività del virus.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Medium Eagle modificato (DMEM) con alto glucosio</td><td>Scienze della vita</td><td>11965</td><td>Un componente critico della coltura cellulare sterile, della propagazione del virus e del terreno diluente</td></tr><tr><td>virale Siero bovino fetale (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) Frazione V, senza protasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Life Science</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Life Science</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G-418 sale disolfato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720-5G&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Science</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td> Life <td>Science</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>67-64-1</td><td>Utilizzato a una concentrazione dell'80%</td></tr><tr><td>Tampone fosfato-citrato con perborato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>O-fenilendiammina dicloridrato compressa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBQ1086V</td><td>1 compressa per 100 ml di acqua per colture cellulari</td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A510-P500</td><td>Usato 0,5 M di concentrazione finale</td></tr><tr><td>Etanolo, denaturato, 4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>Usato a una concentrazione del 70%</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Scienze della vita</td><td></td><td></td>1748048</tr><tr><td>RDE II "Seiken"</td><td>Denka Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NP topo monoclonale Ab</td><td>Millipore pool</td><td>MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo IgG HRP&nbsp;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Dispositivo molecolare</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari 162 cm2/Tappo di sfiato</td><td>Corning/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus a(h3n2) in sieri umani di microneutralization l'influenza di misurazione analisi utilizzando cellule mdck-siat1

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Anticorpi neutralizzanti contro emoagglutinina (HA) di virus influenzali sono considerati il principale meccanismo immune che correla con protezione per infezioni influenzali. Saggi microneutralization (MN) sono spesso utilizzati per misurare le risposte anticorpali neutralizzanti nel siero umano dopo vaccinazione contro l'influenza o infezione. Cellule di rene canino Madine Darby (MDCK) sono il substrato di cella comunemente utilizzata per le analisi di MN. Tuttavia, l'influenza A(H3N2) 3C.2a e 3C.3a hanno acquisito il virus attualmente in circolazione alterata specificità di legame del recettore. La linea cellulare di MDCK-SIAT1 con moiety aumentata α-2,6 galattosio sialico sulla superficie ha dimostrato di fornire infettività migliorata e le repliche più fedeli rispetto alle cellule MDCK convenzionale per questi virus A(H3N2) contemporanei. Qui, descriviamo un saggio di MN usando le cellule MDCK-SIAT1 che è stato ottimizzato per quantificare i titoli dell'anticorpo neutralizzante a questi virus A(H3N2) contemporanei. In questo protocollo, calore inattivato sieri contenenti anticorpi neutralizzanti sono in primo luogo in serie diluiti, poi incubati con 100 TCID50/bene di A(H3N2) virus per consentire gli anticorpi nel siero da associare ai virus. Le cellule MDCK-SIAT1 sono poi aggiunto alla miscela di anticorpo del virus e incubate per 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 per consentire A(H3N2) virus di infettare le cellule MDCK-SIAT1. Dopo l'incubazione overnight, piastre sono fissi e la quantità di virus in ogni bene è quantificata mediante un'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) utilizzando anti-influenzale un anticorpi monoclonali nucleoproteina (NP). Titolo dell'anticorpo di neutralizzazione è definita come il reciproco della più alta diluizione del siero che fornisce ≥ 50% inibizione dell'infettività del virus.

Determinazione di infettività delle scorte virus è il primo passo nell'analisi della MN. La figura 2 illustra il layout della piastra per determinare il TCID50 degli stock di virus. Per gli stock di virus con infettività sconosciuto, il virus può essere titolato da pre-diluizioni multiple, ad esempio 10-2 e 10-3, al fine di acquisire la migliore curva di titolazione per calcolare infettività del virus. La quantità di virus uti...

Anticorpi neutralizzanti l'influenza correlano con protezione delle infezioni influenzali. Saggi microneutralization misurano anticorpi neutralizzanti nel siero umano e sono spesso utilizzati per sierologia umana dell'influenza. Descriviamo un dosaggio di microneutralization usando le cellule MDCK-SIAT1 per misurare i titoli dell'anticorpo neutralizzante ai virus contemporaneo di A(H3N2) di 3C.2a e 3C.3a dopo la vaccinazione contro l'influenza o infezione.

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

L'obiettivo generale di questo test di microneutralizzazione è misurare le risposte anticorpali neutralizzanti ai virus dell'influenza H3N2 contemporanei in sieri umani utilizzando cellule MDCK-SIAT1. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave per valutare l'immunità influenzale. Ad esempio, può determinare se la vaccinazione antinfluenzale induce risposte anticorpali neutralizzanti sufficienti ai virus H3N2 circolanti, per prevenire l'infezione.Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza le cellule MDCK-SIAT1 e i saggi di microneutralizzazione per rilevare le risposte anticorpali per ripristinare i cluster antigenici dei virus dell'influenza H3N2. Gli stock virali devono essere propagati a titoli infettivi elevati prima dell'uso nei saggi di microneutralizzazione. Iniziare questa procedura con la propagazione dei virus AH3N2 nelle cellule MDCK-SIAT1, come descritto nel protocollo di testo.Il primo giorno, scongelare una fiala di virus a temperatura ambiente e mettere immediatamente il virus sul ghiaccio. Per testare il virus a due diverse diluizioni iniziali, aggiungere prima 100 microlitri di virus a 99 millilitri di diluente virale per la pr

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Questo video mostra saggi di microneutralizzazione per misurare gli anticorpi neutralizzanti utilizzando cellule renali canine Madin-Darby che sovraesprimono l'acido sialico legato all'α2,6 in sieri umani. Questo test è spesso utilizzato per la sierologia umana...

Un test di microneutralizzazione per misurare i titoli anticorpali neutralizzanti nel siero umano

Questo video mostra il test di micro-neutralizzazione basato sull'imaging per analizzare le relazioni antigeniche tra i virus dell'influenza A e B. Fornisce un modo quantitativo e visivo per valutare l'efficacia degli anticorpi o di altri trattamenti nella prevenzione dell'infezione virale.

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Un test per misurare i titoli anticorpali di inibizione della neuraminidasi dell'influenza

Questo video mostra un test di immunofluorescenza progettato per misurare la neutralizzazione del citomegalovirus umano (HCMV). Gli anticorpi specifici del virus vengono mescolati con il virus e incubati con cellule di fibroblasti umani. Gli anticorpi neutralizzano il virus, rendendolo incapace di infettare le cellule ospiti, mentre i virus non neutralizzati infettano le cellule. Dopo l'incubazione, l'entità della neutralizzazione viene determinata quantificando le cellule infettate dal virus...

Un metodo di immunofluorescenza per misurare la neutralizzazione del citomegalovirus umano

Descriviamo il test della lectina enzimatica (ELLA) per misurare i titoli anticorpali di inibizione della neuraminidasi dell'influenza (NA) nei sieri. Il test utilizza l'agglutinina di arachidi per quantificare i residui di galattosio che diventano accessibili quando NA rimuove l'acido sialico da piastre a 96 pozzetti rivestite di fetuina.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Questo studio descrive un   di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

I protocolli presentati viene descritto come eseguire un'analisi di inibizione di emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza da campioni di siero dei destinatari del vaccino di riossidazione. Il primo test determina concentrazioni di antigene virale ottimale di emagglutinazione. Il secondo test quantifica i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza di inibizione di emagglutinazione.

Un'analisi di inibizione (HI) ottimizzato emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'Influenza

Influenza A virus (IAVs) è importanti patogeni respiratori umani. Per capire la patogenicità di IAVs e per eseguire test preclinici di approcci vaccinali romanzo, modelli animali che imita la fisiologia umana sono necessari. Qui, descriviamo le tecniche per valutare IAV patogenesi, le risposte umorali e l'efficacia del vaccino utilizzando un modello murino di infezione.

Studi del Virus di riossidazione A in un modello murino di infezione

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Generazione di varianti di fuga di neutralizzare l'Influenza Virus anticorpi monoclonali

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