Name: Neutralizzando le risposte dellanticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization lInfluenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Scopri l'assaggio di microneutralizzazione per misurare le risposte anticorpali neutralizzanti contro i virus influenzali H3N2 utilizzando cellule MDCK-SIAT1. Questo metodo valuta l'immunità post-vaccinazione nei sieri umani.

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Ringraziamo Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu e MS. Ashley Burroughs dalla divisione dell'Influenza del CDC per la loro revisione critica e assistenza nella preparazione di questo manoscritto. Si ringrazia il Dr. Adrian Reber dalla divisione dell'Influenza del CDC per la sua assistenza nel preparare la grafica della Figura 3. Infine, desideriamo ringraziare il Dr. M. Matrosovich, Marburg, in Germania, per fornire le cellule MDCK-SIAT1.

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</ol>

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi. Le risultanze e le conclusioni in questa pubblicazione sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni dei centri per controllo di malattia, la prevenzione e l'agenzia di finanziamento.

Il dosaggio di MN è uno dei principali saggi utilizzati per i test sierologici dell'influenza per rilevare le risposte di anticorpi dell'influenza infezione o la vaccinazione. I titoli generati da saggi di MN sono spesso utilizzati come il risultato primario di molti studi di seroepidemiology di riossidazione. MN saggi sono anche ampiamente utilizzati per la sero-diagnosi e la valutazione dell'immunogenicità del vaccino. Internazionali inter-laboratorio studi sono stati condotti per confrontare saggi MN eseguite in più l...

Virus influenzali continuano a causare morbilità e mortalità nella popolazione umana ogni anno. HA è la glicoproteina di superficie principale di virus influenzali. Anticorpi neutralizzanti HA di targeting sono il principale meccanismo immune che correla con la protezione di infezione influenzale1,2. Emoagglutinazione inibizione (HI) saggi e saggi di MN sono due metodi ampiamente usati per misurare le risposte dell'anticorpo in sieri umani dopo di infezione o la vaccinazione influenzale3. Il test HI misura l'inibizione dell'anticorpo di emagglutinazione virus dei globuli rossi ed è considerato un saggio di surrogati. A differenza di HI, il dosaggio di MN può direttamente misurare i livelli di anticorpi nel siero umano che neutralizzano l'infezione di riossidazione in colture cellulari. Le cellule MDCK sono spesso utilizzate nell'isolamento del virus dell'influenza e MN saggi4.
Virus influenzali sono sottoposti costantemente deriva antigenica e MAIUSC, l'acquisizione di mutazioni HA proteine che possono alterare la specificità di legame del recettore del virus. Dal 2014, nuovi cluster di A(H3N2) virus è emerso e continuò a circolare fino alla stagione corrente. La maggior parte di questi virus appartenga al gruppo genetico 3C.2a e 3C.3a basato su analisi filogenetica delle proteine HA. Molti dei virus circolanti 3C.2a aveva ridotto la capacità di hemagglutinate globuli rossi e quindi non possono essere caratterizzati da HI saggi5. Saggi di neutralizzazione devono essere utilizzati per misurare le risposte dell'anticorpo a questi virus che non hemagglutinate6. Inoltre, gli studi hanno indicato che questi virus A(H3N2) contemporanei hanno alterato le proprietà di binding recettoriale rispetto ai precedenti A(H3N2) virus e tendono ad accumulare mutazioni cultura adattato e polimorfismo quando attraversate in vitro delle cellule culture7,8,9. Rispetto ai convenzionali cellule MDCK, MDCK-SIAT1 è una linea cellulare sviluppata da Matrosovich et al. mediante trasfezione stabile di cellule MDCK con cDNA di umano α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Questa linea cellulare esprime gli importi aumentati di α2, moiety 6-sialico galattosio e quantità in diminuzione di α2, acido 3-sialico moiety rispetto al padre di cellule MDCK10. Le cellule MDCK-SIAT1 sono indicate per migliorare i tassi di isolamento per A(H3N2) virus rispetto alle cellule MDCK11. Recentemente, Lin et al. ha riferito che di recente è emerso 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) dell'influenza virus umani, più fedeli repliche di virus e meglio infettività del virus sono stati raggiunti quando virus sono stati coltivati in linee cellulari MDCK-SIAT1 rispetto a cellule MDCK7. Così, le cellule MDCK-SIAT1 sono più adatti in saggi di MN per caratterizzare le risposte dell'anticorpo ai recenti cluster di A(H3N2) virus.
Qui descriviamo un'analisi di MN usando cellule MDCK-SIAT1 per misurare le risposte dell'anticorpo a contemporanea 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) virus in sieri umani. Virus coltivato in uova o da cellule può essere usato per questo test. Sieri di calore inattivato contenente anticorpi neutralizzanti sono prima diluiti serialmente, poi incubati con 100 TCID50/bene di A(H3N2) virus per consentire gli anticorpi nel siero da associare al virus. Le cellule MDCK-SIAT1 sono poi aggiunto alla miscela di anticorpo del virus e incubate per 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 per consentire il A(H3N2) virus di infettare le cellule MDCK-SIAT1 e replicare. Dopo l'incubazione durante la notte, le piastre sono fissate e la quantità di virus in ogni pozzetto è quantificata mediante un test ELISA che usando gli anticorpi monoclonali di anti-riossidazione A NP. La rilevazione di NP indica la presenza dell'infezione del virus e l'assenza di anticorpi neutralizzanti. Titolo dell'anticorpo di neutralizzazione è definita come il reciproco della più alta diluizione del siero che fornisce ≥ 50% inibizione dell'infettività del virus.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Medium Eagle modificato (DMEM) con alto glucosio</td><td>Scienze della vita</td><td>11965</td><td>Un componente critico della coltura cellulare sterile, della propagazione del virus e del terreno diluente</td></tr><tr><td>virale Siero bovino fetale (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) Frazione V, senza protasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Life Science</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Life Science</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G-418 sale disolfato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720-5G&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Science</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td> Life <td>Science</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>67-64-1</td><td>Utilizzato a una concentrazione dell'80%</td></tr><tr><td>Tampone fosfato-citrato con perborato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>O-fenilendiammina dicloridrato compressa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBQ1086V</td><td>1 compressa per 100 ml di acqua per colture cellulari</td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A510-P500</td><td>Usato 0,5 M di concentrazione finale</td></tr><tr><td>Etanolo, denaturato, 4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>Usato a una concentrazione del 70%</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Scienze della vita</td><td></td><td></td>1748048</tr><tr><td>RDE II "Seiken"</td><td>Denka Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NP topo monoclonale Ab</td><td>Millipore pool</td><td>MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo IgG HRP&nbsp;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Dispositivo molecolare</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari 162 cm2/Tappo di sfiato</td><td>Corning/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus a(h3n2) in sieri umani di microneutralization l'influenza di misurazione analisi utilizzando cellule mdck-siat1

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Anticorpi neutralizzanti contro emoagglutinina (HA) di virus influenzali sono considerati il principale meccanismo immune che correla con protezione per infezioni influenzali. Saggi microneutralization (MN) sono spesso utilizzati per misurare le risposte anticorpali neutralizzanti nel siero umano dopo vaccinazione contro l'influenza o infezione. Cellule di rene canino Madine Darby (MDCK) sono il substrato di cella comunemente utilizzata per le analisi di MN. Tuttavia, l'influenza A(H3N2) 3C.2a e 3C.3a hanno acquisito il virus attualmente in circolazione alterata specificità di legame del recettore. La linea cellulare di MDCK-SIAT1 con moiety aumentata α-2,6 galattosio sialico sulla superficie ha dimostrato di fornire infettività migliorata e le repliche più fedeli rispetto alle cellule MDCK convenzionale per questi virus A(H3N2) contemporanei. Qui, descriviamo un saggio di MN usando le cellule MDCK-SIAT1 che è stato ottimizzato per quantificare i titoli dell'anticorpo neutralizzante a questi virus A(H3N2) contemporanei. In questo protocollo, calore inattivato sieri contenenti anticorpi neutralizzanti sono in primo luogo in serie diluiti, poi incubati con 100 TCID50/bene di A(H3N2) virus per consentire gli anticorpi nel siero da associare ai virus. Le cellule MDCK-SIAT1 sono poi aggiunto alla miscela di anticorpo del virus e incubate per 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 per consentire A(H3N2) virus di infettare le cellule MDCK-SIAT1. Dopo l'incubazione overnight, piastre sono fissi e la quantità di virus in ogni bene è quantificata mediante un'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) utilizzando anti-influenzale un anticorpi monoclonali nucleoproteina (NP). Titolo dell'anticorpo di neutralizzazione è definita come il reciproco della più alta diluizione del siero che fornisce ≥ 50% inibizione dell'infettività del virus.

Determinazione di infettività delle scorte virus è il primo passo nell'analisi della MN. La figura 2 illustra il layout della piastra per determinare il TCID50 degli stock di virus. Per gli stock di virus con infettività sconosciuto, il virus può essere titolato da pre-diluizioni multiple, ad esempio 10-2 e 10-3, al fine di acquisire la migliore curva di titolazione per calcolare infettività del virus. La quantità di virus uti...

Anticorpi neutralizzanti l'influenza correlano con protezione delle infezioni influenzali. Saggi microneutralization misurano anticorpi neutralizzanti nel siero umano e sono spesso utilizzati per sierologia umana dell'influenza. Descriviamo un dosaggio di microneutralization usando le cellule MDCK-SIAT1 per misurare i titoli dell'anticorpo neutralizzante ai virus contemporaneo di A(H3N2) di 3C.2a e 3C.3a dopo la vaccinazione contro l'influenza o infezione.

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

L'obiettivo generale di questo test di microneutralizzazione è misurare le risposte anticorpali neutralizzanti ai virus dell'influenza H3N2 contemporanei in sieri umani utilizzando cellule MDCK-SIAT1. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave per valutare l'immunità influenzale. Ad esempio, può determinare se la vaccinazione antinfluenzale induce risposte anticorpali neutralizzanti sufficienti ai virus H3N2 circolanti, per prevenire l'infezione.Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza le cellule MDCK-SIAT1 e i saggi di microneutralizzazione per rilevare le risposte anticorpali per ripristinare i cluster antigenici dei virus dell'influenza H3N2. Gli stock virali devono essere propagati a titoli infettivi elevati prima dell'uso nei saggi di microneutralizzazione. Iniziare questa procedura con la propagazione dei virus AH3N2 nelle cellule MDCK-SIAT1, come descritto nel protocollo di testo.Il primo giorno, scongelare una fiala di virus a temperatura ambiente e mettere immediatamente il virus sul ghiaccio. Per testare il virus a due diverse diluizioni iniziali, aggiungere prima 100 microlitri di virus a 99 millilitri di diluente virale per la pre-diluizione 10:2. Quindi aggiungere 1 millilitro della pre-diluizione 10:2 a 9 millilitri di diluente virale per la pre-diluizione 10:3.Utilizzando due piastre per microtitolazione, aggiungere 100 microlitri di micro-diluente a tutti i pozzetti, ad eccezione della prima colonna della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Successivamente, eseguire 10 diluizioni a mezzo log. Aggiungere 146 microlitri della diluizione iniziale del virus a tutti i pozzetti della colonna uno e trasferire in serie 46 microlitri dalla colonna uno alla colonna undici.Sostituire i puntali delle pipette tra le colonne. Dopo aver miscelato la colonna undici, scartare i puntali con la diluizione da 46 microlitri. Utilizzare la colonna dodici come controllo cellulare che contiene solo diluente virale.Quindi incubare la piastra per un'ora, a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Preparare le celle MDCK-SIAT1 come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 100 microlitri di cellule diluite a ciascun pozzetto delle piastre per microtitolazione.E coprite i piatti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, per 18-20 ore. Il secondo giorno, eseguire l'ELISA, rimuovendo prima il terreno dalle piastre di microtitolazione.Dopo aver lavato ogni pozzetto con 200 microlitri di PBS, aggiungere 300 microlitri di acetone freddo all'80% in ogni pozzetto. E incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, rimuovere il fissativo.E lasciare asciugare le piastre all'aria. Successivamente, diluire l'anticorpo monoclonale della nucleoproteina A anti-influenza A alla concentrazione target nel diluente anticorpale. Lavare le piastre tre volte con 300 microlitri di tampone di lavaggio.Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo primario diluito a ciascun pozzetto. Incubare le piastre a temperatura ambiente per un'ora. Per l'aggiunta di anticorpi secondari, diluire le IgG anti-topo di capra coniugate all'anticorpo HRP alla concentrazione target nel diluente anticorpale.Lavare le piastre tre volte con 300 microlitri di tampone di lavaggio. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario diluito a ciascun pozzetto, prima di incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, lavare le piastre cinque volte con 300 microlitri di tampone di lavaggio.E tocca un panno privo di lanugine. Aggiungere 100 microlitri di substrato appena preparato a ciascun pozzetto. E incubare a temperatura ambiente fino a quando lo sviluppo del colore non si satura e la densità ottica o OD dei pozzetti di controllo della cella è inferiore a 0,2.Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto a tutti i pozzetti. Leggere il diametro esterno dei pozzetti a 490 nanometri utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. Calcola il TCID50 del virus utilizzando il metodo Reed-Muench come descritto nel protocollo di testo.Il primo giorno del test MN, scongelare i sieri in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e rimuoverli immediatamente dopo lo scongelamento. Riscaldare e attivare i sieri umani per 30 minuti in un bagno d'acqua a 56 gradi Celsius, come descritto nel protocollo di testo. Quindi mettere i sieri sul ghiaccio e aggiungere il diluente virale ai sieri per ottenere una pre-diluizione 1:10.Per eseguire il test con un virus, aggiungere 50 microlitri di diluente virale alle righe da B a H, ad eccezione delle colonne 11 e 12. Quindi, aggiungere 100 microlitri di sieri diluiti 1:10 alle colonne da A1 a A10. Eseguire una doppia diluizione seriale dalle file A a H.E scartare gli ultimi 50 microlitri alla riga H.Per il controllo dei virus, aggiungere 50 microlitri di diluente virale ai pozzetti A12, B12, C12 e D12.Per il controllo cellulare, aggiungere 100 microlitri di diluente virale ai pozzetti E12, F12, G12 e H12. Per i sieri di controllo, aggiungere 100 microlitri di sieri di controllo diluiti alla colonna 11 del pozzetto A. E aggiungere 50 microlitri di diluente virale ai pozzetti da B11 a H11.Procedere alla diluizione seriale. Coprire le piastre e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, fino al momento dell'aggiunta del virus. Per l'aggiunta del virus, diluire il virus a 100 TCID50 in 50 microlitri con diluente virale.Aggiungere 50 microlitri di virus diluito a tutti i pozzetti, ad eccezione della colonna 11 sulle piastre di titolazione posteriori e dei pozzetti di controllo cellulare, E12, F12, G12 e H12 su tutte le piastre. Aggiungere 50 microlitri di diluente virale a tutti i pozzetti della colonna 11. Quindi aggiungere 50 microlitri del virus a 100 TCID50 in 50 microlitri al primo pozzetto.Successivamente, miscelare e trasferire 50 microlitri in pozzetti successivi per eseguire due diluizioni seriali. Sostituire i puntali delle pipette tra i pozzetti per evitare il trasferimento del virus. Scartare 50 microlitri dal pozzetto H11.Quindi, aggiungere 50 microlitri di diluente virale alla colonna 11 per portare il volume finale a 100 microlitri. Tocca i piatti per mescolare. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, per un'ora, prima di eseguire l'aggiunta di cellule MDCK il primo giorno e l'ELISA il secondo giorno, come prima.Dopo aver aggiunto gli anticorpi primari e secondari, come descritto nel protocollo di testo, eseguire l'aggiunta del substrato e la lettura della piastra. Lavare le piastre cinque volte con 300 microlitri di tampone di lavaggio e picchiettare su un panno privo di lanugine. Aggiungere 100 microlitri di substrato OPD appena preparato a ciascun pozzetto.Quindi, incubare le piastre a temperatura ambiente fino a quando i pozzetti di controllo del virus raggiungono una densità ottica a 490 nanometri tra 0,8 e 3 con il controllo cellulare a un basso OD di fondo inferiore a 0,2. Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione di arresto a tutti i pozzetti. Leggere il diametro esterno dei pozzetti a 490 nanometri utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.Infine, determinare il titolo di anticorpi neutralizzanti di ciascun campione di siero, come descritto nel protocollo di testo. I risultati rappresentativi dei saggi di microneutralizzazione sono mostrati qui. L'OD in ciascun pozzetto rappresenta la quantità di infezione virale e di replicazione nelle cellule MDCK-SIAT1, in presenza di sieri diluiti in serie contenenti anticorpi neutralizzanti.Il cutoff di neutralizzazione del 50% è definito come l'OD mediano dei pozzetti di controllo del virus più l'OD mediano dei pozzetti di controllo cellulare, diviso per due, il reciproco della massima diluizione sierica che raggiunge una neutralizzazione uguale o superiore al 50% è considerato il titolo anticorpale per il campione di siero. In questo esempio, i sieri accoppiati raccolti pre e post vaccinazione antinfluenzale da due pazienti, sono stati testati contro il virus H3N2 utilizzato nel vaccino, durante la stagione influenzale 2016-2017. Con i sieri prevaccinali del paziente 1, nessuna delle diluizioni sieriche ha inibito l'infezione virale e quindi è considerata negativa.Dopo la vaccinazione, i sieri di questo paziente hanno dimostrato la neutralizzazione. La terza diluizione da questo siero è la diluizione più alta al di sotto del cutoff del 50%, quindi questo paziente ha un titolo post-vaccinazione di 40. In confronto, il siero del secondo paziente pre-vaccinazione contiene anticorpi neutralizzanti preesistenti a un titolo di 320.Dopo la vaccinazione, il titolo è aumentato a più di 1280. In questo caso, a una pre-diluizione del siero 1:10, non è stato raggiunto alcun titolo finale di anticorpi. Il siero può essere ritestato a una pre-diluizione più elevata per raggiungere il titolo finale.I saggi di microneutralizzazione con cellule MDCK-SIAT1 sono altamente sensibili, specifici e robusti nel rilevare le risposte anticorpali neutralizzanti per recenti cluster antigenici di virus influenzali H3N2. Utilizzando le normali cellule MDCK, questa procedura può essere utilizzata anche per rilevare le risposte anticorpali ad altri ceppi di virus H3N2 e ad altri sottotipi di virus influenzali, per valutare l'immunità protettiva all'influenza.

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Neutralizzando le risposte dellanticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization lInfluenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1 (Video) | JoVE Journal

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

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