Usando l'analisi di Dot per analizzare la migrazione degli strati delle cellule

L'obiettivo generale del test a punti è valutare il fenotipo migratorio di fogli cellulari coesivi attaccati in risposta a segnali microambientali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro, come ad esempio il modo in cui le citochine o i fattori di crescita alterano la motilità delle cellule tumorali. Il vantaggio principale del test a punti è che è facilmente eseguibile e utilizzato per ottenere risultati riproducibili.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla motilità cellulare, si presta anche a una serie di saggi successivi, come la colorazione delle cellule per valutare la morfologia delle colonie di crescita e la diffusione cellulare, l'immunocolorazione, l'analisi di proteine e DNA o RNA o l'iniezione di cellule negli animali. Per iniziare, scongelare il collagene di topo quattro su ghiaccio e diluirlo con 50 micromolari di HCL per preparare tre millilitri di una soluzione di collagene quattro da 10 microgrammi per millilitro. Aggiungere 250 microlitri di soluzione di collagene quattro ai pozzetti delle piastre con fondo di vetro a 12 pozzetti e metterle in una scatola di plastica di dimensioni adeguate e a chiusura ermetica.

Metti un tovagliolo di carta bagnato sopra e intorno ai piatti per creare una camera umida e chiudi la scatola. Quindi, incubare le piastre per una notte a temperatura ambiente. La mattina successiva, per spostare il collagene non assorbito e il tampone, utilizzare acqua deionizzata per sciacquare le piastre due volte, dirigendo l'acqua verso il bordo della piastra, piuttosto che verso il bordo formato dal fondo del bordo e dal vetrino coprioggetti.

Asciugare le piastre all'aria in una cappa a flusso laminare e utilizzarle immediatamente o conservarle a quattro gradi Celsius per un massimo di cinque giorni. Per preparare la sospensione cellulare, utilizzare cellule che sono state coltivate in una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri in DMEMF12 terreno, integrato con il 5% di siero di cavallo all'80% di confluenza. Utilizzare DPBS privo di calcio e magnesio per sciacquare le cellule una volta, quindi aggiungere 500 microlitri di tripsina EDTA a temperatura ambiente e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in 5% di CO2 in un'atmosfera umidificata per tre-cinque minuti.

Sospendere le cellule staccate in 4,5 millilitri di terreno di coltura per arrestare l'attività della tripsina e utilizzare un emocitometro per contare un'aliquota di 20 microlitri della sospensione cellulare. Estrarre le cellule rimanenti in una provetta conica da 50 millilitri mediante centrifugazione a 200 volte la gravità per tre minuti. Quindi, aspirare il surnatante e risospendere le cellule nel terreno di coltura a tre volte da 10 a sei cellule per millilitro.

Per placcare le cellule al centro di ogni vetrino coprioggetto della piastra di collagene con fondo di vetro a quattro pozzetti rivestito, posizionare una goccia da 10 microlitri di sospensione cellulare, facendo attenzione a non toccare o graffiare il rivestimento. La placcatura di una goccia non circolare non produrrà un foglio cellulare circolare e, se il rivestimento viene toccato o graffiato, impedirà alle celle di aderire bene. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata per 30 minuti, per consentire alle cellule di attaccarsi.

Quindi, verificare la presenza di un dispositivo di fissaggio al microscopio invertito. Con un millilitro di terreno di coltura, lavare delicatamente i pozzetti due volte, per rimuovere le cellule non attaccate, quindi aggiungere un millilitro di terreno di coltura a ciascun pozzetto. Controllare al microscopio invertito che non rimangano cellule galleggianti, altrimenti lavare nuovamente i pozzetti.

Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius in CO2 al 5% in un'atmosfera umidificata per ottenere fogli cellulari ben definiti. Utilizzando un microscopio invertito, controllare tutti i pozzetti per assicurarsi che le colonie cellulari siano cresciute correttamente. Se necessario, contrassegnare i pozzetti non idonei e non utilizzarli.

Etichettare ogni pozzetto della piastra in modo appropriato per ogni condizione indagata. Esegui ogni condizione in doppio o triplice copia. Cambia il terreno per affamare le cellule in DMEMF12 contenente lo 0,1% di siero di cavallo, tre ore prima che le cellule vengano stimolate.

Quindi, stimola le cellule aggiungendo EGF o altri mediatori desiderati. Utilizzare un pipettatore da un microlitro o agitare delicatamente la piastra per miscelare il terreno. Incubare la piastra per uno-quattro giorni per osservare lo spostamento e il contorno del bordo.

Per effettuare la colorazione H ed E, lavare due volte le cellule con PBS e fissarle per circa due minuti. Aggiungere ematossilina per circa due minuti per colorare i nuclei. Lavare le cellule con acqua di rubinetto per cinque-10 minuti, fino a quando i nuclei sono blu.

Quindi, colorare il citoplasma con eosina per due minuti prima di risciacquare le cellule con acqua deionizzata. Asciugare la piastra all'aria, quindi capovolgerla e utilizzare un righello per misurare il diametro del punto. In alternativa, scattare foto della lastra con una fotocamera e utilizzare ImageJ per analizzare il diametro del punto.

Per eseguire la microscopia time lapse, accendere il microscopio dell'incubatrice e regolare la temperatura a 37 gradi Celsius. Riempire l'umidificatore con DH2O, quindi regolare la CO2 al 5%Assicurarsi che la camera dell'incubatore sia umidificata e che il tavolino motorizzato possa muoversi liberamente. Quindi, chiudere la camera dell'incubatore e lasciare che il microscopio si regoli a 37 gradi Celsius.

Posizionare la piastra sul tavolino del microscopio incubatrice e impostare l'elenco dei tavoli, quindi visualizzare i due bordi opposti e il centro di ciascun punto della cella. Utilizzando un obiettivo 10X, scatta immagini ogni tre minuti per 15-24 ore. Scarica i dati e procedi con l'analisi delle immagini in un programma a scelta come Matlab.

Inizialmente, l'imaging a contrasto di fase dei punti cellulari ha rivelato che le cellule invasive del carcinoma mammario che formano colonie polmonari mantengono un fenotipo mesenchimale dopo la stimolazione con EGF. Tuttavia, le singole cellule che lasciano il foglio si osservano più frequentemente nei punti cellulari stimolati da EGF. La risposta delle cellule di carcinoma mammario che formano colonie polmonari all'EGF è stata ulteriormente valutata mediante colorazione H ed E di colture stimolate con EGF per quattro giorni.

Infatti, la stimolazione dell'EGF ha comportato un aumento del diametro della colonia, indicando che la migrazione delle cellule stimolate dall'EGF potrebbe essere alterata. In questo test a punti, le cellule ai bordi del foglio sono state sottoposte a imaging per nove ore dopo la stimolazione delle cellule di cancro al seno formanti colonie con EGF. PIV ha rivelato che l'EGF ha aumentato la velocità delle celle a 0,63 micrometri al minuto da 0,45 micrometri al minuto nelle celle di controllo.

Inoltre, l'EGF ha ridotto la variabilità della direzionalità cellulare, o diffusione angolare, da 0,95 nelle colture di controllo a 0,79 nelle colture stimolate da EGF. Inoltre, come è stato osservato dalla colorazione H ed E dopo quattro giorni, l'EGF ha aumentato lo spostamento radiale del bordo epiteliale nell'arco di nove ore, da 257 micrometri a 356 micrometri. Una volta padroneggiata, il tempo pratico per questa tecnica è di un paio d'ore.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging time lapse, l'immunocolorazione e l'analisi del DNA e dell'RNA per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, può essere utilizzato per analizzare se le proteine sono espresse in modo differenziale nelle cellule a migrazione rapida o lenta o quando le cellule migrano nell'ambiente circostante. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare il test a punti e usarlo per valutare il fenotipo migratorio dei fogli di cellule coesive attaccate in risposta a segnali microambientali.