Un approccio semplice per indurre la neurite Autoimmune Sperimentale in topi C57BL/6 per le valutazioni funzionali e Neuropathological
9 novembre 2017
Questo rapporto descrive un approccio semplice per indurre con successo la neurite autoimmune sperimentale (EAN) utilizzando la proteina della mielina zero (P0)180-199 del peptide in combinazione con adiuvante completo di Freund e tossina della pertosse. Vi presentiamo un paradigma sofisticato in grado di valutare con precisione l'entità dei deficit funzionali e neuropatologia che si verificano in questo EAN.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre con successo la Neurite Autoimmune Sperimentale o EAN in un modello murino per l'analisi funzionale e patologica del processo patologico. Il modello EAN può essere utilizzato per affrontare questioni chiave relative alla neuropatia periferica. È anche un modello meraviglioso per studiare potenzialmente l'efficacia di nuovi agenti terapeutici.
Il vantaggio principale di questo approccio è che fornisce un paradigma di test funzionale semplice e oggettivo che può essere applicato quando si utilizza il modello EAN nel mouse. A dimostrare la procedura con me oggi è Sang Won Yoo, che è uno studente universitario nel laboratorio di biologia della neurotrofina e della mielina presso l'Università di Melbourne. Tre giorni prima dell'induzione della malattia, accendere l'apparecchio di valutazione della funzione motoria e accendere il pulsante della luce.
Prendi il topo e abbassalo su un contenitore di colorante alimentare rosso. Posiziona il mouse nello scomparto pedonale e imposta la velocità del tapis roulant a 15 centimetri al secondo. Accendere il tapis roulant e fare clic su registra per utilizzare il sistema di imaging della funzione andatura per acquisire il movimento di corsa del mouse per 36 secondi.
Dopo 36 secondi, interrompere la registrazione e il tapis roulant e salvare il file video della corsa di prova nella cartella designata. Un giorno prima della prima immunizzazione, utilizzare una siringa da 0,5 millilitri dotata di un ago da 30-1/2 gauge per somministrare 1,6 microgrammi per millilitro di tossina pertosse in 250 microlitri di topo isotonico PBS IP a topi maschi anestetizzati di sei-otto settimane C57BL/6. Quindi, valutare i topi per i segni clinici di EAN su una scala da zero a quattro secondo la tabella ed eseguire una valutazione della funzione motoria come appena dimostrato.
Il giorno successivo, combinare volumi uguali di soluzioni di peptide appena preparate in soluzione salina allo 0,9% e 20 milligrammi per millilitro di Mycobacterium tuberculosis in un adiuvante di Freund completo in un beader e mescolare le soluzioni alla massima velocità per un minuto a temperatura ambiente. Caricare una siringa dotata di un ago calibro 23 con l'inoculo, capovolgere e agitare la siringa prima di evacuare l'aria all'interno dello stelo della siringa. Prima di somministrare l'inoculo, rimuovere i peli appena lateralmente alla linea mediana tra le scapole e disinfettare la pelle esposta con etanolo al 70%.
Quindi, utilizzare un paio di pinze Adson per afferrare la pelle e somministrare 50 microlitri di soluzione al topo iniettato con la tossina della pertosse tramite iniezione sottocutanea. La mattina successiva, somministrare 1,2 microgrammi per millilitro di tossina della pertosse in 250 microlitri di PBS IP, come appena dimostrato, seguiti da un'altra iniezione di 1,2 microgrammi per millilitro di tossina della pertosse IP 48 ore dopo. Tre giorni dopo la terza iniezione di pertosse, somministrare altri 50 microlitri di inoculo appena preparato nello stesso sito di iniezione di prima e monitorare il punteggio clinico e la funzione motoria degli animali due volte a settimana fino alla fine dell'esperimento.
L'EAN indotto dal peptide P0 180-199 nei topi C57BL/6 porta a una malattia monofasica con un esordio del punteggio clinico a partire da sei giorni dopo la prima immunizzazione e una gravità massima del punteggio a 25 giorni dopo la prima immunizzazione, seguita da un certo miglioramento del punteggio clinico a 40 giorni dopo la prima immunizzazione. I topi iniziano a fallire in un semplice compito di corsa già sei giorni dopo la prima immunizzazione con poca capacità di completare un semplice compito di corsa sul tapis roulant entro 35 giorni dopo l'immunizzazione che non migliora la capacità di corsa a 55 giorni dopo la prima immunizzazione. L'esame di sezioni semisottili dei nervi sciatici di topi EAN indotti da peptidi rivela aree di demielinizzazione rispetto ai nervi sciatici di controlli sani di pari età.
Le immagini al microscopio elettronico ad alta trasmissione di potenza consentono l'identificazione di specifiche caratteristiche neuropatologiche come demielinizzazione, danni alla lamella mielinica e segni di stress assonale come il gonfiore mitocondriale. Questi animali mostrano anche un danno assonale acuto, come evidenziato dall'espressione traumaticamente elevata della proteina precursore della beta-amiloide nei nervi sciatici che non è osservata nei tessuti sani di controllo di pari età. Si osserva anche un allargamento dei nodi e una rottura dei paranodi.
Una volta padroneggiate, le iniezioni sottocutanee possono essere eseguite entro circa 5-10 minuti per topo con la minima possibilità di qualsiasi errore di iniezione. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante osservare il sito di iniezione per assicurarsi che tutto l'inoculo rimanga all'interno del sito di iniezione e che non fuoriesca. L'acquisizione video dell'andatura sul tapis roulant è ottima perché consente di calcolare altri parametri come la fase di oscillazione o la lunghezza del passo e queste misure possono diventare importanti quando si testa l'efficacia di nuove terapie.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come indurre l'EAN nei topi maschi C57BL/6. Inoltre, dovresti avere un'ottima comprensione di come posizionare le iniezioni sottocutanee in modo sicuro e davvero accurato, assicurandoti che non vi siano errori di iniezione. Non dimenticare che lavorando con aghi e inoculo, c'è la possibilità di lesioni soprattutto quando si usano oggetti taglienti.
Quindi, per evitare qualsiasi possibilità di lesioni, è davvero una buona idea usare sempre il forcipe e non afferrare mai la pelle o il tessuto con le mani e anche usare siringhe monouso, senza mai richiudere nel processo.
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Panoramica
Questo studio presenta una metodologia per indurre la Neurite Autoimmune Sperimentale (EAN) in un modello murino utilizzando il peptide della proteina della mielina zero (P0) 180-199 insieme all'adjuvante completo di Freund e alla tossina pertussica. L'obiettivo è facilitare un'analisi funzionale e patologica della neuropatia periferica, fornendo informazioni sul processo della malattia e sui potenziali trattamenti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Disturbi autoimmuni
- Neuropatia periferica
Sfondo
- La neurite autoimmune sperimentale (EAN) è un modello per lo studio delle neuropatie periferiche.
- Il modello è pratico per la valutazione di nuovi agenti terapeutici.
- La valutazione funzionale durante lo studio contribuisce a un'analisi oggettiva.
- I principali test comportamentali includono la funzione motoria e il punteggio clinico.
Scopo dello studio
- Indurre in modo efficiente l'EAN nei topi C57BL/6 per scopi di ricerca.
- Analizzare il grado di deficit funzionali e di neuropatologia.
- Stabilire un protocollo riproducibile per studi futuri sulla neuropatia periferica.
Metodi Utilizzati
- La piattaforma prevede l'uso di un tapis roulant e di un sistema di imaging della funzione della deambulazione per le valutazioni funzionali.
- Il modello si concentra su topi maschi C57BL/6 per il processo di induzione dell'EAN.
- Nello studio non sono stati menzionati flussi di lavoro multi-omici.
- Il protocollo include diverse iniezioni sottocutanee a intervalli specificati dopo l'immunizzazione.
- Le valutazioni della funzione motoria vengono effettuate più volte durante lo studio per monitorare l'evoluzione della malattia.
Risultati principali
- Lo studio conferma un decorso della malattia monofasico con i sintomi clinici che raggiungono il picco a 25 giorni dall'immunizzazione.
- Si osservano significativi declini funzionali nell'esecuzione di compiti motori dal sesto al trentacinquesimo giorno.
- L'analisi neuropatologica mostra demielinizzazione e danno assonale nei topi trattati rispetto ai controlli.
- L'espressione elevata della proteina precursore del beta-amiloide indica un danno assonale acuto.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un protocollo chiaro ed efficiente per indurre l'EAN, facilitando la comprensione della neuropatologia.
- Le informazioni ottenute sul processo della malattia supportano future ricerche su potenziali trattamenti per la neuropatia periferica.
- Questi risultati migliorano la comprensione dei meccanismi autoimmuni che interessano il sistema nervoso periferico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente l'induzione di una nevrite autoimmune sperimentale in topi C57BL/6, una linea con ampia disponibilità di strumenti genetici, che supporta la riduzione dei rischi meccanicistici dei candidati terapeutici rivolti alla demielinizzazione periferica. Il modello fornisce parametri funzionali e neuropatologici quantitativi che aumentano l'affidabilità predittiva nella valutazione preclinica di strategie di riparazione della mielina e di neuroprotezione. La sua riproducibilità e compatibilità con approcci transgenici lo posizionano come strumento traslazionale per la validazione di bersagli nella ricerca sulla neuropatia autoimmune periferica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei meccanismi patogenetici nella neuropatia periferica autoimmune mediante un'attivazione immunitaria indotta e guidata da peptidi in un ospite geneticamente modificabile.
- Valore operativo: Sfrutta il ceppo C57BL/6, consentendo l'integrazione con modelli knock-out, knock-in e con geni reporter per la riduzione del rischio associato a bersagli causali.
- Valore predittivo: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di danno nervoso mediato da risposta immunitaria, facilitando decisioni precoci di tipo go/no-go per candidati immunomodulatori o rimielinizzanti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera un declino funzionale quantificabile mediante l'analisi della deambulazione su tapis roulant, consentendo il monitoraggio longitudinale dei deficit motori come biomarcatore farmacodinamico.
- Valore operativo: La valutazione clinica standardizzata (scala 0–4) e le immunizzazioni temporizzate favoriscono un'induzione riproducibile della malattia tra diversi gruppi di studio.
- Prontezza del saggio: Compatibile con la valutazione neuropatologica in cieco, inclusa la sezione semipiena e la microscopia elettronica, per convalidare l'interazione con il bersaglio di composti neuroprotettivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Riproduce caratteristiche neuropatologiche chiave della demielinizzazione periferica umana, inclusi i danni assonali evidenziati dall'aumento della proteina precursora del beta-amiloide, sostenendo la rilevanza meccanicistica.
- Continuità traslazionale: Permette la valutazione di candidati terapeutici in tutte le fasi della malattia, dall'insorgenza (giorno 6) al picco (giorno 25) e al recupero (giorno 40), fornendo indicazioni per l'ottimizzazione di dose e tempistica.
- Avanzamento con valutazione del rischio: Facilita la valutazione dell'efficacia del ripristino della mielina e della neuroprotezione, riducendo l'incertezza biologica prima degli studi abilitanti all'IND.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla sperimentazione dell'efficacia preclinica, in particolare per biologici o molecole di piccole dimensioni mirati a modulare le risposte autoimmuni o a promuovere l'integrità assonale nella neuropatia periferica.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica consentendo l'induzione controllata di autoimmunità specifica per il sistema nervoso periferico per validare bersagli coinvolti nelle interazioni immunitarie-neurali.
- Screening: Fornisce una piattaforma standardizzata per valutare gli effetti dei composti sulla funzione motoria e sulla neuropatologia, con risultati adatti all'analisi mediante imaging ad alto contenuto e punteggio quantitativo.
- Analisi: Genera dati funzionali longitudinali (parametri della deambulazione, lunghezza del passo, fase di oscillazione) e metriche istopatologiche finali per l'analisi comparativa tra gruppi di trattamento.
- Ricerca traslazionale: Si allinea alla validazione preclinica modellando caratteristiche cronico-remittenti e patologia assonale rilevanti per le neuropatie periferiche umane.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di immunologia e neurobiologia per il test iterativo di ipotesi terapeutiche in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli di neuropatia periferica consentendo un'induzione precisa e riproducibile della demielinizzazione mediata da immunità e dello stress assonale.
- Valore operativo: Un programma definito di immunizzazione e richiamo, abbinato a test funzionali standardizzati, migliora la riproducibilità tra laboratori e riduce la variabilità.
- Valore strategico: Aumenta la sicurezza nelle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo precoci evidenze quantificabili della modulazione del bersaglio in un sistema rilevante per la malattia.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei candidati che dimostrano effetti sia sugli esiti funzionali sia sui parametri neuropatologici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei topi, nelle tecniche di iniezione sottocutanea e nella fissazione mediante perfusione per l'analisi neuropatologica.
- È subordinato all'accesso a sistemi di imaging della deambulazione su tapis roulant e a strumentazione per la sezione semipiena e la microscopia elettronica.
- Necessita di una formazione standardizzata per la valutazione clinica e per l'analisi in cieco al fine di garantire la coerenza dei dati tra diversi operatori.
- Richiede l'adeguamento della concentrazione del peptide e della formulazione dell'adjuvante quando si estendono i risultati ad altri ceppi murini a causa della variabile risposta immunitaria.
- Limitato a un decorso monofasico della malattia; potrebbe non riprodurre forme recidivanti-remittenti o progressivamente croniche della neuropatia periferica senza modifiche al protocollo.
