Un approccio semplice per indurre la neurite Autoimmune Sperimentale in topi C57BL/6 per le valutazioni funzionali e Neuropathological

Questo rapporto descrive un approccio semplice per indurre con successo la neurite autoimmune sperimentale (EAN) utilizzando la proteina della mielina zero (P0)_180-199 del peptide in combinazione con adiuvante completo di Freund e tossina della pertosse. Vi presentiamo un paradigma sofisticato in grado di valutare con precisione l'entità dei deficit funzionali e neuropatologia che si verificano in questo EAN.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre con successo la Neurite Autoimmune Sperimentale o EAN in un modello murino per l'analisi funzionale e patologica del processo patologico. Il modello EAN può essere utilizzato per affrontare questioni chiave relative alla neuropatia periferica. È anche un modello meraviglioso per studiare potenzialmente l'efficacia di nuovi agenti terapeutici.

Il vantaggio principale di questo approccio è che fornisce un paradigma di test funzionale semplice e oggettivo che può essere applicato quando si utilizza il modello EAN nel mouse. A dimostrare la procedura con me oggi è Sang Won Yoo, che è uno studente universitario nel laboratorio di biologia della neurotrofina e della mielina presso l'Università di Melbourne. Tre giorni prima dell'induzione della malattia, accendere l'apparecchio di valutazione della funzione motoria e accendere il pulsante della luce.

Prendi il topo e abbassalo su un contenitore di colorante alimentare rosso. Posiziona il mouse nello scomparto pedonale e imposta la velocità del tapis roulant a 15 centimetri al secondo. Accendere il tapis roulant e fare clic su registra per utilizzare il sistema di imaging della funzione andatura per acquisire il movimento di corsa del mouse per 36 secondi.

Dopo 36 secondi, interrompere la registrazione e il tapis roulant e salvare il file video della corsa di prova nella cartella designata. Un giorno prima della prima immunizzazione, utilizzare una siringa da 0,5 millilitri dotata di un ago da 30-1/2 gauge per somministrare 1,6 microgrammi per millilitro di tossina pertosse in 250 microlitri di topo isotonico PBS IP a topi maschi anestetizzati di sei-otto settimane C57BL/6. Quindi, valutare i topi per i segni clinici di EAN su una scala da zero a quattro secondo la tabella ed eseguire una valutazione della funzione motoria come appena dimostrato.

Il giorno successivo, combinare volumi uguali di soluzioni di peptide appena preparate in soluzione salina allo 0,9% e 20 milligrammi per millilitro di Mycobacterium tuberculosis in un adiuvante di Freund completo in un beader e mescolare le soluzioni alla massima velocità per un minuto a temperatura ambiente. Caricare una siringa dotata di un ago calibro 23 con l'inoculo, capovolgere e agitare la siringa prima di evacuare l'aria all'interno dello stelo della siringa. Prima di somministrare l'inoculo, rimuovere i peli appena lateralmente alla linea mediana tra le scapole e disinfettare la pelle esposta con etanolo al 70%.

Quindi, utilizzare un paio di pinze Adson per afferrare la pelle e somministrare 50 microlitri di soluzione al topo iniettato con la tossina della pertosse tramite iniezione sottocutanea. La mattina successiva, somministrare 1,2 microgrammi per millilitro di tossina della pertosse in 250 microlitri di PBS IP, come appena dimostrato, seguiti da un'altra iniezione di 1,2 microgrammi per millilitro di tossina della pertosse IP 48 ore dopo. Tre giorni dopo la terza iniezione di pertosse, somministrare altri 50 microlitri di inoculo appena preparato nello stesso sito di iniezione di prima e monitorare il punteggio clinico e la funzione motoria degli animali due volte a settimana fino alla fine dell'esperimento.

L'EAN indotto dal peptide P0 180-199 nei topi C57BL/6 porta a una malattia monofasica con un esordio del punteggio clinico a partire da sei giorni dopo la prima immunizzazione e una gravità massima del punteggio a 25 giorni dopo la prima immunizzazione, seguita da un certo miglioramento del punteggio clinico a 40 giorni dopo la prima immunizzazione. I topi iniziano a fallire in un semplice compito di corsa già sei giorni dopo la prima immunizzazione con poca capacità di completare un semplice compito di corsa sul tapis roulant entro 35 giorni dopo l'immunizzazione che non migliora la capacità di corsa a 55 giorni dopo la prima immunizzazione. L'esame di sezioni semisottili dei nervi sciatici di topi EAN indotti da peptidi rivela aree di demielinizzazione rispetto ai nervi sciatici di controlli sani di pari età.

Le immagini al microscopio elettronico ad alta trasmissione di potenza consentono l'identificazione di specifiche caratteristiche neuropatologiche come demielinizzazione, danni alla lamella mielinica e segni di stress assonale come il gonfiore mitocondriale. Questi animali mostrano anche un danno assonale acuto, come evidenziato dall'espressione traumaticamente elevata della proteina precursore della beta-amiloide nei nervi sciatici che non è osservata nei tessuti sani di controllo di pari età. Si osserva anche un allargamento dei nodi e una rottura dei paranodi.

Una volta padroneggiate, le iniezioni sottocutanee possono essere eseguite entro circa 5-10 minuti per topo con la minima possibilità di qualsiasi errore di iniezione. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante osservare il sito di iniezione per assicurarsi che tutto l'inoculo rimanga all'interno del sito di iniezione e che non fuoriesca. L'acquisizione video dell'andatura sul tapis roulant è ottima perché consente di calcolare altri parametri come la fase di oscillazione o la lunghezza del passo e queste misure possono diventare importanti quando si testa l'efficacia di nuove terapie.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come indurre l'EAN nei topi maschi C57BL/6. Inoltre, dovresti avere un'ottima comprensione di come posizionare le iniezioni sottocutanee in modo sicuro e davvero accurato, assicurandoti che non vi siano errori di iniezione. Non dimenticare che lavorando con aghi e inoculo, c'è la possibilità di lesioni soprattutto quando si usano oggetti taglienti.

Quindi, per evitare qualsiasi possibilità di lesioni, è davvero una buona idea usare sempre il forcipe e non afferrare mai la pelle o il tessuto con le mani e anche usare siringhe monouso, senza mai richiudere nel processo.