Biotinylated Cell-penetrating peptidi per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare le interazioni proteina-proteina in un contesto intracellulare. Ciò si ottiene attraverso un sistema di pull-down biotina-avidina combinato con sequenze autopenetranti, che consente l'incubazione nella sequenza bersaglio con cellule viventi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione cellulare, come le interazioni rapide e dinamiche tra le biomolecole per ottenere segnali specifici.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che le interazioni molecolari avvengono in un contesto intracellulare. In questo studio, piastra le cellule staminali del glioma umano G166 o GSC in quattro fiasche di 150 centimetri quadrati come descritto nel protocollo di testo. Processare le celle quando viene raggiunta la confluenza.

Quando cinque milioni di celle G166 vengono placcate in un pallone di 150 centimetri quadrati, vengono lavorate due giorni dopo la placcatura. Centrifugare le fiale contenenti i peptidi liofilizzati biotinilati che penetrano nelle cellule a 8, 200 volte g per 30 secondi per evitare che parte della polvere rimanga sul coperchio. Includi un BCPP controllato per essere sicuro che le interazioni trovate siano specifiche per la sequenza target.

Quindi, sciogliere i BCPP nel terreno di coltura corrispondente alla soluzione madre indicata dal produttore. Per ottenere una soluzione madre di due milligrammi per millilitro di BCPP per il trattamento delle GSC, aggiungere 0,5 millilitri di terreno di coltura GSC a una fiala contenente un milligrammo di BCPP. Agitare le fiale e assicurarsi che il peptide sia ben sciolto.

Preparare almeno 12 provette da 1,5 millilitri per condizione nel test di pull-down da eseguire. Contrassegnare i primi tre tubi in base alla condizione. Avranno il volume totale di lisati cellulari.

Quindi, segna una A su tre tubi per condizione. Questi tubi avranno i primi surnatanti ottenuti dopo la lisi e la filatura dei lisati cellulari. Quindi, segnare una B su tre tubi per condizione.

Queste provette avranno una piccola aliquota dei primi surnatanti per campioni di western blot. Infine, segnare una C su tre tubi per condizione. Queste provette avranno i surnatanti ottenuti dopo il pull-down con NeutrAvidin.

Dopo aver aspirato il terreno di coltura dalle cellule, sostituirlo con il corrispondente volume di terreno fresco necessario per incubare i BCPP nel volume di terreno più piccolo possibile in base ai tempi di incubazione. È molto importante che in ogni caso il fluido copra completamente l'intera superficie del pallone. Aggiungere il volume della soluzione madre di BCPP alle colture cellulari per raggiungere la concentrazione che si è dimostrata efficace.

Pertanto, aggiungere 92,8 microlitri di due milligrammi per millilitro di TAT-connessina 43 266-283 biotina per millilitro di terreno di coltura. Posizionare le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti per assicurarsi che avvengano le interazioni tra il BCPP e i suoi partner intracellulari. Per eseguire l'estrazione delle proteine, aspirare prima completamente il terreno di coltura, quindi lavare le cellule con 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato per 150 centimetri con molta attenzione per evitare l'autodistacco.

Per ottenere il lisato cellulare, aggiungere tre millilitri di tampone di lisi per pallone da 150 centimetri quadrati e raschiare accuratamente la superficie utilizzando un raschietto cellulare. Inclinando il pallone di circa 45 gradi sarà più facile raccogliere i lisati cellulari nelle provette corrispondenti. Versare un millilitro di lisato cellulare per provetta in tre provette da 1,5 millilitri contrassegnate per condizione.

Per il pull-down, centrifugare le provette da 1,5 millilitri a 11.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire i surnatanti in nuove provette etichettate A.Trasferire un'aliquota del surnatante per condizione in diverse provette etichettate B.Quindi, aggiungere 16,6 microlitri di tampone Laemmli 4x per 50 microlitri di lisato e congelare a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, omogeneizzare molto bene l'agarosio NeutrAvidin agitando delicatamente.

Tagliare le punte dei puntali delle pipette per aumentarne il diametro e migliorare il pipettaggio delle perline. Quindi, aggiungere 50 microlitri di NeutrAvidin agarosio per millilitro di lisato cellulare nelle provette A. Incubare i lisati cellulari a quattro gradi Celsius durante la notte con agitazione molto delicata per consentire a NeutrAvidin di interagire con i BCPP legati ai loro partner intracellulari.

Quindi, centrifugare a 3.000 volte g per un minuto a quattro gradi Celsius per raccogliere il complesso di NeutrAvidin con le proteine. Rimuovere con cautela i surnatanti e trasferirli in provette pulite etichettate C.Conservarle per utilizzarle nel caso in cui il pull-down non riesca. Per lavare il complesso di NeutrAvidin con le proteine, aggiungere un tampone di lisi fresco ai pellet delle provette A.

Risospendere il pellet per inversione e ripetere la centrifugazione. Ripeti questo lavaggio per altre cinque volte. Tutti questi surnatanti possono essere scartati.

Quindi, aggiungere 40 microlitri di 2x tampone Laemmli per tubo da 1,5 millilitri per pellet ottenuti da 150 fiasche di centimetri quadrati di celle confluenti. Quindi, eluire a 100 gradi Celsius per cinque minuti per dissociare le interazioni tra le proteine. Dopo l'eluizione, centrifugare per 30 secondi a 8, 200 volte g per pellettare le perle di NeutrAvidin.

Trasferire i surnatanti contenenti le proteine dissociate con punte capillari in nuove provette etichettate D. Questi surnatanti sono ora pronti per essere caricati in un western blot come descritto nel protocollo di testo o possono essere congelati a meno 20 gradi Celsius. Qui sono mostrate immagini di immunocitochimica che mostrano che la fusione della biotina con la connessina TAT-43 266-283 non modifica gli effetti del peptide che penetra nelle cellule sulla morfologia delle cellule staminali del glioma. L'analisi MTT delle GSC trattate con BCPP o CPP mostra che la fusione della biotina con TAT-connessina 43 266-283 non modifica l'effetto antiproliferativo della TAT-connessina 43 266-283 sulla GSC.

Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi di un pull-down del BCPP seguito da western blot. Il western blot mostra che le proteine descritte per interagire con il TAT, ad esempio Cav-1, compaiono in entrambe le condizioni. Le proteine descritte per interagire con Cx43, ad esempio c-Src e PTEN, compaiono subito dopo il pull-down di TAT-connessina 43 266-283, mentre le proteine che non interagiscono direttamente con Cx43 o TAT non sono presenti, ad esempio FAK.

Le immagini al microscopio confocale confermano le interazioni intracellulari riscontrate con i BCPP. Le immagini mostrano la colocalizzazione intracellulare di TAT-connessina 43 266-283 con c-Src vicino alla membrana plasmatica nelle GSC G166. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante confermare la temperatura dei reagenti e della centrifuga, nonché la confluenza delle cellule prima di aggiungere i peptidi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare le interazioni intracellulari proteina-proteina utilizzando peptidi biotinilati che penetrano nelle cellule. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada a ricerche nel campo della segnalazione cellulare per esplorare i meccanismi molecolari intracellulari e le loro vie specifiche di linea in cellule di coltura, colture organotipiche e persino modelli in vivo.

Seguendo questa procedura, altri carichi bioattivi come sequenze di RNA, nanoparticelle, virus o altre molecole che possono essere trasfusi con peptidi che penetrano nelle cellule e fusi per abbattere i TAT possono essere utilizzati per studiare il loro meccanismo d'azione intracellulare. Sebbene questo protocollo non includa materiali estremamente pericolosi, non dimenticare di indossare guanti e camice da laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura.