Name: Biotinylated Cell-penetrating peptidi per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Scopri come studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare utilizzando peptidi cell-penetranti biotinilati e saggi di pull-down in cellule staminali di glioma G166.

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Ringraziamo M. Morales e J. Bravo per il loro aiuto con il design della CPPs e J.C. Arévalo per il suo aiuto con il protocollo di discesa. Siamo grati per l'assistenza tecnica di T. del Rey. Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economía y Competitividad, Spagna; FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León, Spagna; SA026U16 FEDER e Fundación Ramón Areces. M. Jaraíz-Rodríguez e A. González-Sánchez sono destinatari di una borsa di studio dalla Junta de Castilla y León e il Fondo sociale europeo.

Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate presso l'Università di Salamanca.
1. cellule
<ol>
	<li>Due giorni prima di iniziare la procedura, piastra le cellule presso la densità necessaria per essere confluenti il giorno dell'esperimento. Piastra le cellule in boccette o piastre. Tuttavia, l'estrazione di proteine sarà più facile dalle piastre. È conveniente da preparare almeno 4 piatti di 78cm2 o 2 boccette di 150 cm2 per condizione per esperimento, per essere sicuri che i risultati sono coerenti.</li>
	<li>In questo studio, piastra umano G166 artigiano in 4 boccette di 150 cm2, coltivate in cellule staminali RHB-A supplementato con 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL EGF e b-FGF come descritto da Pollard et al.22. Processo quando è stato raggiunto la confluenza. Per esempio, quando 5 x 106 G166 cellule erano placcate in un pallone da2 di 150 cm, sono state elaborate 2 giorni dopo il placcaggio.</li>
</ol>
2. biotinilati CPPs
<ol>
	<li>Girare le fiale contenenti il liofilizzato biotinilati CPPs (BCPPs) a 8200 x g per 30 s, per evitare alcune delle polvere rimanente sul coperchio. Includere un controllo BCPP per essere sicuri che le interazioni che si trovano sono specifiche della sequenza di destinazione. In questo studio, il controllo BCPP era TAT-biotina (TAT-B) e il trattamento BCPP era TAT-Cx43266-283- B. Altri controlli potrebbero essere utilizzati, quale TAT frammenti fusi a uova strapazzate o mutato bond a biotina.</li>
	<li>Sciogliere il BCPPs nel terreno di coltura corrispondente per la soluzione di riserva indicata dal fabbricante; per esempio, per ottenere una soluzione madre di 2 mg/mL BCPP per trattare artigiano aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura di GSC un flaconcino contenente 1 mg del BCPP. Vortice e assicurarsi che il peptide è ben sciolto.</li>
</ol>
3. tubi
Nota: Preparare almeno dodici provette da 1,5 mL a condizione necessaria nella sezione 7.
<ol>
	<li>Contrassegnare i primi 3 tubi a condizione. Essi avranno il volume totale dei lisati cellulari ottenuti al punto 6.4.</li>
	<li>Contrassegnare una A in 3 provette per condizione. Questi tubi avrà i primi surnatanti ottenuti dopo lisi e filatura lisati cellulari, punto 7.2.</li>
	<li>Contrassegnare un B in 3 provette per condizione. Questi tubi avrà una piccola aliquota di surnatanti primi. Questi lisati servirà come i campioni di Western blot al punto 7.3.</li>
	<li>Contrassegnare un C a 3 tubi a condizione. Questi tubi sono i surnatanti ottenuti dopo il pull-down con NeutrAvidin, passo 7,7. Nota: Questo è importante nel caso in cui il Western blot ha mostrato nessun segnale per le proteine, vale a dire le proteine non sono state tirate o sono stati perse in qualche fase della procedura. Se questa fosse la situazione, ripetere il processo per tirare giù le proteine.</li>
</ol>
4. cellulare trattamento con il BCPPs
<ol>
	<li>Aspirare il terreno di coltura.</li>
	<li>Sostituire il corrispondente volume di terreno nuovo per incubare il BCPPs nel più piccolo volume possibile di mezzo secondo i tempi di incubazione necessaria. È molto importante che in ogni caso, il mezzo copre completamente l'intera superficie del piatto/pallone di modo che le cellule non seccano, per esempio, 6 mL / 150 cm2 per un'incubazione di 30 min.</li>
	<li>Aggiungere il volume della soluzione stock di BCPP colture cellulari per raggiungere la concentrazione che ha dimostrata di essere efficace. In questo studio 50 µM TAT-Cx43266-283- B è stato dimostrato per ridurre la proliferazione di GSC.
	<ol>
		<li>Di conseguenza, 92,8 µ l di 2 mg/mL TAT-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) per mL di terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Se il volume da aggiungere è diverso per i peptidi di controllo, corredato da terreno di coltura fino allo stesso volume finale. Per esempio, 49,1 µ l TAT-B (MW = 1914.31 g/mol) plus 43,7 medio di GSC µ l sono stati aggiunti per mL di terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 50 µM TAT-B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posizionare le cellule nell'incubatore a 37 ° C e 5% di CO2 per 30 min per assicurarsi che le interazioni tra il BCPP e i suoi partner intracellulare si svolgono. Se l'interazione richiede più tempo, incubare per tempi più lunghi o regolare i tempi nel caso in cui l'esperimento consisteva di un corso a tempo. Inoltre, l'interazione di interesse può essere promosso o impedita da stimolante diverse vie di segnalazione intracellulare.</li>
</ol>
5. tamponi e soluzioni.
<ol>
	<li>Preparare PBS pH 7.4: 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4.</li>
	<li>Preparare il tampone di lisi di proteina: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, prima di utilizzare, aggiungere quanto segue: 1/100 (v/v) Cocktail inibitore di proteasi, 1mm fluoruro di sodio, 1 mM fenilmetanosolfonil fluoruro (PMSF) e 0,1 mM sodio ortovanadato.</li>
	<li>Preparare il tampone di Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6.8; 5m glicerolo; 3,7% SDS (p/v); 0,6 M β-mercaptoetanolo o 9 mM DTT; 0,04% (v/v) bromofenolo (BB)).</li>
</ol>
6. estrazione di proteine
Nota: Estrazione della proteina è stata eseguita come descritto in precedenza20,23. Svolgere questa intera sezione della procedura a 4 ° C.
<ol>
	<li>Aspirare il terreno di coltura completamente.</li>
	<li>Lavare 3 x 10 mL di con gelido fosfato tampone salino (PBS) a 150 cm2 con molta attenzione per evitare il distacco delle cellule.</li>
	<li>Per ottenere il lysate delle cellule, aggiungere 3 mL di tampone di lisi per 150 cm2 e raschiare accuratamente la superficie utilizzando un raschietto di cella. Inclinazione della piastra/muffola a circa 45 gradi renderà più facile per raccogliere i lisati cellulari in loro provette corrispondenti.</li>
	<li>Versare 1 mL di cellulare lisato per tubo in tre provette da 1,5 mL. Questi tubi possono essere evidenziati con la condizione e la replica come indicato al punto 3.1.</li>
</ol>
7. pull-down
<ol>
	<li>Centrifugare le provette da 1,5 mL a 11.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire i surnatanti in nuove provette (A).</li>
	<li>Prendere una parte aliquota di questo supernatante a condizione per tubi diversi (B), cioè 50 µ l per provetta. Aggiungere 4 x Laemmli tampone (16,6 µ l 50 µ l di lisato) e congelare a-20 ° C. Questi lisati servirà come al solito Western blot campioni.</li>
	<li>Omogeneizzare bene NeutrAvidin Agarose mediante agitazione delicata. Tagliare le punte dei puntali per aumentare il loro diametro e migliorare il pipettaggio di perline.</li></ol>Aggiungere 50 µ l di NeutrAvidin Agarose di lysate nei tubi (A) delle cellule per mL.
	<li>Incubare a 4 ° C durante la notte con agitazione molto delicata per consentire NeutrAvidin interagire con BCPPs associato ai loro partner intracellulare.</li>
	<li>Centrifugare a 3.000 x g per 1 min a 4 ° C per raccogliere il complesso di NeutrAvidin con proteine.</li>
	<li>Rimuovere i surnatanti delicatamente e trasferirli al pulito tubi (C). Tenerli per utilizzarli nel caso in cui il pull-down non è riuscito.</li>
	<li>Fasi di lavaggio: aggiungere tampone di lisi fresco per i pellet (tubi A), risospendere capovolgendo e ripetere i passaggi 7,6) e 7,7) per altre 5 volte. Tutti questi surnatanti possono essere scartati.</li>
	<li>Rimuovere i surnatanti e aggiungere 2 x Laemmli tampone al volume finale desiderato (40 µ l in ogni provetta da 1,5 mL per pellets ottenuti da 150 cm2 fiaschi di cellule confluenti).</li>
	<li>Eluire a 100 ° C per 5 min dissociare le interazioni tra proteine e centrifugare per 30 s a 8.200 x g a pellet NeutrAvidin perline.</li>
	<li>Prendere i surnatanti, contenenti le proteine dissociate, con punte di capillare in nuove provette (D). Le perline possono essere tenute in caso di ripetuti passaggi di eluizione è richiesto. Nota: I surnatanti (tubi D) sono ora pronti per essere caricati in Western blot o per congelare a-20 ° C.</li>

8. Western Blot
Nota: Macchiare occidentale è stato effettuato come descritto in precedenza24.
<ol>
	<li>Volume equivalente di ogni campione per corsia il Bis-Tris (4-12%) midigels in un sistema di elettroforesi di Midi-cella di carico.</li>
	<li>Transblot proteine usando un sistema assorbente asciutto in una pila di regolari di nitrocellulosa.</li>
	<li>Macchia la membrana con 10% Ponceau per 10 min.</li>
	<li>Lavare le membrane 3 x 5 min con 5 mL di Immunotyping.</li>
	<li>Bloccare le membrane con 7% latte in Immunotyping per 1 h con agitazione delicata in tubi o piccole scatole. Assicurarsi che il volume utilizzato è sufficiente a coprire le membrane e che essi non a secco, cioè 40 mL / membrana intera midi.</li>
	<li>Lavare 3 x 5 min con 5 mL di Immunotyping.</li>
	<li>Incubare per una notte a 4 ° C con l'anticorpo primario contro la proteina di interesse con agitazione delicata.</li>
	<li>Lavare 3 x 5 min con 5 mL di Immunotyping.</li>
	<li>Incubare la membrana a temperatura ambiente con il corrispondente anticorpo coniugato perossidasi secondario in Immunotyping per 1 h.</li>
	<li>Lavare 3 x 5 min con 5 mL di Immunotyping.</li>
	<li>Sviluppare con un substrato chemiluminescente in un sistema di chemiluminescenza.</li>
</ol>
9. risoluzione dei problemi
<ol>
	<li>Se dopo aver sviluppato il Western blot uno qualsiasi dei campioni ha mostrati nessun segnale a tutti per le proteine, controllare il Ponceau. Nota: La membrana in Ponceau dovrebbe mostrare indefinita e numerose bande musicali lungo le corsie caricato. Se le fasce non sono molto evidenti, la quantità di proteine caricato potrebbe non essere sufficiente o il trasferimento potrebbe essere andato in modo non corretto. Considera ripetendo il Western blot.</li>
	<li>Se non c'è nessuna macchia affatto nella membrana Ponceau in qualsiasi corsia, ripetere l'intera procedura dal passo 7.4 nei tubi (C).</li>
	<li>Se dopo aver sviluppato il Western blot un segnale di proteina è molto debole ma il Ponceau ha mostrato proteine, incubare nuovamente la membrana con l'anticorpo primario per più tempo. Se il segnale è ancora piuttosto debole, incubare nuovamente a temperatura ambiente.</li>
</ol>
10. altre tecniche usate in questo articolo
<ol>
	<li>Immunocitochimica di BCPPs
	<ol>
		<li>Difficoltà cellule in paraformaldeide al 4% (0,2 mL / cm2) per 20 min.</li>
		<li>Lavare 3 x 5 min con PBS (0,2 mL / cm2).</li>
		<li>Applicare l'anticorpo corrispondente (almeno 0,15 mL / cm2) diluito in soluzione di anticorpo alla concentrazione indicata dal produttore contro la proteina di interesse durante la notte a 4 ° C.</li>
		<li>Incubare con un anticorpo secondario coniugato fluoroforo (0,15 mL / cm2) per 2 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 10.1.2-10.1.4 con altri anticorpi contro vostre proteine di interesse. Fare attenzione a non utilizzare la stessa specie per diversi anticorpi primari o stessa lunghezza d'onda fluorofori per anticorpi secondari.</li>
		<li>Montare le celle utilizzando il reagente antifade (0,005 mL / cm2).</li>
		<li>Analizzare il microscopio a fluorescenza collegato a una fotocamera digitale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi di MTT
	<ol>
		<li>Coltura le cellule a 37 ° C nelle piastre da 24 pozzetti.</li>
		<li>Incubare le cellule al buio per 75 min con 0,15 mL di terreno di coltura per cm2 contenente 0,5 mg/mL MTT.</li>
		<li>Aspirare il mezzo e incubare le cellule per 10 min al buio con solfossido dimetilico (0,25 mL / cm2) con lieve agitazione.</li>
		<li>Misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ci sono molti metodi per studiare le interazioni proteina-proteina. Il metodo presentato in questo studio si basa sul sistema ampiamente usato biotina-avidina menu a tendina in cui un'esca biotinilati viene incubata con lisati cellulari per consentire la creazione di interazioni. La modifica ha presentata in questo studio include la combinazione di questa tecnica con sequenze di cellula-penetrante. Ci proponiamo di progettare esche cellula-penetrante che possono essere incubati con cellule viventi invece di lisati cellulari e pertanto le interazioni trovate rifletterà coloro che si sono verificati all'interno del contesto cellulare.
Qui usiamo TAT come la sequenza di cellula-penetrante, biotina, come il tag di discesa e la regione di Cx43 compresa tra aminoacidi 266-283 come destinazione per trovare interazioni intracellulari in artigiano umano. La base strutturale per l'interazione tra Cx43 e c-Src è ben noto11,12. Si tratta di un'importante interazione perché inibisce l'attività oncogena di c-Src in cellule glioma24,13. Infatti, CPPs contenente questa regione (TAT-Cx43266-283) imitano le proprietà antioncogenic di Cx43 il glioma cellule19,20,21. In cellule C6 glioma di ratto, il meccanismo da cui TAT-Cx43266-283 inibisce c-Src include l'assunzione di c-Src insieme ai relativi inibitori endogeni CSK e PTEN20. Va ricordato che artigiano è molto interessante come destinazione in terapia glioma, perché costituiscono una sottopopolazione resistente ai trattamenti convenzionali e pertanto responsabile per la ricorrenza di questo di tumori cerebrali maligni27. Inoltre, essi sono difficili a transfect cellule e pertanto lo studio delle interazioni intracellulari diventa più difficile. CPPs sono interiorizzati rapidamente ed efficientemente all'artigiano19 favorendo il loro uso per lo studio delle interazioni intracellulari. In questo studio, utilizzando CPPs fusa alla biotina confermiamo l'interazione della sequenza266-283 Cx43 con c-Src insieme ai suoi inibitori endogeni CSK e PTEN in artigiano umano.
Questo metodo è molto potente per studiare il meccanismo intracellulare di molecole bioattive. Tuttavia, è molto importante confermare che l'effetto biologico dell'esca penetrante biotinilati cella non è diverso da quello ottenuto con la non-biotinylated uno. Questo passaggio è necessario per associare le interazioni trovate con l'effetto del composto bioattivo. Inoltre, la stabilità del composto, sua eventuale degradazione da proteasi, come pure la sua tossicità possibile, dovrebbe essere attentamente testata e presa in considerazione prima di pianificare l'esperimento. Nell'esempio presentato, l'effetto anti-proliferativo di TAT-Cx43266-283 su G166 artigiano umano è stato precedentemente documentati20. In questo studio, confermiamo che l'effetto anti-proliferativo di TAT-Cx43266-283- B e di TAT-Cx43266-283 è molto simile. Inoltre, l'analisi della morfologia cellulare ha rivelato quello α-tubulina e la distribuzione di F-actina è molto simile a artigiano G166 trattati con TAT-Cx43266-283- B o con TAT-Cx43266-283. Complessivamente, questi risultati indicano che l'inclusione di biotina al c-terminale di TAT-Cx43266-283 non ha modificato gli effetti di questo composto su artigiano umano. Tuttavia, se biotina sarebbe modificare gli effetti della molecola bioattiva, altri tag per la purificazione della proteina può essere testato, come la bandiera octapeptide (DYKDDDDK)28, il tag di emoagglutinina-derivato influenza umana HA (YPYDVPDYA) o glutatione S-transferasi (GST)29. Allo stesso modo, se TAT non come target la popolazione delle cellule di interesse, altri cellulari sequenze penetrante, come penetratin, MPG (per una rassegna, Vedi30) o delle cellule specifiche sequenze possono essere usate31.
Oltre a studio di proteine che interagiscono specificamente con la sequenza di destinazione, idealmente, dovrebbe essere la presenza di proteine che interagiscono con il controllo e la sequenza di destinazione e proteine che non interagire con essi, come controlli positivi e negativi, indirizzata. In questo senso, abbiamo trovato Cav-1 nel controllo e trattato la situazione, suggerendo che le caveole sono stati coinvolti nel meccanismo di internalizzazione, come è stato precedentemente dimostrato26. Inoltre, FAK, che interagisce con c-Src, ma si suppone di non per interagire con il c-terminale di Cx43, era assente in situazione trattata sia il controllo. Questi risultati rinforzano la specificità dell'interazione tra TAT-Cx43266-283- B, c-Src, CSK e PTEN. Per confermare i risultati ottenuti con questo protocollo, la microscopia confocal può essere utilizzata per visualizzare la distribuzione delle proteine interagenti e per studiare la loro co-localizzazione. Quindi, abbiamo trovato quella TAT-Cx43266-283- B e c-Src Mostra una distribuzione intracellulare simile con alcuni punti di co-localizzazione confermando i risultati ottenuta con gli esperimenti di pull-down. In effetti, TAT-Cx43266-283- B è distribuito vicino alla membrana del plasma, suggerendo che il carico, in questo studio Cx43266-283, dirige la molecola ai suoi partner intracellulare.
Uno dei limiti del metodo proposto è che la molecola utilizzata come esca potrebbe non riuscire a piegare correttamente e gli effetti attesi non sarebbero stati trovati. In questo caso, le interazioni trovate non potevano essere associate all'effetto. Tuttavia, questo metodo può essere particolarmente interessante per le interazioni coinvolte nella trasduzione del segnale, perché esse sono di solito effettuate da regioni intrinsecamente disordinati32 e pertanto non richiedono un ripiegamento ordinato. Inoltre, uno dei vantaggi del metodo proposto è che può essere seguito il corso di tempo dell'interazione, che è particolarmente rilevante per le interazioni transienti. Inoltre, la rilevanza di ogni residuo sull'interazione possa essere facilmente studiata. Infatti, è possibile studiare la rilevanza delle modifiche di posttranslational su interazione proteina-proteina, per esempio, dalla sostituzione di phosphomimetic di glutammato per serina o treonina. Allo stesso modo, la sostituzione di serina o treonina per l'alanina o tirosina per fenilalanina consente di testare l'effetto di non fosforilabile serina, treonina o tirosina.Per simulare la fosfo-tirosina, il modo più accurato è la sostituzione di Tyr per p-Tyr33.
Infine, il campo di applicazione del presente protocollo è ben di là di interazione proteina-proteina, perché questo sistema può essere applicato a altri carichi bioattivi come sequenze di RNA, nanoparticelle, virus o altre molecole che possono essere fuse alla biotina e trasdotte con CPP per studiare il loro meccanismo intracellulare di azione.

Interazioni proteina-proteina sono essenziali per una grande varietà di processi cellulari. Per comprendere appieno questi processi, metodi per l'identificazione di interazioni della proteina all'interno dell'ambiente intracellulare complessa sono necessari. Uno dei metodi più utilizzati per identificare partners di interazione di una proteina consiste nell'utilizzare quella proteina o un peptide mimetico di una parte di quella proteina come esca in esperimenti di discesa di affinità seguiti da rilevamento delle proteine leganti. Il sistema avidina-biotina è frequente a causa dell'elevata affinità, specificità e stabile interazione tra avidina e la biotina1,2. Solitamente, la biotina è legame covalente con l'esca (proteina o peptide) e dopo un periodo di incubazione con i lisati cellulari per consentire la creazione di interazioni, l'esca biotinilato associato ai suoi partner intracellulare è tirato con avidina o avidina derivati coniugati con perline di supporto. Quindi, interazioni esca-proteina sono rilevate dopo lavaggio, eluizione e l'analisi di denaturare elettroforesi seguita mediante Western blot. Uno dei problemi di questa tecnica è che le interazioni fra la proteina di interesse e i suoi partner intracellulare si svolgono di fuori del contesto cellulare. Questo è particolarmente importante per le interazioni coinvolte nella trasduzione del segnale perché si svolgono in luoghi intracellulari specifici, essi sono transitori e si svolgono in genere di proteine non abbondanti. Di conseguenza, all'interno i lisati cellulari queste interazioni possono essere mascherate da altre proteine più abbondanti o di proteine che di solito non sono nelle immediate vicinanze.
Cellula-penetrante peptidi (CPPs) sono brevi peptidi (≤ 40 aminoacidi), composti principalmente da aminoacidi cationici che sono in grado di trasportare una vasta gamma di molecole in quasi qualsiasi cella3. Carichi come proteine, DNA del plasmide, siRNA, virus, agenti imaging e varie nanoparticelle stati coniugati alla CPPs e in modo efficiente interiorizzato4,5. A causa di questa capacità di trasporta sono noto anche come settori di trasduzione della proteina (PTDs), membrana dispostamento sequenze (MTSs) e peptidi Trojan. Tra la CPPs, il peptide TAT dalla proteina HIV transactivator TAT6 è stato uno dei più ampiamente studiato 7,8,9. TAT è un nonapeptide contenente 6 arginina e 2 residui di lisina e di conseguenza è altamente cationici. Sostituzione studi hanno dimostrato che la carica positiva netta di TAT è necessaria per interazioni elettrostatiche con le membrane plasmatiche delle cellule eucariotiche e sua successiva internalizzazione10. Allo stesso modo a altri CPPs, TAT caricato positivamente fortemente lega elettrostaticamente alle varie caricati negativamente specie presenti sulla superficie extracellulare delle membrane cellulari, tra cui gruppi di testa del lipido, glicoproteine e proteoglicani3 , 10. i bioattivi carichi trasportati da TAT diventano immediatamente liberi nel citosol per raggiungere loro partner intracellulare.
Qui presentiamo un metodo che combina il TAT CPP con biotina per studiare le interazioni intracellulari. L'obiettivo è quello di progettare esche cellula-penetrante fondendo la biomolecola bersaglio di TAT e di biotina. Il vantaggio principale di questa proposta è che le interazioni tra l'esca e i suoi partner si svolgerà all'interno del contesto cellulare. Per mostrare l'efficacia di questo metodo che abbiamo usato come esca una piccola sequenza della proteina Cx43 che è stato segnalato per interagire intracellulare con il proto-oncogene c-Src11,12,13. Cx43 è una proteina integrale di membrana che è ampiamente espresso in astrocytes14ed è down-regolato in gliomas di prima scelta, il più comune tumore maligno del sistema nervoso centrale15,16,17 ,18. È stato precedentemente dimostrato che la regione di Cx43 che interagisce con c-Src (aminoacidi 266-283 in Cx43 umana; PubMed: P17302) fuse a TAT (TAT-Cx43266-283) inibisce l'attività oncogena di cellule di glioma c-Srcin e cellule staminali di glioma (artigiano)19,20,21. Per progettare l'esca intracellulare, è stata fusa Cx43266-283 di TAT al N-terminale (TAT-Cx43266-283) e di biotina al C-terminale (TAT-Cx43266-283- B). Questa strategia è stata utilizzata con successo nel glioma di ratto linea cellulare C6 per identificare c-Src, c-terminale della chinasi Src (CSK) e fosfatasi e tensin homolog (PTEN) come partner intracellulare di questa regione di Cx4320. Qui, Descriviamo questo metodo di prova la sua efficacia in artigiano umano, che è molto rilevanti per la terapia di glioma, ma molto più difficile a transfect che le cellule staminali non glioma.

<table><tbody><tr><td>Linea G166 GSC</td><td>BioRep</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RHB-A terreno per cellule staminali</td><td>Takara</td><td>Y40001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>10 &; g/ml</td></tr><tr><td>B-27 Integratore senza siero (50X)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>2%</td></tr><tr><td>N-2 Integratore (100x)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>1%</td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>B-FGF umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4: In acqua deionizzata, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4&middot; 2H2O ; 1,7 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10 terreno di crioconservazione</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>TAT</td><td>GenScript-Su</td><td></td> <td>misura</td></tr><tr><td>TAT-B</td><td>GenScript-Su</td><td></td> <td>misura</td></tr><tr><td>TAT-Cx43266-283</td><td>GenScript-Su</td><td></td> <td>misura</td></tr><tr><td>TAT-Cx43266-283-B</td><td>GenScript-Sonde</td><td></td><td></td></tr> <tr>molecolari<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A1275737</td><td></td><td>1/20</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale &alfa;-tubulina nel topo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1/500</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Sonde molecolari, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>1,25 mg/ml</td></tr><tr><td>Pierce&trade; NeutrAvidin&commercio; Agarosio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per la lisi delle proteine: 5 mM di Tris-HCl (pH 6,8), 2% (p/v) SDS, 2 mM di EDTA, 2 mM di EGTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor Protease Cocktail Set III. Senza EDTA</td><td>Calbiochem, Bionova</td><td>539134</td><td>1/100 (v/v)</td></tr><tr><td>Fluoruro di sodio</td><td>PanReac AppliChem</td><td>141675</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Ortovanadato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>Tampone di Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glicerolo; 3,7 % (p/v) SDS; 0,6 M &beta;-mercaptoetanolo o 9 mM DTT ; 0,04% (v/v) blu di bromofenolo (BB) .</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>Xcell 4 SureLock Midi-Cell Sistema di elettroforesi Life</td><td>Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12%</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WG1402box</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td>1X</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer 20x</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0006</td><td>1X</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 NC Regular Stacks (membrane in nitrocellulosa)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Dry Blotting System - Dispositivo di trasferimento del gel</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Ponceau S al 10% (0,1% Ponceau (p/v) in acido acetico al 5% (v/v)) in acqua</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>FAK anticorpo policlonale di coniglio</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>AHO0502</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Src anticorpo policlonale di coniglio</td><td>Cell Signalling (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Csk anticorpo policlonale di coniglio</td><td>Cell Signalling (WERFEN)</td><td>4980</td><td>1/500</td></tr><tr><td>PTEN policlonale di topo anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare (WERFEN)</td> <td>9552</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Caveolina-1 anticorpo policlonale di coniglio</td><td>Abcam</td><td>ab2910</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG-HRP anticorpo</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-2005</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG-HRP anticorpo</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2030</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagente</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>Src anticorpo policlonale di coniglio</td><td>Segnalazione cellulare (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Soluzione di anticorpi: PBS, 10% FBS, 0,1 M lisina, 0,02% sodio azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo</td><td>IgG Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Streptavidina coniugata Cy2</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-220-089</td><td>1/500</td></tr><tr><td>MicroChemi Sistema di luminescenza</td><td>Sistemi di bio-imaging</td><td></td><td></td>del DNA</tr><tr><td>Kit per apoptosi delle cellule morte con Annexin V Alexa Fluor&reg; 488 & Ioduro di Propidio (PI)</td><td>Sonde molecolari, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>V13241</td><td>1/500</td></tr><tr><td>SlowFade Gold reagente antisbiadimento</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Tiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido per spettroscopia UV, >=99,8% (GC)</td><td>Honeywell</td><td>41641-1L</td><td></td></tr><tr><td>Appliskan 2001</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biotinylated cell-penetrating peptidi per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Qui presentiamo un protocollo per lo studio di interazioni proteina-proteina intracellulare che si basa il sistema di menu a tendina ampiamente usato biotina-avidina. La modifica presentata comprende la combinazione di questa tecnica con sequenze di cellula-penetrante. Ci proponiamo di progettare esche cellula-penetrante che possono essere incubati con cellule viventi invece di lisati cellulari e pertanto le interazioni trovate rifletterà quelli che si verificano all'interno del contesto intracellulare. Connexin43 (Cx43), una proteina che forma canali di gap junction e adenosina è down-regolato in gliomas di prima scelta. La regione di Cx43 composto da aminoacidi 266-283 è responsabile dell'inibizione dell'attività oncogena del c-Src in cellule del glioma. Qui usiamo TAT come la sequenza di cellula-penetrante, biotina, come il tag di discesa e la regione di Cx43 compresa tra aminoacidi 266-283 come destinazione per trovare interazioni intracellulari nelle cellule staminali duro transfect glioma umano. Uno dei limiti del metodo proposto è che la molecola utilizzata come esca potrebbe non riuscire a piegare correttamente e, di conseguenza, le interazioni trovate potrebbero non essere associate con l'effetto. Tuttavia, questo metodo può essere particolarmente interessante per le interazioni coinvolte nella trasduzione del segnale, perché esse sono di solito effettuate da regioni intrinsecamente disordinate e, pertanto, non richiedono un ripiegamento ordinato. Inoltre, uno dei vantaggi del metodo proposto è che la rilevanza di ogni residuo sull'interazione possa essere studiata facilmente. Si tratta di un sistema modulare; di conseguenza, possono essere impiegate altre sequenze di cellula-penetrante, altri tag e altri bersagli intracellulari. Infine, il campo di applicazione del presente protocollo è ben di là di interazione proteina-proteina, perché questo sistema può essere applicato a altri carichi bioattivi come sequenze di RNA, nanoparticelle, virus o qualsiasi molecola che può essere trasdotte con sequenze di cellula-penetrante e fuso a discesa Tag per studiare il loro meccanismo d'azione intracellulare.

Prima di utilizzare BCPPs per studiare l'interazione intracellulare, è fondamentale per confrontare gli effetti di BCPP vs CPP per convalidare i risultati ottenuti con BCPP. Di conseguenza, per studiare se l'inclusione di biotina modifica l'attività della sequenza dell'obiettivo, abbiamo prima analizzato l'effetto di TAT-Cx43266-283- B rispetto con TAT-Cx43266-283 sulla morfologia G166 artigiano. A tale scopo, abbiamo effettuato alcune analisi di immunofluorescenza di due proteine del citoscheletro, F-actina e α-tubulina dopo 24 h di trattamento. La figura 1 Mostra che G166 artigiano in presenza di 50 µM TAT-Cx43266-283 o TAT-Cx43266-283- B acquisire una forma più arrotondata rispetto ai prolungamenti cellulari allungati ed espansi mostrati nei controlli (TAT o TAT-B). Infatti, la Figura 1b Mostra che i filamenti dell'actina sono principalmente assemblati come reti di actina quando le cellule sono state trattate con TAT-Cx43266-283 o TAT-Cx43266-283- B mentre formano più fasci di actina nelle cellule di controllo (trattati con TAT o TAT-B)25. Al contrario, la distribuzione di α-tubulina non variare tra le diverse condizioni. Questi risultati hanno mostrato che la presenza di biotina non ha modificato l'effetto della sequenza dell'obiettivo sulla morfologia del G166 artigiano. In precedenti studi20,21, abbiamo mostrato che TAT-Cx43266-283 ridotta proliferazione G166 artigiano. In questo studio, abbiamo studiato se TAT-Cx43266-283- B esercita gli stessi effetti della crescita come TAT-Cx43266-283. A tale scopo, abbiamo analizzato la proliferazione di G166 artigiano dall'analisi di MTT dopo 72 h del trattamento. L'analisi di MTT è un saggio colorimetrico per valutare l'attività metabolica delle cellule. MTT è metabolizzato dagli enzimi ossidoriduttasi di NAD (P) H in mitocondri che riflette il numero di cellule vitali presenti. La figura 2 Mostra che la riduzione l'attuabilità delle cellule G166 artigiano non è significativamente diversa quando le cellule sono state trattate con 50 µM TAT-Cx43266-283 o 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Infatti, entrambi significativamente diminuita proliferazione G166 artigiano rispetto al controllo, TAT o TAT-B.
Una volta abbiamo confermato che l'effetto della nostra sequenza di destinazione in G166 artigiano (TAT-Cx43266-283) non è stato modificato tramite l'inclusione di biotina al C-terminale (TAT-Cx43266-283- B), abbiamo studiato i partner intracellulari di questa sequenza seguendo il protocollo descritto in questo studio (Figura 3). Perché caveolae sono stati coinvolti nel meccanismo di TAT interiorizzazione26, abbiamo analizzato la presenza di caveolin-1 (Cav-1) nel pull-down. L'analisi Western blot (Figura 4) ha mostrato che TAT-B e TAT-Cx43266-283- B interagire con Cav-1. Tuttavia, la capacità di TAT-Cx43266-283- B per l'assunzione di c-Src, PTEN e CSK è più forte di quello trovato con TAT-B. Chinasi focale di adesione (FAK) è un substrato del c-Src che non è stato dimostrato interagire con Cx43. Infatti, FAK non ha mostrato alcuna significativa interazione con TAT-B o TAT-Cx43266-283- B.
Per confermare l'interazione tra TAT-Cx43266-283- B e c-Src, artigiano G166 sono state incubate con 50 µM TAT-Cx43266-283- B per 30 min e la loro localizzazione è stata seguita con streptavidina fluorescente mediante microscopia confocale (Figura 5 ). I nostri risultati hanno mostrato che la distribuzione intracellulare di TAT-Cx43266-283- B è vicino alla membrana plasmatica (mostrata dalla macchiatura fosfatidilserina) e corrisponde a quella di c-Src. Infatti, le analisi di co-localizzazione hanno rivelato alcuni punti di co-localizzazione (bianco) tra TAT-Cx43266-283- B e c-Src dell'immagine di tipo merge. Di conseguenza, gli studi di microscopia confocale confermano i risultati ottenuti con il protocollo di discesa BCPP descritto in questo studio.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig1.jpg"> 
Figura 1: Effetto di BCPP e CPP sulla morfologia di GSC. G166 artigiano erano cromate a una bassa densità (2 x 104 cellule / cm2) e dopo 24 ore che sono state incubate con controllo di 50 µM CPP (TAT), controllo BCPP (TAT-B), trattamento CPP (TAT-Cx43266-283) o trattamento BCPP (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-actina (rosso), α-tubulina (verde) e unite + DAPI immunostaining del campo stesso, mostrando G166 artigiano morfologia. Bar = 50 µm. b)-F-actina immunostaining mostrando la diversa distribuzione di F-actina in G166 artigiano dopo incubazione per 24 h con 50 µM CPP (TAT) di controllo o controllo BCPP (TAT-B) rispetto al trattamento di 50 µM CPP (TAT-Cx43266-283) o BCPP (TAT-Cx43 266-283-B). Bar = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig2.jpg"> 
Figura 2: Effetto di BCPP e CPP sulla vitalità di GSC. G166 artigiano erano placcato a 5500 cellule/cm2 a 24 pozzetti piastre e incubati con peptidi controllo a 50 µM, CPP (TAT) o BCPP (TAT-B), o 50 µM trattamento peptidi, CPP (TAT-Cx43266-283) o BCPP (TAT-Cx43266-283- B). L'attuabilità delle cellule è stata analizzata usando un'analisi MTT dopo 72 h. I risultati vengono espressi come assorbanza MTT e sono la media ± s.e.m. di almeno 3 esperimenti (+ + p˂0.01 vs controllo. * * p˂0.01, * * * p˂0.001 contro TAT o TAT-B; post-test withTukey di One-way ANOVA). Si noti che non ci sono differenze significative tra gli effetti di CPPs vs BCPPs. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig3.jpg"> 
Figura 3: Schema di protocollo. Descrizione passo per passo grafica della procedura come descritto nella sezione "Protocollo", dall'incubazione di BCPPs fino a quando il BCPPs eluiti e le loro proteine interagenti erano obtained.1) Incubare le cellule di cultura con BCPPs alla concentrazione desiderata per il tempo richiesto. 2) durante l'incubazione, i BCPPs sono interiorizzati e interagiscono con i loro partner intracellulare. 3) lavare le cellule tre volte sul ghiaccio con PBS ghiacciata. 4) lisare le cellule per estrarre le proteine. 5) trasferimento lisati cellulari ai tubi.6) girare a 11000 x g per 10 min a 4 ° C. 7) trasferimento i surnatanti di nuovi tubi (A) e mantenere una piccola aliquota dei lisati per elaborare come regolare Western blot campioni in tubo (B). 8) Risospendere le perline di NeutrAvidin Agarose e aggiungere 50 µ l in ogni provetta un'utilizzando un puntale di taglio. 9) Incubare con delicatamente agitazione per 12 h a 4 ° C per consentire le perline di agarosio NeutrAvidin per interagire con gli BCPPs e i loro partner. 10) spin per 1 min a 3000 x g per appallottolare le perline con il biotinilati esche e le loro proteine interagenti ad essi associati. 11) trasferire i surnatanti in nuove provette (C) e tenerli da utilizzare nel caso in cui il pull-down devono essere ripetute. 12) lavare la pallina cinque volte con tampone di lisi fresco, risospendere capovolgendo, spin per 1 min a 3000 x g e scartare il surnatante. 13) rimuovere con attenzione tutto il supernatante. 14) aggiungere il volume desiderato di 4x Laemmli buffer ed eluire le proteine a 100 ° C per 5 min 15) Spin a 8200 x g per 30 s a pellet le perline. 16) trasferire le proteine eluite trovate nel surnatante con capillare suggerimenti per nuovi tubi (D). 17) caricare sul gel per l'analisi Western blot. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig4.jpg"> 
Figura 4: Studio delle interazioni intracellulari di TAT-Cx43266-283- B in G166 artigiano di discesa seguita mediante Western blot. G166 artigiano sono stati incubati con 50 µM TAT-B o TAT-Cx43266-283- B. Dopo 30 min, le cellule sono state lisate e TAT-B o TAT-Cx43266-283- B allegata ai loro partner intracellulare sono stati tirati con perline NeutrAvidin. Le proteine eluite sono state caricate e analizzate mediante Western blot per studiare i livelli di FAK, c-Src, CSK, PTEN e Cav-1. Nota che Cav-1 interagisce con entrambi TAT-B e TAT-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN e CSK interagire preferenzialmente con TAT-Cx43266-283- B e FAK non ha mostrato alcuna interazione con TAT-B o TAT-Cx43266-283-B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig4large.jpg" target="_blank">per favore Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig5.jpg"> 
Figura 5: Conferma delle interazioni intracellulari -B266-283TAT-Cx43 in G166 artigiano mediante microscopia confocale. G166 artigiano sono stati incubati con 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Dopo 30 min, le cellule erano fissi e trattate per localizzare TAT-Cx43266-283- B con Cy2-streptavidina (verde), c-Src di immunofluorescenza (rosso) e fosfatidilserina con Annessina V (blu). Nota: alcuni punti di co-localizzazione (bianco) tra TAT-Cx43266-283- B e c-Src vicino alla membrana del plasma delle immagini di tipo merge. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Si tratta di un protocollo per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare basate sul sistema avidina-biotina menu a tendina con la novità di combinare sequenze cellula-penetrante. Il vantaggio principale è che la sequenza di destinazione viene incubata con le cellule viventi invece di lisati cellulari e pertanto si verificherà le interazioni all'interno del contesto cellulare.

Biotinylated Cell-penetrating peptidi per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare le interazioni proteina-proteina in un contesto intracellulare. Ciò si ottiene attraverso un sistema di pull-down biotina-avidina combinato con sequenze autopenetranti, che consente l'incubazione nella sequenza bersaglio con cellule viventi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione cellulare, come le interazioni rapide e dinamiche tra le biomolecole per ottenere segnali specifici.Il vantaggio principale di questa tecnica è che le interazioni molecolari avvengono in un contesto intracellulare. In questo studio, piastra le cellule staminali del glioma umano G166 o GSC in quattro fiasche di 150 centimetri quadrati come descritto nel protocollo di testo. Processare le celle quando viene raggiunta la confluenza.Quando cinque milioni di celle G166 vengono placcate in un pallone di 150 centimetri quadrati, vengono lavorate due giorni dopo la placcatura. Centrifugare le fiale contenenti i peptidi liofilizzati biotinilati che penetrano nelle cellule a 8, 200 volte g per 30 secondi per evitare che parte della polvere rimanga sul coperchio. Includi un BCPP controllato per essere sicuro che le interazioni trovate siano specifiche per la sequenza target.Quindi, sciogliere i BCPP nel terreno di coltura corrispondente alla soluzione madre indicata dal produttore. Per ottenere una soluzione madre di due milligrammi per millilitro di BCPP per il trattamento delle GSC, aggiungere 0,5 millilitri di terreno di coltura GSC a una fiala contenente un milligrammo di BCPP. Agitare le fiale e assicurarsi che il peptide sia ben sciolto.Preparare almeno 12 provette da 1,5 millilitri per condizione nel test di pull-down da eseguire. Contrassegnare i primi tre tubi in base alla condizione. Avranno il volume totale di lisati cellulari.Quindi, segna una A su tre tubi per condizione. Questi tubi avranno i primi surnatanti ottenuti dopo la lisi e la filatura dei lisati cellulari. Quindi, segnare una B su tre tubi per condizione.Queste provette avranno una piccola aliquota dei primi surnatanti per campioni di western blot. Infine, segnare una C su tre tubi per condizione. Queste provette avranno i surnatanti ottenuti dopo il pull-down con NeutrAvidin.Dopo aver aspirato il terreno di coltura dalle cellule, sostituirlo con il corrispondente volume di terreno fresco necessario per incubare i BCPP nel volume di terreno più piccolo possibile in base ai tempi di incubazione. È molto importante che in ogni caso il fluido copra completamente l'intera superficie del pallone. Aggiungere il volume della soluzione madre di BCPP alle colture cellulari per raggiungere la concentrazione che si è dimostrata efficace.Pertanto, aggiungere 92,8 microlitri di due milligrammi per millilitro di TAT-connessina 43 266-283 biotina per millilitro di terreno di coltura. Posizionare le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti per assicurarsi che avvengano le interazioni tra il BCPP e i suoi partner intracellulari. Per eseguire l'estrazione delle proteine, aspirare prima completamente il terreno di coltura, quindi lavare le cellule con 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato per 150 centimetri con molta attenzione per evitare l'autodistacco.Per ottenere il lisato cellulare, aggiungere tre millilitri di tampone di lisi per pallone da 150 centimetri quadrati e raschiare accuratamente la superficie utilizzando un raschietto cellulare. Inclinando il pallone di circa 45 gradi sarà più facile raccogliere i lisati cellulari nelle provette corrispondenti. Versare un millilitro di lisato cellulare per provetta in tre provette da 1,5 millilitri contrassegnate per condizione.Per il pull-down, centrifugare le provette da 1,5 millilitri a 11.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire i surnatanti in nuove provette etichettate A.Trasferire un'aliquota del surnatante per condizione in diverse provette etichettate B.Quindi, aggiungere 16,6 microlitri di tampone Laemmli 4x per 50 microlitri di lisato e congelare a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, omogeneizzare molto bene l'agarosio NeutrAvidin agitando delicatamente.Tagliare le punte dei puntali delle pipette per aumentarne il diametro e migliorare il pipettaggio delle perline. Quindi, aggiungere 50 microlitri di NeutrAvidin agarosio per millilitro di lisato cellulare nelle provette A. Incubare i lisati cellulari a quattro gradi Celsius durante la notte con agitazione molto delicata per consentire a NeutrAvidin di interagire con i BCPP legati ai loro partner intracellulari.Quindi, centrifugare a 3.000 volte g per un minuto a quattro gradi Celsius per raccogliere il complesso di NeutrAvidin con le proteine. Rimuovere con cautela i surnatanti e trasferirli in provette pulite etichettate C.Conservarle per utilizzarle nel caso in cui il pull-down non riesca. Per lavare il complesso di NeutrAvidin con le proteine, aggiungere un tampone di lisi fresco ai pellet delle provette A.Risospendere il pellet per inversione e ripetere la centrifugazione. Ripeti questo lavaggio per altre cinque volte. Tutti questi surnatanti possono essere scartati.Quindi, aggiungere 40 microlitri di 2x tampone Laemmli per tubo da 1,5 millilitri per pellet ottenuti da 150 fiasche di centimetri quadrati di celle confluenti. Quindi, eluire a 100 gradi Celsius per cinque minuti per dissociare le interazioni tra le proteine. Dopo l'eluizione, centrifugare per 30 secondi a 8, 200 volte g per pellettare le perle di NeutrAvidin.Trasferire i surnatanti contenenti le proteine dissociate con punte capillari in nuove provette etichettate D. Questi surnatanti sono ora pronti per essere caricati in un western blot come descritto nel protocollo di testo o possono essere congelati a meno 20 gradi Celsius. Qui sono mostrate immagini di immunocitochimica che mostrano che la fusione della biotina con la connessina TAT-43 266-283 non modifica gli effetti del peptide che penetra nelle cellule sulla morfologia delle cellule staminali del glioma. L'analisi MTT delle GSC trattate con BCPP o CPP mostra che la fusione della biotina con TAT-connessina 43 266-283 non modifica l'effetto antiproliferativo della TAT-connessina 43 266-283 sulla GSC.Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi di un pull-down del BCPP seguito da western blot. Il western blot mostra che le proteine descritte per interagire con il TAT, ad esempio Cav-1, compaiono in entrambe le condizioni. Le proteine descritte per interagire con Cx43, ad esempio c-Src e PTEN, compaiono subito dopo il pull-down di TAT-connessina 43 266-283, mentre le proteine che non interagiscono direttamente con Cx43 o TAT non sono presenti, ad esempio FAK.Le immagini al microscopio confocale confermano le interazioni intracellulari riscontrate con i BCPP. Le immagini mostrano la colocalizzazione intracellulare di TAT-connessina 43 266-283 con c-Src vicino alla membrana plasmatica nelle GSC G166. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante confermare la temperatura dei reagenti e della centrifuga, nonché la confluenza delle cellule prima di aggiungere i peptidi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare le interazioni intracellulari proteina-proteina utilizzando peptidi biotinilati che penetrano nelle cellule. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada a ricerche nel campo della segnalazione cellulare per esplorare i meccanismi molecolari intracellulari e le loro vie specifiche di linea in cellule di coltura, colture organotipiche e persino modelli in vivo.Seguendo questa procedura, altri carichi bioattivi come sequenze di RNA, nanoparticelle, virus o altre molecole che possono essere trasfusi con peptidi che penetrano nelle cellule e fusi per abbattere i TAT possono essere utilizzati per studiare il loro meccanismo d'azione intracellulare. Sebbene questo protocollo non includa materiali estremamente pericolosi, non dimenticare di indossare guanti e camice da laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo video mostra esperimenti con successiva analisi delle interazioni proteina-proteina mediante l'uso di micro-fantasia superfici. L'approccio offre la possibilità di rilevare le interazioni delle proteine ​​nelle cellule viventi e combina le elevate capacità di throughput con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.

In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

Questo video mostra una tecnica che utilizza peptidi biotinilati che penetrano nelle cellule per rilevare le interazioni intracellulari proteina-proteina. I peptidi che penetrano nelle cellule facilitano l'ingresso del peptide coniugato in una cellula e si legano specificamente alle sue proteine interagenti. La biotina, dopo essersi legata all'avidina, permette la purificazione del complesso proteico interagente da un lisato cellulare.

Sonda peptidica biotinilata a penetrazione cellulare per rilevare le interazioni proteina-proteina

Lo screening dell'array di peptidi è un test ad alto rendimento per identificare i siti di interazione proteina-proteina. Ciò consente di mappare più interazioni di una proteina bersaglio e può servire come metodo per identificare i siti per gli inibitori che prendono di mira una proteina. Qui descriviamo un protocollo per lo screening e l'analisi degli array di peptidi.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Descriviamo un metodo per generare linee cellulari stabili inducibili marcate con localizzazione e purificazione di affinità (LAP) per studiare la funzione delle proteine, la localizzazione subcellulare spaziotemporale e le reti di interazione proteina-proteina.

Inducibile LAP-tagged linee cellulari stabili per indagare la funzione delle proteine, Spatiotemporal Localizzazione e reti di interazione proteina

Questo manoscritto descrive il protocollo per purificazione di affinità complementazione bimolecolare (BiCAP). Questo metodo novello facilita l'isolamento specifico e caratterizzazione proteomica a valle di qualsiasi due proteine interagenti, mentre escluse ONU-complessato singole proteine, nonché complessi formati con concorrenti partner di legame.

Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP)

Forniamo un protocollo dettagliato per Spalato-BioID, un'analisi di frammenti-complementazione della proteina basata sulla tecnica di prossimità-etichettatura BioID. Attivato sull'interazione di due proteine specificate, permette l'analisi proteomica dei complessi della proteina contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Il metodo è semplice, economica e richiede solo la normale attrezzatura da laboratorio.

Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

Questo protocollo si concentra sull'identificazione delle proteine che si legano ai fosfati inositoli o fosforoparassiti. Utilizza la cromatografia di affinità con fosfati inositoli biotinylati o fosforostostodi che vengono immobilizzati tramite streptavidin a agarose o perline magnetiche. Le proteine leganti al fosfato o fosfoinosazione sono identificate da gonfiore occidentale o spettrometria di massa.

Identificazione delle proteine che interagiscono con fosfato inositolo o fosfonositide mediante matricografia affinità accoppiata a Blot occidentale o spettrometria di massa

Il test di perdita di fluorescenza è un metodo semplice che consente di studio delle interazioni peptidi/membrana al fine di comprendere il loro coinvolgimento in diversi processi biologici e in particolare la capacità dei peptidi penetranti nelle cellule di disturbare i doppio strati dei fosfolipidi durante un processo di traslocazione cellulare diretta.

Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Il protocollo presenta un metodo per l'attaccamento covalente in vivo della biotina alle proteine in base alla loro vicinanza a una biotina ligasi fusa a una proteina di interesse. Questa modifica consente un arricchimento selettivo delle proteine utilizzando perle di streptavidina come necessario negli studi di interazione proteica.

In vivo Biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia

Scopri come studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare utilizzando peptidi cell-penetranti biotinilati e saggi di pull-down in cellule staminali di glioma G166.

Biotinylated Cell-penetrating peptidi per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare

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