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Advanced Biology

Un'introduzione all'endocitosi e all'esocitosi

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Cell Biology

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An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

4.6: Invasion Assay Using 3D Matrices

4.8: Cell-surface Biotinylation Assay

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09:27 min

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April 30, 2023

Overview

Le cellule possono assumere sostanze dall’ambiente extracellulare mediante endocitosi e rilasciare attivamente molecole in esso mediante esocitosi. Tali processi coinvolgono sacche legate alla membrana lipidica chiamate vescicole. La conoscenza dell’architettura molecolare e dei meccanismi di entrambi è la chiave per comprendere la normale fisiologia cellulare, così come gli stati patologici che sorgono quando diventano difettosi.

Questo video esaminerà prima brevemente alcune scoperte fondamentali nella storia della ricerca sull’endo- e l’esocitosi. Successivamente, verranno esaminate alcune domande chiave, seguite da una discussione sui metodi di spicco utilizzati per indagare su questi problemi, tra cui l’etichettatura cellulare, i saggi di fusione e l’imaging a fluorescenza. Infine, esplorerà le attuali ricerche condotte oggi dagli scienziati del settore.

Procedure

Le vie endocitiche ed esocitiche sono fondamentali per l’omeostasi cellulare, la funzione tissutale e la sopravvivenza cellulare globale. In poche parole, l’endocitosi è il processo che una cellula utilizza per prendere molecole dallo spazio extracellulare piegando la sua membrana attorno ad essa e formando una vescicola. L’esocitosi è il processo inverso, che utilizza le vescicole per rilasciare sostanze nello spazio extracellulare. Questi processi sono stati suggeriti per svolgere un ruolo critico nella secrezione ormonale, nell’internalizzazione del recettore di membrana, nell’inghiottimento di agenti patogeni e nelle comunicazioni neuronali.

Oggi ripercorreremo alcune delle scoperte di riferimento nel campo dell’endocitosi e dell’esocitosi, evidenzieremo alcune delle domande senza risposta, presenteremo metodi notevoli che vengono utilizzati oggi e, infine, esploreremo alcuni esperimenti specifici eseguiti per comprendere meglio questi processi.

Rivisitiamo alcune delle scoperte epocali che hanno portato all’attuale comprensione dell’endocitosi e dell’esocitosi.

La prima documentazione relativa all’endocitosi può essere mappata al 1882, quando Ilya Metchnikov, usando un microscopio ottico, osservò che cellule specifiche inghiottivano agenti patogeni invasori. Ha chiamato questo processo “fagocitosi”, in cui le cellule inghiottono l’agente patogeno attraverso la formazione di vescicole. Quasi mezzo secolo dopo, nel 1931, Warren Lewis osservò un simile processo di formazione di vescicole quando le cellule assumevano liquido. Ha chiamato questo comportamento “pinocitosi”.

Più tardi, nel 1953, George Palade, mentre esaminava l’organizzazione strutturale e funzionale della cellula, scoprì invaginazioni “caverniche” delle membrane e le chiamò caveole. Ha dedotto che questi devono essere necessari per l’assunzione di cellule. Poco dopo, nel 1955, il premio Nobel Christian de Duve coniò il termine endocitosi, che comprendeva “fagocitosi” e “pinocitosi”. Tuttavia, la storia dell’endocitosi non era ancora finita.

Nel 1975, Michael Brown e Joseph Goldstein, con l’esperto di microscopia elettronica Richard Anderson, osservarono che quando la lipoproteina a bassa densità, o LDL, si lega al suo recettore di superficie cellulare, porta alla formazione di “fosse rivestite”. Queste fosse vengono quindi internalizzate e i recettori LDL endocitosi. Questa è stata la scoperta del terzo tipo, chiamato “endocitosi mediata dal recettore”. Nello stesso anno, Barbara Pearse isolò la principale proteina del mantello, una molecola di triskelion, e la chiamò clatrina. Pertanto, questo processo è anche chiamato “endocitosi mediata dalla clatrina”.

Questo riguardava l’endocitosi. Ora discutiamo di come abbiamo imparato a conoscere l’esocitosi. Nel 1980, il gruppo di Randy Schekman generò mutanti di lievito che erano carenti di secrezione e rivelò la presenza di geni critici che codificavano per le proteine necessarie per l’esocitosi.

Nel 1993, James Rothman identificò alcune di queste proteine e, in base alla loro natura chimica, furono chiamate SNARE. Nella sua seminale “ipotesi SNARE”, ha proposto che queste strutture elicoidali si aggancino l’una all’altra, facendo sì che le membrane si avvicinino con una forza sufficiente per fondersi e generare esocitosi.

Più o meno nello stesso periodo, Thomas Südhof stabilì che questo processo era anche strettamente controllato nei neuroni da proteine sensibili al calcio chiamate sinaptotagmine che favorivano e cronostazionano accuratamente la fusione delle vescicole per il rilascio di neurotrasmettitori. Insieme, questi scienziati hanno ricevuto il premio Nobel nel 2013.

Nonostante l’ampiezza di queste scoperte, rimangono molti enigmi intriganti. Diamo un’occhiata ad alcune delle domande esplorate oggi.

Gli scienziati stanno iniziando a chiedersi come le funzioni dell’endocitosi e dell’esocitosi vadano oltre l’acquisizione e la secrezione di sostanze. Ad esempio, in che modo i neurotrasmettitori vengono continuamente rilasciati dalle vescicole che si fondono alla membrana cellulare senza una catastrofica espansione delle dimensioni delle cellule? Stanno cercando di identificare i segnali che inducono le cellule a internalizzare la membrana, al fine di compensare l’espansione e riciclare le risorse.

Un altro argomento interessante è: quali componenti compongono il sofisticato macchinario molecolare che guida questi processi? Ad esempio, la fagocitosi richiede grandi deformazioni della membrana per circondare gli agenti patogeni invasori. Gli scienziati stanno studiando come le proteine citoscheletriche come l’actina contribuiscono al drammatico rimodellamento della membrana.

Infine, poiché l’endocitosi aberrante e l’esocitosi possono causare gravi malattie, gli scienziati sono interessati a capire cosa causa questa disregolazione. Una delle proteine esaminate è la α-sinucleina, la cui secrezione dai neuroni è stata implicata nella morte progressiva dei neuroni vicini. Comprendere la sua esocitosi potrebbe fornire preziose informazioni sul trattamento delle malattie neurodegenerative come il Parkinson.

Ora che abbiamo considerato alcune delle domande chiave oggetto di indagine, vediamo quali strumenti sono disponibili per rispondere.

I ricercatori utilizzano un test di biotinilazione cellulare per tracciare l’endocitosi delle proteine di superficie cellulare. Questo processo comporta l’etichettatura di una proteina di superficie con biotina marcata fluorescentemente e quindi consente alla cellula di sottoporsi a endocitosi. Questo può essere seguito da un’analisi immunitaria, rivelando l’internalizzazione delle proteine.

Al fine di quantificare il riciclaggio delle vescicole neuronali, molti scienziati etichettano le cellule con molecole fluorescenti specifiche della membrana, come i coloranti FM. Questi coloranti si legano stabilmente al foglietto esterno e sono interiorizzati solo dall’endocitosi. Dopo la stimolazione sequenziale, vengono esocitosi. L’analisi del rilascio con un microscopio a fluorescenza consente una visione più approfondita dell’intero processo di riciclaggio.

Spesso, per manipolare e comprendere i contributi dei componenti che consentono l’esocitosi, gli scienziati impostano saggi di fusione. Due serie di vescicole con un contenuto di colorante fluorescente distinto vengono preparate e lasciate insieme. La fusione tra loro si traduce nella formazione di un nuovo prodotto, che può essere monitorato utilizzando un lettore di micropiasse.

Infine, sofisticati metodi di imaging, tra cui l’imaging a fluorescenza e l’imaging di cellule vive a fluorescenza, presentano ai ricercatori l’opportunità unica di immaginare strutture morfologiche ed eventi molecolari di endocitosi ed esocitosi.

Infine, diamo un’occhiata ad alcuni modi specifici in cui gli scienziati stanno implementando questi strumenti nei laboratori di oggi.

I biologi cellulari sono interessati a studiare come l’esocitosi aiuta a guarire le membrane danneggiate. Qui, i ricercatori hanno prima ferito le cellule in soluzione di coloranti FM facendo rotolare le perle di vetro su di esse. La successiva imaging a fluorescenza mostra che se il tasso di esocitosi è veloce, sigillerà rapidamente la membrana e impedirà alla FM di fuoriuscire nella cellula. Quando l’esocitosi è lenta, si traduce in un’estesa colorazione FM intracellulare.

I ricercatori possono utilizzare saggi di fusione per modellare il contributo di specifiche proteine di fusione. Qui, i ricercatori hanno espresso diverse proteine di membrana associate alle vescicole o “VAMP”, che sono proteine SNARE, sulla superficie di due pool di cellule. La fusione è stata quindi autorizzata a svolgersi e il risultato è stato quantificato utilizzando uno spettrometro. Utilizzando questa configurazione, gli scienziati sono stati in grado di confrontare le efficienze di fusione di più VAMP.

Infine, i ricercatori mirano a comprendere l’endocitosi del recettore della superficie cellulare in risposta a un farmaco. Qui, gli scienziati hanno trattato le cellule marcate fluorescentemente con un farmaco e hanno visualizzato l’endocitosi medicata dal recettore che si verifica in tempo reale utilizzando la microscopia time-lapse.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE all’endocitosi e all’esocitosi. In questo video, abbiamo esaminato i punti salienti storici a partire dalla scoperta della fagocitosi fino alla definizione dei meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori. Successivamente, abbiamo introdotto alcune domande chiave poste. Abbiamo anche esplorato importanti strategie di ricerca e discusso alcune delle loro attuali applicazioni. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

Endocytic and exocytic pathways are critical for cellular homeostasis, tissue function, and overall cell survival. Simply put, endocytosis is the process that a cell uses to take in molecules from the extracellular space by folding its membrane around it and forming a vesicle. Exocytosis is the reverse process, which uses vesicles to release substances to the extracellular space. These processes have been suggested to play a critical role in hormone secretion, membrane receptor internalization, pathogen engulfment, and neuronal communications.

Today, we’ll retrace some of the landmark discoveries in the field of endocytosis and exocytosis, highlight some of the unanswered questions, feature notable methods that are used today, and lastly, explore a few specific experiments performed to better understand these processes.

Let’s revisit some of the momentous discoveries that led to the current understanding of endocytosis and exocytosis.

The first documentation related to endocytosis can be mapped back to 1882, when Ilya Metchnikov, using a light microscope, observed that specific cells engulfed invading pathogens. He called this process “phagocytosis,” where cells engulf pathogen via vesicle formation. Almost half a century later, in 1931, Warren Lewis observed a similar process of vesicle formation when cells took in fluid. He named this behavior “pinocytosis.”

Later in 1953, George Palade, while examining the structural and functional organization of the cell, discovered “cave-like” invaginations of the membranes, and called them caveolae. He inferred that these must be required for cell-intake. Soon after, in 1955, Nobel laureate Christian de Duve coined the term endocytosis, which encompassed “phagocytosis” and “pinocytosis.” However, the story of endocytosis wasn’t over yet.

In 1975, Michael Brown and Joseph Goldstein, with electron microscopy expert Richard Anderson, observed that when low density lipoprotein, or LDL, binds to its cell surface receptor, it leads to formation of “coated pits.” These pits are then internalized, and endocytose LDL receptors. This was the discovery of the third type, called “receptor-mediated endocytosis.” In the same year, Barbara Pearse isolated the major coat protein, a triskelion molecule, and named it as clathrin. Therefore, this process is also called “clathrin-mediated endocytosis.”

That was all regarding endocytosis. Now let’s discuss how we learned about exocytosis. In 1980, Randy Schekman’s group generated yeast mutants that were secretion deficient, and revealed the presence of critical genes that coded for proteins necessary for exocytosis.

In 1993, James Rothman identified some of these proteins, and based on their chemical nature they were called SNAREs. In his seminal, “SNARE hypothesis,” he proposed that these helical structures hook on to each other, causing membranes to come closer with sufficient force to fuse and generate exocytosis.

Around the same time, Thomas Südhof established that this process was also tightly controlled in neurons by calcium-sensing proteins called synaptotagmins that fostered and accurately timed vesicle fusion for neurotransmitter release. Together, these scientists were awarded the Nobel Prize in 2013.

Despite the breadth of these discoveries, many intriguing puzzles remain. Let’s take a look at some of the questions being explored today.

Scientists are starting to ask how the functions of endocytosis and exocytosis go beyond acquiring and secreting substances. For example, how are neurotransmitters continuously released by vesicles fusing to the cell membrane without a catastrophic expansion of cell size? They are trying to identify signals that cause cells to internalize membrane, in order to offset the expansion and recycle resources.

Another interesting topic is: what components make up the sophisticated molecular machinery that drives these processes? For example, phagocytosis necessitates large membrane deformations to surround invading pathogens. Scientists are investigating how cytoskeletal proteins like actin contribute to dramatic membrane remodeling.

Lastly, since aberrant endocytosis and exocytosis can result in serious diseases, scientists are interested in understanding what causes this dysregulation. One of the proteins being scrutinized is α-synuclein, whose secretion from neurons has been implicated in the progressive death of nearby neurons. Understanding its exocytosis could provide valuable insights on the treatment of neurodegenerative diseases like Parkinson’s.

Now that we’ve considered some of the key questions being investigated, let’s see what tools are available to answer them.

Researchers use a cell biotinylation assay to track endocytosis of cell surface proteins. This process involves labeling a surface protein with fluorescently tagged biotin, and then allowing the cell to undergo endocytosis. This can be followed by immune blot analysis, revealing protein internalization.

In order to quantify neuronal vesicle recycling, many scientists label cells with membrane-specific fluorescent molecules, like FM dyes. These dyes bind stably to the outer leaflet, and are only internalized by endocytosis. Following sequential stimulation, they are exocytosed. Analyzing release with a fluorescence microscope allows deeper insight into the whole recycling process.

Often, to manipulate and understand the contributions of components that allow exocytosis, scientists set up fusion assays. Two sets of vesicles with distinct fluorescent dye contents are prepared and allowed to come together. Fusion between them results in formation of a new product, which can be monitored using a microplate reader.

Lastly, sophisticated imaging methods, including fluorescence imaging and fluorescence live cell imaging, present researchers with the unique opportunity to image morphological structures and molecular events of endocytosis and exocytosis.

Finally, let’s look at some specific ways in which scientists are implementing these tools in labs today.

Cell biologists are interested in studying how exocytosis helps heal injured membranes. Here, researchers first injured cells in solution of FM dyes by rolling glass beads over them. Subsequent fluorescence imaging shows that if the rate of exocytosis is fast, it will quickly seal up the membrane and stop FM leaking into the cell. When exocytosis is slow, it results in extensive intracellular FM staining.

Researchers can use fusion assays to model the contribution of specific fusion proteins. Here, researchers expressed different vesicle-associated membrane proteins or “VAMPs,” which are SNARE proteins, on the surface of two pools of cells. The fusion was then allowed to take place, and the result was quantified using a spectrometer. Using this setup, scientists were able to compare the fusion efficiencies of multiple VAMPs.

Lastly, researchers are aiming to understand cell surface receptor endocytosis in response to a drug. Here, scientists treated fluorescently tagged cells with a drug, and visualized receptor medicated endocytosis happening in real time using time-lapse microscopy.

You’ve just watched JoVE’s introduction to endocytosis and exocytosis. In this video, we reviewed the historical highlights starting from the discovery of phagocytosis to defining the mechanisms of neurotransmitter release. Next, we introduced a few key questions being asked. We also explored prominent research strategies, and discussed some of their current applications. As always, thanks for watching!

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