Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare la composizione chimica del respiro espirato utilizzando la ionizzazione nanoelectrospray secondaria accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo medico come la diagnosi precoce delle malattie, il monitoraggio dei controlli terapeutici e l'esposizione ambientale. Il vantaggio principale della tecnica è che la misurazione può essere eseguita in tempo reale.

La tecnica è anche la più alta potenza, sensibile, specifica e facile da usare. Le implicazioni di questa tecnica sono state estese alla diagnosi del cancro del polmone. Perché la possibilità di candidati biomarcatori è stata trovata nel respiro espirato di pazienti con cancro polmonare in diverse fasi.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la fonte di ionizzazione è comunemente co-prodotta. La dimostrazione visiva è fondamentale, poiché non esiste ancora un protocollo standard per questo metodo. Per iniziare, impostare una sorgente nano ESI secondaria secondo il processo di ionizzazione elettrosparica secondaria in cui il gas respiratorio viene introdotto per intersecare un pennacchio di elettrospray e ionizzato dalle goccioline cariche.

Le sorgenti per i singoli laboratori dipendono dallo spettrometro di massa utilizzato. Qui, la sorgente nano ESI secondaria si basa sulla sorgente commerciale nano ESI. E l'ho attaccato a uno spettrometro di massa a trappola orbitale a caduta di un quarto di tiro da banco.

Il corpo principale della sorgente è una camera cubica in acciaio inossidabile con un ingresso per introdurre il capillare nano ESI nella camera. Due tubi in acciaio inox sono installati su ciascun lato della camera per l'erogazione del gas. Due finestre di quarzo sono dotate sulla parte superiore e inferiore della camera per controllare la posizione della punta del nano ESI capillare e del nano ESI spray sia con gli occhi che con un microscopio digitale.

Infine, la camera viene saldata al cono di spazzamento dello spettrometro di massa. Si noti che il design può cambiare a seconda della particolare geometria dell'interfaccia della pressione atmosferica dello spettrometro di massa utilizzato nei singoli laboratori. Calibrare lo spettrometro di massa in entrambe le modalità di rilevamento di ioni positivi e negativi secondo le istruzioni del produttore.

Applicando la calibrazione, i parametri dello spettrometro di massa, come i potenziali delle lenti e le condizioni di rilevamento, vengono ottimizzati per fornire una buona sensibilità e forma del picco a un valore di risoluzione specificato. Eseguire calibrazioni complete utilizzando la sorgente ESI commerciale. Qui viene utilizzata la risoluzione di massa di 70.000.

La calibrazione della massa può essere eseguita con qualsiasi sorgente compatibile, comprese quelle personalizzate. Impostare la temperatura del tubo di trasferimento ionico dello spettrometro di massa su un valore superiore a 100 gradi Celsius. Sebbene la temperatura massima possa essere impostata a 350 gradi Celsius, può provocare la decomposizione di alcuni composti.

Per il solvente ESI e la portata, selezionare il solvente ESI appropriato sulla base delle proprietà del solvente e dei composti mirati. In questo esperimento utilizzare acqua contenente lo 0,1% di acido formico, per un'elevata efficienza di ionizzazione. Impostare la portata del solvente ESI nell'intervallo da 0 1,5 microlitri al minuto, a 200 nanolitri al minuto.

Ottimizza i parametri della sorgente nano ESI secondaria, principalmente la tensione nano ESI e la posizione della punta capillare nano ESI. La tensione varia comunemente da 2,0 a 4,5 kilovolt. Usa 2,5 kilovolt qui.

Applicare gas puro alla fonte per ridurre l'influenza dei composti organici volatili o COV dall'aria interna. Qui viene utilizzato azoto ad alta purezza e fornito a 0,8 litri al minuto. Con la presenza di gas puro, il livello di intensità normalizzato osservato in uno spettro di massa dovrebbe essere maggiore di 1 x 10 al 5° e la variazione del TIC dovrebbe essere inferiore al 10% sia in modalità di rilevamento di ioni positivi che negativi.

Quando si esegue la misurazione, inalare l'aria interna ed eseguire un'espirazione normale per espirare tutta l'aria nei polmoni a una velocità di flusso costante. Monitorare la portata dell'espirazione tramite un manometro o un flussometro visibile al soggetto. Collegare l'ingresso del flussometro al tubo nafion per rimuovere il vapore acqueo nel respiro espirato.

Quindi, collegare l'uscita del flussometro al tubo in PTFE per erogare il gas di respirazione. In questo esperimento, il soggetto ha espirato a 0,4 litri al minuto, come controllato da un flussometro. Ci vogliono meno di 30 secondi per una misurazione dell'espirazione.

Esegui da quattro a sei misurazioni replicate. Per ridurre al minimo gli effetti confondenti, chiedi ai partecipanti di astenersi dal mangiare, bere e lavarsi i denti almeno 30 minuti prima delle misurazioni. Durante la misurazione, continuare a controllare se l'intensità del ferro supera o meno il limite di rilevamento lineare dello strumento.

La saturazione del segnale può portare a un picco di artefatti che non deriva da un composto nel campione. Inalando attraverso il naso, una parte dei COV e delle particelle ambientali verrebbe rimossa. Tuttavia, è interessante notare che possono essere rilevati anche composti nei passaggi nasali.

Utilizzare il software per registrare cromatogrammi e spettri di massa. Poiché si tratta di un'analisi MS diretta e non viene eseguita alcuna separazione cromatografica, il TIC indica effettivamente la traccia temporale di tutti i segnali rilevati negli spettri di massa. E l'EIC mostra una traccia temporale di un composto specificato.

Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi delle misurazioni del respiro espirato in tempo reale. La traccia temporale dell'endol, un tipico composto endogeno, mostra sei misurazioni replicate in meno di sette minuti. Per tutte le misurazioni, sono state ottenute impronte digitali del respiro sottratte dallo sfondo riproducibili in modalità di rilevamento di ioni positivi.

Sono stati osservati 291 composti. I composti sono molto probabilmente aldeidi, chetoni e alchini. Nel caso delle impronte digitali del respiro in modalità di rilevamento degli ioni negativi, vengono presentati 173 composti e derivano principalmente dagli acidi grassi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare una sorgente CESI fatta in casa ed eseguire l'analisi del processo in tempo reale. Una volta padroneggiata, la misurazione può essere eseguita in pochi minuti. Se viene eseguito correttamente.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di evitare l'interferenza dei composti dal tubo di campionamento e dall'aria endo. Sapere che questa misura può fornire informazioni sul respiro espirato umano e può anche essere applicata ad altri sistemi come l'alchilizzazione modello, i modelli ionici e nei sistemi retrocellulari. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre misure come GCMS, HPRCMS, per rispondere a ulteriori domande, come la conferma fotografica, la quantità di analisi.

Dopo il suo sviluppo, la tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina per esplorare con questa diagnosi, gli effetti del trattamento nei pazienti.