Name: Analisi dellespirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri l'analisi in tempo reale dell'espirato mediante ionizzazione secondaria nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo non invasivo consente la diagnosi precoce del cancro ai polmoni e il monitoraggio terapeutico.

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Quest'opera è stata sostenuta finanziariamente dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (No. 91543117).

Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Si prega di utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale, ad esempio, camice, guanti, occhiali, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse).
1. impostare l'origine di Sec-nanoESI
<ol><li>Impostare un'origine Sec-nanoESI secondo il processo SESI, vale a dire, il gas di respiro è introdotto per intersecare un pennacchio di electrospray e ionizzato dalle goccioline cariche (Figura 1). Le fonti costruite nei laboratori individuali dipendono dall'interfaccia di spettrometro di massa utilizzato24,25. Qui, impostare l'origine di Sec-nanoESI basato su un'origine commerciale nanoESI (Figura 2) e implementare ad uno spettrometro di massa di benchtop quadrupolo orbitrap. Nota: Il corpo principale della fonte è un alloggiamento in acciaio inox cubico (lunghezza 25 mm, I.D. 13 mm) (Figura 2b) con un ingresso (I.D. 4 mm) per introdurre il capillare di nanoESI nella camera. Così, la camera non è completamente sigillato (Figura 2b).</li>
	<li>Installare due tubi di acciaio (lunghezza 8 mm, diametro esterno 5 mm, I.D. 3 mm) su ciascun lato dell'alloggiamento per erogazione di gas.</li>
	<li>Equipaggiare due finestre di quarzo (I.D. 14 mm) sulla parte superiore e inferiore della camera per controllare la posizione della punta del nanoESI capillare e spray nanoESI occhi o un microscopio digitale.</li>
	<li>Saldare la camera al cono sweep di spettrometro di massa. Nota: Il design può cambiare a seconda della particolare geometria dell'interfaccia pressione atmosferica dello spettrometro utilizzato nei singoli laboratori.</li>
</ol>2. ottimizzazione strumento
<ol><li>Calibrare lo spettrometro di massa in entrambi modi di rilevazione di ioni positivi e negativi secondo le istruzioni del produttore. Mediante l'applicazione di calibrazione, i parametri di spettrometro di massa, quali potenziali di lente e le condizioni di rilevamento, sono ottimizzati per dare buona sensibilità e forma di picco ad un valore di risoluzione specificata. La risoluzione di massa di 70000 è usata qui.<ol>
<li>Realizzi le calibrature Q Exactive complete utilizzando la fonte commerciale di ESI; Tuttavia, la massa calibrazione può essere effettuata con qualsiasi fonte compatibile, tra cui quelli su misura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare la temperatura del tubo di trasferimento dello ione (ITT) lo spettrometro di massa > 100 ° c. Anche se il più alta temperatura può essere impostata a 350 ° C, può provocare la decomposizione di alcuni composti. Così, 150° C viene utilizzato in questo esperimento. Nota: Per gli spettrometri di massa con un orifizio di campionamento invece di ITT, la temperatura dell'orifizio del campionamento è impostata > 100 ° C.</li>
	<li>Per il tasso di solvente e la portata ESI, selezionare l'appropriato solvente ESI in base alle proprietà di solvente (ad es., polarità e volatilità) e di composti mirati (ad es., affinità protonica). Una miscela di acqua e metanolo in vari rapporti è stato comunemente utilizzata come solvente ESI25. In questo esperimento, utilizzare acqua contenente acido formico 0.1% (v/v), per efficienza di ionizzazione alta è stato segnalato questo solvente13,19,23. Impostare la portata del solvente ESI nella gamma di 0-1.5 μL/min e 200 nL/min. Nota: Degas ESI solvente per 30 min prima dell'uso.</li>
	<li>Ottimizzare i parametri di sorgente di Sec-nanoESI, principalmente nanoESI tensione e posizione della punta capillare nanoESI. La tensione varia comunemente da 2.0 a 4.5 kV. Uso 2.5 kV qui. Nota: Più alta tensione di ESI è applicato come gli aumenti di tasso di flusso. La distanza tra la punta e l'orifizio di spettrometro di massa può essere regolata da 1 a 5 mm. Dopo l'ottimizzazione, il livello di intensità normalizzata (NL) osservato in uno spettro di massa deve essere > 1 x 106 e la variazione del cromatogramma ionica totale (TIC) dovrebbe essere < 10% in entrambe le modalità di rilevamento ioni positivi e negativi. Lo spettro di massa e le TIC vengono ottenuti nella gamma massa di m/z 50-750.</li>
	<li>Applicare il gas puro all'origine. Si tratta di un passaggio facoltativo, al fine di ridurre l'influenza di COV da aria interna. Gas di elevata purezza dell'azoto (N2, 99,99%) o aria pura può essere utilizzato. Con la presenza di gas puro, NL osservate in uno spettro di massa deve essere > 1 x 105 e la variazione di TIC dovrebbe essere < 10% in entrambe le modalità di rilevamento ioni positivi e negativi. Elevata purezza N2 è usato qui e consegnato a 0,8 L/min. Nota: La portata totale di gas puro e respiro gas deve essere superiore al tasso di flusso attraverso l'orifizio dello spettrometro.</li>
</ol>3. misurazione di respiro esalato
<ol><li>Inalare l'aria interna ed eseguire un'espirazione normale espirare tutta l'aria nei polmoni ad una portata costante. Monitorare il tasso di flusso di espirazione da un manometro o un misuratore di flusso visibile al soggetto. Utilizzare la tubazione del Teflon (PTFE) per consegnare il respiro gas23.<ol>
<li>Per evitare la condensazione del vapore acqueo all'interno delle tubazioni, riscaldare il tubo ad una temperatura di 80-100 oC7,23,27 o usare un Nafion essiccatore28,29. In questo esperimento, il soggetto espirata a 0,4 L/min controllato da un misuratore di portata.</li>
		<li>Collegare l'ingresso del misuratore di portata ad una tubazione di Nafion (lunghezza 60 cm) per rimuovere il vapore acqueo in respiro esalato e collegare l'uscita del contalitri ad una tubazione di PTFE (lunghezza 13 cm, I.D. 4 mm). Si impiegano < 30 s per una misurazione di espirazione.</li>
		<li>Eseguire 4-6 misure replicate28,29.</li>
		<li>Per ridurre al minimo gli effetti confondenti, avere partecipanti da mangiare, bere e lavarsi i denti almeno 30 min prima le misure23. Nota: Per ridurre al minimo l'influenza di COV da aria interna, è stato segnalato per inalare gas puro invece di aria interna26. Quando viene utilizzato un tubo di Nafion, potrebbero perdersi alcune composti polari.</li>
		<li>Durante la misurazione, mantenere il controllo se l'intensità dello ione supera il limite di rilevamento lineare dello strumento o non. La saturazione del segnale può portare a un picco di artefatto che non comporta praticamente dal composto nel campione. Inalando attraverso il naso, parte di ambiente COV e particelle sarebbe stato rimosso; Tuttavia, è degno di nota che possono essere rilevati anche composti nei passaggi nasali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ottenere un'impronta di respiro e una traccia di tempo di un composto
<ol><li>Ottenere cromatogrammi e spettri di massa. Utilizzare software (ad es., Xcalibur) per registrare cromatogrammi e spettri di massa. Perché si tratta di analisi diretta di MS e nessuna separazione cromatografica viene eseguita, il cromatogramma ionica totale (TIC) indica in realtà la traccia del tempo di tutti i segnali rilevati negli spettri di massa e il cromatogramma di ioni estratti (EIC) Mostra la traccia del tempo di un composto specificato. Nota: Per altri spettrometri di massa commerciali, i cromatogrammi e spettri di massa possono essere ottenuti con il corrispondente software di acquisizione dati.</li>
	<li>Ottenere un'impronta di respiro esalato selezionando un numero di scansioni nel TIC quando respiro esalato è misurato. Ottenere uno spettro di massa che rappresenta una media di queste scansioni dal software.<ol>
<li>Per eliminare i picchi di sfondo dall'impronta di respiro, è possibile utilizzare lo strumento di sottrarre sfondo nel software. Consultare la Guida utente fornita dal produttore. In breve, selezionare lo stesso numero di scansioni, quando non è stato introdotto nessun campione di respiro e sottrarre lo spettro di massa di sfondo dall'impronta di respiro. Nota: In questo metodo, la soglia per identificare le caratteristiche nell'impronta digitale respiro è definita come tre volte la deviazione standard del segnale sfondo. Per altri spettrometri di massa commerciali, sottrazione di sfondo può essere eseguita tramite il software di acquisizione di dati corrispondente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ottenere una traccia di tempo di un composto specificato. Selezionare il picco di un composto mirato nell'impronta di respiro e il tempo traccia del composto viene acquisito successivamente dal software.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Costruire la fonte di Sec-nanoESI basata su un'origine commerciale nanoESI, l'efficienza di ionizzazione è superiore a quello dell'utilizzo di un' origine ESI30. Inoltre, l'efficienza di ionizzazione è ulteriormente migliorata in una camera chiusa, come si isola il processo dall'aria sfondo dell'ambiente e allo stesso tempo facilita la miscelazione tra il campione di gas e il pennacchio di spruzzo. Utilizzando un Sec-nanoESI, meno i parametri devono essere ottimizzati rispetto ad una sorgente ESI,...

Con il rapido sviluppo di moderne tecniche analitiche, centinaia di composti organici volatili (COV) è state identificate nel condensato del respiro umano1. Questi COV derivano principalmente da aria alveolare (~ 350 mL per un adulto sano) e spazio morto anatomico aria (~ 150 mL)2, che sono influenzati da corpo metabolismo3,4,5,6,7 ,8 e inquinamento ambientale9, rispettivamente. Di conseguenza, se identificato, questi composti organici volatili sono promettenti per essere utilizzate come biomarcatori per la diagnosi di malattia e l'esposizione ambientale in modo non invasivo.
Anche se la gas cromatografia spettrometria di massa (GC-MS) è la tecnica più ampiamente usata per l'analisi qualitativa e quantitativa di espirata COV2, tecniche dirette di MS, che sono stati sviluppati per l'analisi in tempo reale respiro, presentano i vantaggi di elevata risoluzione temporale e pre-preparazione semplice del campione. Tecniche dirette di MS, come reazione di trasferimento di protone (PTR-MS) MS10, selezionato tubo di flusso dello ione MS (SIFT-MS)11, (anche denominato come electrospray estrattive secondaria electrospray ionizzazione MS (SESI-MS)12,13 ionizzazione MS, EESI-MS14,15), traccia gas atmosferico analyzer (TAGA)16 e plasma ionizzazione MS (PI-MS)17 sono stati studiati anni recenti.
Tra tutte le tecniche di MS dirette, SESI è ben noto come un'ionizzazione morbida universale tecnica19,20,21; e la fonte è facile da essere personalizzati e accoppiato a diversi tipi di spettrometri di massa, ad esempio, il tempo di volo spettrometro di massa8,15, presa dello ione di massa spettrometro14 e orbitrap spettrometro di massa12 ,18. Fino ad ora, SESI-MS è usato con successo nella diagnosi di malattie respiratorie22, ritmo circadiano3,6,23, farmacocinetica7,8, di misura e rivelando le vie metaboliche4, ecc. Più recentemente, una fonte commerciale di SESI è diventato disponibile.
In questo studio, una sorgente di ionizzazione facile e compatto nanoelectrospray secondario (Sec-nanoESI) è stata istituita e accoppiata ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. Misurazioni in tempo reale di COV nell'aria espirata in respiro sono stati presentati.

<table><tbody><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Merck Millipore, USA</td><td>MPGP04001</td><td>Resistenza >18.2 M&Omega; &punto medio; cm</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>F0507</td><td>Corrosivo per le vie respiratorie.</td></tr><tr><td>Azoto gassoso</td><td>Guangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., Cina</td><td>N.A.a</td><td>Purezza >99,99%</td></tr><tr><td>Q Spettrometro di massa ibrido quadrupolo-orbitrap esattivo</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>02634L(S/N)</td><td>Attenzione all'alta tensione e all'alta temperatura</td></tr><tr><td>Fonte NanoESI</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>ES002373(S/N); ES071 (P / N)</td> <td>Attenzione all'alta tensione e all'alta temperatura</td></tr><tr><td>Pompa Nano LC</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>5041.0010A (P / N)</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Software Xcalibur (versione 3.0)</td> <td>Thermo Scientific, USA</td><td>BRE0008596</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Dino-Lite Digital Microscope</td><td>Tech Video System (SuZhou) Co.Ltd., Cina</td><td>CQ401833R (S / N)</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Nafion tubing</td><td>Perma Pure LLC, USA</td><td>ME60</td> <td>/ </td></tr><tr><td>Tubo in PTFE (ID 4 mm)</td><td>Dongguan Hongfu Insulation Material Co., Ltd., Cina</td><td>N.A.</td><td>Attenzione alla possibile perdita di composti polari</td></tr><tr><td>Regolatore di flusso di massa</td><td>Line-Tech, Corea</td><td>M15122007 (S / N)</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Misuratore di portata</td><td>Yuyao Industrial Automation Meter Factory, Cina</td><td>40784</td> <td>/</td></tr> <tr><td>aNA: non disponibile.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Espirata composti organici volatili (COV) hanno suscitato notevole interesse, dal momento che possono servire come biomarcatori per la diagnosi della malattia e l'esposizione ambientale in modo non invasivo. In questo lavoro, vi presentiamo un protocollo per caratterizzare i COV espirati in tempo reale tramite ionizzazione secondaria nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (Sec-nanoESI-HRMS). L'origine di Sec-nanoESI fatti in casa è stato prontamente istituito basata su un'origine commerciale nanoESI. Centinaia di picchi sono stati osservati negli spettri di massa sottratta a sfondo di respiro esalato, e i valori di accuratezza di massa sono -4,0-13,5 ppm e -20,3-1,3 ppm in modalità di rilevamento di ioni positivi e negativi, rispettivamente. I picchi sono stati assegnati con accurata composizione elementare secondo il modello isotopico e massa accurata. Meno di 30 s è utilizzata per la misurazione di una espirazione, e si impiegano circa 7 minuti per sei misurazioni replicate.

La figura 3 Mostra le impronte di respiro nella gamma massa di m/z 50-750 iscritti tra le due modalità di rilevamento di ioni positivi e negativi. 291 picchi (intensità di picco &gt; 5.0 X104) e 173 picchi (intensità di picco &gt; 3.0x104) sono stati osservati in impronte digitali respiro sottratto di sfondo in modalità di rilevamento di ioni positivi e negativi, rispettivamente. Per identificare picchi negli spettri di massa, f...

Un protocollo per la caratterizzazione di composizione chimica di respiro esalato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria nanoelectrospray accoppiato ad alta risoluzione in spettrometria di massa è dimostrata.

Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare la composizione chimica del respiro espirato utilizzando la ionizzazione nanoelectrospray secondaria accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo medico come la diagnosi precoce delle malattie, il monitoraggio dei controlli terapeutici e l'esposizione ambientale. Il vantaggio principale della tecnica è che la misurazione può essere eseguita in tempo reale.La tecnica è anche la più alta potenza, sensibile, specifica e facile da usare. Le implicazioni di questa tecnica sono state estese alla diagnosi del cancro del polmone. Perché la possibilità di candidati biomarcatori è stata trovata nel respiro espirato di pazienti con cancro polmonare in diverse fasi.In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la fonte di ionizzazione è comunemente co-prodotta. La dimostrazione visiva è fondamentale, poiché non esiste ancora un protocollo standard per questo metodo. Per iniziare, impostare una sorgente nano ESI secondaria secondo il processo di ionizzazione elettrosparica secondaria in cui il gas respiratorio v

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Ionizzazione ablazione laser elettrospray (LAESI) è una pressione atmosferica sorgente di ioni per la spettrometria di massa. Nella modalità di imaging, un medio infrarosso sonde laser le distribuzioni delle molecole attraverso una sezione di tessuto o di un biofilm. Questa tecnica presenta un nuovo approccio per diversi studi bioanalitici effettuata sotto natale condizioni sperimentali.

Pressione atmosferica Imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm da LAESI Spettrometria di Massa

Analisi di singola cellula viene effettuata mediante spettrometria di massa su cellule animali e vegetali a pressione atmosferica, utilizzando una fibra ottica affilato per assaggiare le cellule per la ionizzazione elettrospray ablazione laser (LAESI) spettrometria di massa.

Analisi diretta di singole cellule mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica

Secondaria elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (SESI-MS) permette la rilevazione di composti organici volatili (COV) senza la necessità di alcun pre-trattamento del campione. Questo protocollo fornisce le istruzioni per il rapido (pochi minuti) caratterizzazione di COV batterica utilizzando SESI-MS.

Volatili che caratterizzano batterica secondaria utilizzando Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (SESI-MS)

Considerando campionamento saliva per il futuro l'applicazione clinica, un lecca-lecca-like ultrafiltrazione (LLUF) la sonda è stato fabbricato per adattarsi nella cavità orale nell'uomo. L'analisi diretta di saliva non digerito da nanoLC LTQ-spettrometria di massa ha dimostrato la capacità di sonde LLUF per rimuovere le proteine ​​di grandi dimensioni e di proteine ​​ad alta abbondanza, e rendere a basso abbondanti peptidi più rilevabile.

Campionamento umana peptidoma Indigenous Saliva Utilizzando un Lollipop-Like Probe ultrafiltrazione: Semplificare e migliorare la rilevazione Peptide per spettrometria di massa Clinica

L'ammoniaca è un importante metabolita fisiologico rilevante per vari stati di malattia e benessere. È anche una molecola difficile da misurare nel respiro, che richiede l'adozione di particolari precauzioni per ottenere risultati accurati. Non tutti i fattori che influenzano l'ammoniaca sono noti, ma il progresso può essere difficile senza tenere conto di questi fattori.

Veloce e preciso espirata Ammoniaca misura

La spettrometria di massa consente un'analisi ad alta sensibilità, rapida e non invasiva dei composti organici volatili. Per dimostrare il suo potenziale, forniamo tre esempi: fermentazione dell'acido lattico dello yogurt (monitoraggio on-line del bioprocesso), diversi genotipi di mela (screening su larga scala) e spazio retronasale dopo aver bevuto caffè (analisi dello spazio nasale).

PTR-ToF-MS accoppiato con un sistema di campionamento automatizzato e analisi dei dati su misura per gli studi alimentari: monitoraggio del bioprocesso, screening e analisi dello spazio del naso

Un metodo per l'identificazione delle specie di materiale botanico mediante l'analisi diretta nel settore della spettrometria di massa risoluzione tempo-alta e l'analisi statistica multivariata è presentato.

Rapid high-throughput Specie Identificazione del materiale botanico Utilizzando l&#39;analisi diretta in tempo reale ad alta risoluzione Spettrometria di Massa

Spettrometria di massa di foglia spray è una tecnica di analisi chimica diretta che riduce al minimo la preparazione del campione ed Elimina cromatografia, consentendo per la rilevazione rapida di piccole molecole da tessuti vegetali.

Spettrometria di massa di foglia Spray: Una tecnica di ionizzazione ambiente rapido per valutare direttamente metaboliti dai tessuti vegetali

Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'acquisizione di campioni di aria espirata da bambini. Brevemente, campioni di aria mista pre-sono concentrati in tubi sorbente prima dell'analisi gas cromatografia spettrometria di massa. Biomarcatori di respiro delle malattie infettive e non infettive possono essere identificati usando questo metodo di raccolta di respiro.

Collezione di respiro dai bambini per la scoperta di Biomarker di malattia

Questo articolo introduce metodi di preparazione di esempio per un metodo analitico unico in tempo reale basato sulla spettrometria di massa ambientale. Questo metodo ci permette di eseguire analisi in tempo reale delle molecole biologiche in vivo senza particolari pretrattamenti.

Preparazione del campione per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray sonda

Scopri l'analisi in tempo reale dell'espirato mediante ionizzazione secondaria nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo non invasivo consente la diagnosi precoce del cancro ai polmoni e il monitoraggio terapeutico.

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Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

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