Saggio di biotinilazione delle proteine di membrana

L'etichettatura delle proteine di superficie cellulare con biotina rappresenta un potente strumento per studiare le vie di trasporto cellulare coinvolte nella regolazione delle proteine di membrana. Una cellula mantiene un insieme strettamente regolato di proteine in superficie, in modo che possa ricevere e rispondere alle informazioni extracellulari attraverso diverse vie di segnalazione. Si suggerisce che l'endocitosi, un processo di inghiottimento, sia coinvolta nella regolazione di queste proteine di superficie cellulare causando la loro internalizzazione. Pertanto, etichettare queste proteine prima che siano endocitosizzate con agenti come la biotina aiuta gli scienziati a quantificare la loro internalizzazione e studiare i loro ruoli nei percorsi cellulari.

In questo video, discuteremo i principi e la metodologia dei saggi di biotinilazione della superficie cellulare ed esploreremo alcuni modi in cui gli scienziati stanno adattando questo metodo oggi.

Esaminiamo prima i principi alla base del test di biotinilazione della superficie cellulare.

Come accennato in precedenza, le cellule utilizzano le vie endocitiche per regolare la densità spaziotemporale e la distribuzione delle proteine di superficie. Le proteine internalizzate vengono trasportate attraverso specifici percorsi cellulari, in seguito ai quali possono essere deviate verso il lisosoma per la degradazione o riciclate sulla superficie cellulare per un'attività continua. La biotinilazione cellula-superficie è progettata per misurare questi processi.

Il tag utilizzato in questo test, la biotina, nota anche come vitamina H, è una piccola molecola solubile in acqua. Un derivato comunemente usato della biotina per esperimenti di etichettatura superficiale è il sulfo-NHS-SS-biotina, che consiste nel gruppo sulfo, nel gruppo estere N-idrossi succinimide, nel legame disolfuro e, naturalmente, nella biotina. Semplifichiamo questa enorme struttura sostituendo la biotina con la lettera "B".

Il gruppo sulfo in questa struttura conferisce una forte carica che rende questa forma di membrana di biotina impermeabile. L'etichettatura delle proteine di superficie cellulare viene effettuata aggiungendo sulfo-NHS-SS-biotina alle cellule mantenute a una temperatura restrittiva per l'endocitosi. Il gruppo NHS reagisce con le ammine primarie sulle proteine di superficie, formando legami covalenti.

Quindi, le cellule etichettate vengono spostate a una temperatura permissiva all'endocitosi, durante la quale alcune delle proteine etichettate saranno internalizzate. Infine, le cellule vengono riportate alla temperatura restrittiva per fermare l'endocitosi. Al fine di quantificare specificamente le proteine internalizzate, viene aggiunto un agente riducente idrofilo e impermeabile alla membrana, come il L-glutatione. Ciò reagirà con i legami disolfuro sulla biotina sulfo-NHS-SS non echerà i gruppi di biotina non esenterà i gruppi di biotina. A questo punto, le restanti proteine biotinilate sono quelle le cui etichette sono state protette dall'agente riducente perché precedentemente interiorizzate.

Le cellule vengono quindi lizzate e le proteine biotinilate endocitosizzate vengono isolate per essere quantificate. L'isolamento viene solitamente eseguito aggiungendo l'aggiunta di lasati cellulari a pere sintetiche rivestite con streptavitina. Poiché la streptavitina ha un'affinità estremamente elevata per la biotina, le proteine biotinilate si attaccano alle perle rivestite. Una serie di passaggi di lavaggio per rimuovere le proteine contaminanti e, infine, una fase di eluizione, viene eseguita per rilasciare le proteine legate. Le proteine bersaglio possono quindi essere analizzate con tecniche come il Western blotting.

Poiché ora conosci i concetti alla base del test di biotinilazione, diamo un'occhiata a un protocollo generalizzato che mostra come eseguire questa procedura per misurare l'endocitosi delle proteine di superficie.

Iniziare con cellule coltivate raffreddate a 4°C. Mettili sul ghiaccio per mantenere la temperatura che è restrittiva per l'endocitosi. Successivamente, viene aggiunto il reagente impermeabile alla membrana sulfo-NHS-SS-biotina e le cellule vengono incubate al buio per circa 30 minuti. Ciò consente un tempo sufficiente affinché le etichette della biotina si attacchino covalentemente alle proteine di superficie. Le cellule vengono quindi rimosse dal ghiaccio e incubate a 37 ° C per circa 30 minuti. A questa temperatura, le proteine di superficie biotinilate vengono endocitose. Dopo l'incubazione, le cellule vengono raffreddate a 4 ° C e viene aggiunto un agente riducente idrofilo come L-glutatione. Questo reagisce con i legami disolfuro e rilascia i gruppi di biotina da proteine etichettate e non andocitizzate.

Successivamente, le cellule vengono lizzate mediante centrifugazione, rompendo così le membrane cellulari ed esponendo proteine biotinilate. Successivamente, i lasati vengono aggiunti alle perle rivestite di streptavicina e le proteine biotinilate possono legarsi. Le perline vengono lavate con soluzione salina tamponata con fosfato freddo ed eluite con un tampone contenente detergenti e agenti riducenti. Questi reagenti denaturano le proteine legate alle perle e consentono il loro recupero nell'eluato. Le proteine nell'eluato vengono separate sulla base della loro massa molecolare mediante elettroforesi su gel. Infine, il western blotting e il sondaggio della macchia con anticorpi specifici della proteina consentono la visualizzazione della proteina bersaglio. La percentuale di proteine endocitose può essere quantificata dalle densità di banda risultanti.

Ora che hai capito la metodologia della biotinilazione cellulare, diamo un'occhiata a come viene utilizzata in esperimenti specifici.

L'applicazione più comune di questo protocollo di biotinilazione è quella di misurare il tasso endocitico di specifiche proteine di superficie cellulare. Qui, gli scienziati erano interessati a valutare l'internalizzazione del trasportatore della dopamina o DAT. Seguendo il protocollo standard, gli scienziati sono stati in grado di misurare la percentuale di DAT endocitosi. Questo è un immunoblot rappresentativo che mostra la corsia T, corrispondente alla quantità "totale" di proteine prima dell'internalizzazione, la corsia S è per i campioni "spogliati" in cui alle cellule non è mai stato permesso di procedere attraverso l'endocitosi ma trattate con agente riducente, e la corsia I rappresenta i risultati delle proteine "internalizzate".

Oltre a misurare solo l'endocitosi delle proteine di superficie, gli scienziati esaminano anche gli effetti dei farmaci su questo processo. In questo studio, i ricercatori hanno valutato la densità superficiale dei DAT in risposta al trattamento con un attivatore della proteina chinasi C (PKC), la cui azione è stata suggerita per indurre l'internalizzazione del DAT. Gli scienziati lo hanno confermato adattando il protocollo di biotinilazione in vitro per l'uso in un test ex vivo sul tessuto cerebrale del topo. I dati hanno rivelato una perdita di circa il 30% di DAT dalla membrana cellulare, in risposta all'attivazione della PKC.

Infine, modificando il test di biotinilazione, gli scienziati possono anche misurare il riciclaggio delle proteine di membrana. Qui, i ricercatori stavano studiando la proteina del canale superficiale, CFTR, responsabile della conduzione degli ioni cloruro. Per valutare il riciclaggio, i ricercatori hanno eseguito un protocollo di biotinilazione standard in un gruppo di cellule e hanno modificato il protocollo per il secondo gruppo di cellule aggiungendo passaggi dopo aver scisso la biotina dalle proteine di superficie non diattetizzate. Questi passaggi aggiuntivi includevano l'aumento della temperatura a 37 ° C per consentire il riciclaggio di alcune delle proteine del recettore internalizzate e marcate con biotina. Calcolando la differenza tra le proteine interiorizzate prima e dopo il riciclaggio, questi scienziati sono stati in grado di quantificare la percentuale di CFTR riciclata sulla membrana.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE al test di biotinilazione della superficie cellulare. Il video descriveva le fasi procedurali di questo test e spiegava la reazione che si verificava in ogni fase. Infine, abbiamo esplorato alcuni esperimenti di esempio che hanno dimostrato l'applicabilità di questo metodo. Come sempre, grazie per aver guardato!