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Saggio di biotinilazione delle proteine di membrana

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Cell Biology

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Cell-surface Biotinylation Assay

4.7: An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

4.9: FM Dyes in Vesicle Recycling

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09:13 min

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April 30, 2023

Overview

Una cellula può regolare la quantità di particolari proteine sulla sua membrana cellulare attraverso l’endocitosi, a seguito della quale le proteine della superficie cellulare vengono effettivamente sequestrate nel citoplasma. Una volta all’interno di una cellula, queste proteine di superficie possono essere distrutte o “riciclate” nella membrana. Il test di biotinilazione della superficie cellulare fornisce ai ricercatori un modo per studiare questi fenomeni. La tecnica fa uso di un derivato della piccola molecola biotina, che può etichettare le proteine di superficie e quindi essere scisso chimicamente. Tuttavia, se la proteina di superficie è endocitosa, il derivato della biotina sarà protetto dalla scissione. Pertanto, analizzando l’etichetta della biotina endocitosa e endocita, gli scienziati possono valutare la quantità di proteine di superficie interiorizzate.

In questo video, esaminiamo i concetti alla base del test di biotinilazione, approfondendo la struttura chimica del derivato della biotina e il meccanismo della sua scissione. Questo è seguito da un protocollo generalizzato della tecnica e, infine, una descrizione di come i ricercatori la stanno attualmente utilizzando per studiare le dinamiche delle diverse proteine di superficie cellulare.

Procedure

L’etichettatura delle proteine di superficie cellulare con biotina rappresenta un potente strumento per studiare le vie di trasporto cellulare coinvolte nella regolazione delle proteine di membrana. Una cellula mantiene un insieme strettamente regolato di proteine in superficie, in modo che possa ricevere e rispondere alle informazioni extracellulari attraverso diverse vie di segnalazione. Si suggerisce che l’endocitosi, un processo di inghiottimento, sia coinvolta nella regolazione di queste proteine di superficie cellulare causando la loro internalizzazione. Pertanto, etichettare queste proteine prima che siano endocitosizzate con agenti come la biotina aiuta gli scienziati a quantificare la loro internalizzazione e studiare i loro ruoli nei percorsi cellulari.

In questo video, discuteremo i principi e la metodologia dei saggi di biotinilazione della superficie cellulare ed esploreremo alcuni modi in cui gli scienziati stanno adattando questo metodo oggi.

Esaminiamo prima i principi alla base del test di biotinilazione della superficie cellulare.

Come accennato in precedenza, le cellule utilizzano le vie endocitiche per regolare la densità spaziotemporale e la distribuzione delle proteine di superficie. Le proteine internalizzate vengono trasportate attraverso specifici percorsi cellulari, in seguito ai quali possono essere deviate verso il lisosoma per la degradazione o riciclate sulla superficie cellulare per un’attività continua. La biotinilazione cellula-superficie è progettata per misurare questi processi.

Il tag utilizzato in questo test, la biotina, nota anche come vitamina H, è una piccola molecola solubile in acqua. Un derivato comunemente usato della biotina per esperimenti di etichettatura superficiale è il sulfo-NHS-SS-biotina, che consiste nel gruppo sulfo, nel gruppo estere N-idrossi succinimide, nel legame disolfuro e, naturalmente, nella biotina. Semplifichiamo questa enorme struttura sostituendo la biotina con la lettera “B”.

Il gruppo sulfo in questa struttura conferisce una forte carica che rende questa forma di membrana di biotina impermeabile. L’etichettatura delle proteine di superficie cellulare viene effettuata aggiungendo sulfo-NHS-SS-biotina alle cellule mantenute a una temperatura restrittiva per l’endocitosi. Il gruppo NHS reagisce con le ammine primarie sulle proteine di superficie, formando legami covalenti.

Quindi, le cellule etichettate vengono spostate a una temperatura permissiva all’endocitosi, durante la quale alcune delle proteine etichettate saranno internalizzate. Infine, le cellule vengono riportate alla temperatura restrittiva per fermare l’endocitosi. Al fine di quantificare specificamente le proteine internalizzate, viene aggiunto un agente riducente idrofilo e impermeabile alla membrana, come il L-glutatione. Ciò reagirà con i legami disolfuro sulla biotina sulfo-NHS-SS non echerà i gruppi di biotina non esenterà i gruppi di biotina. A questo punto, le restanti proteine biotinilate sono quelle le cui etichette sono state protette dall’agente riducente perché precedentemente interiorizzate.

Le cellule vengono quindi lizzate e le proteine biotinilate endocitosizzate vengono isolate per essere quantificate. L’isolamento viene solitamente eseguito aggiungendo l’aggiunta di lasati cellulari a pere sintetiche rivestite con streptavitina. Poiché la streptavitina ha un’affinità estremamente elevata per la biotina, le proteine biotinilate si attaccano alle perle rivestite. Una serie di passaggi di lavaggio per rimuovere le proteine contaminanti e, infine, una fase di eluizione, viene eseguita per rilasciare le proteine legate. Le proteine bersaglio possono quindi essere analizzate con tecniche come il Western blotting.

Poiché ora conosci i concetti alla base del test di biotinilazione, diamo un’occhiata a un protocollo generalizzato che mostra come eseguire questa procedura per misurare l’endocitosi delle proteine di superficie.

Iniziare con cellule coltivate raffreddate a 4°C. Mettili sul ghiaccio per mantenere la temperatura che è restrittiva per l’endocitosi. Successivamente, viene aggiunto il reagente impermeabile alla membrana sulfo-NHS-SS-biotina e le cellule vengono incubate al buio per circa 30 minuti. Ciò consente un tempo sufficiente affinché le etichette della biotina si attacchino covalentemente alle proteine di superficie. Le cellule vengono quindi rimosse dal ghiaccio e incubate a 37 ° C per circa 30 minuti. A questa temperatura, le proteine di superficie biotinilate vengono endocitose. Dopo l’incubazione, le cellule vengono raffreddate a 4 ° C e viene aggiunto un agente riducente idrofilo come L-glutatione. Questo reagisce con i legami disolfuro e rilascia i gruppi di biotina da proteine etichettate e non andocitizzate.

Successivamente, le cellule vengono lizzate mediante centrifugazione, rompendo così le membrane cellulari ed esponendo proteine biotinilate. Successivamente, i lasati vengono aggiunti alle perle rivestite di streptavicina e le proteine biotinilate possono legarsi. Le perline vengono lavate con soluzione salina tamponata con fosfato freddo ed eluite con un tampone contenente detergenti e agenti riducenti. Questi reagenti denaturano le proteine legate alle perle e consentono il loro recupero nell’eluato. Le proteine nell’eluato vengono separate sulla base della loro massa molecolare mediante elettroforesi su gel. Infine, il western blotting e il sondaggio della macchia con anticorpi specifici della proteina consentono la visualizzazione della proteina bersaglio. La percentuale di proteine endocitose può essere quantificata dalle densità di banda risultanti.

Ora che hai capito la metodologia della biotinilazione cellulare, diamo un’occhiata a come viene utilizzata in esperimenti specifici.

L’applicazione più comune di questo protocollo di biotinilazione è quella di misurare il tasso endocitico di specifiche proteine di superficie cellulare. Qui, gli scienziati erano interessati a valutare l’internalizzazione del trasportatore della dopamina o DAT. Seguendo il protocollo standard, gli scienziati sono stati in grado di misurare la percentuale di DAT endocitosi. Questo è un immunoblot rappresentativo che mostra la corsia T, corrispondente alla quantità “totale” di proteine prima dell’internalizzazione, la corsia S è per i campioni “spogliati” in cui alle cellule non è mai stato permesso di procedere attraverso l’endocitosi ma trattate con agente riducente, e la corsia I rappresenta i risultati delle proteine “internalizzate”.

Oltre a misurare solo l’endocitosi delle proteine di superficie, gli scienziati esaminano anche gli effetti dei farmaci su questo processo. In questo studio, i ricercatori hanno valutato la densità superficiale dei DAT in risposta al trattamento con un attivatore della proteina chinasi C (PKC), la cui azione è stata suggerita per indurre l’internalizzazione del DAT. Gli scienziati lo hanno confermato adattando il protocollo di biotinilazione in vitro per l’uso in un test ex vivo sul tessuto cerebrale del topo. I dati hanno rivelato una perdita di circa il 30% di DAT dalla membrana cellulare, in risposta all’attivazione della PKC.

Infine, modificando il test di biotinilazione, gli scienziati possono anche misurare il riciclaggio delle proteine di membrana. Qui, i ricercatori stavano studiando la proteina del canale superficiale, CFTR, responsabile della conduzione degli ioni cloruro. Per valutare il riciclaggio, i ricercatori hanno eseguito un protocollo di biotinilazione standard in un gruppo di cellule e hanno modificato il protocollo per il secondo gruppo di cellule aggiungendo passaggi dopo aver scisso la biotina dalle proteine di superficie non diattetizzate. Questi passaggi aggiuntivi includevano l’aumento della temperatura a 37 ° C per consentire il riciclaggio di alcune delle proteine del recettore internalizzate e marcate con biotina. Calcolando la differenza tra le proteine interiorizzate prima e dopo il riciclaggio, questi scienziati sono stati in grado di quantificare la percentuale di CFTR riciclata sulla membrana.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE al test di biotinilazione della superficie cellulare. Il video descriveva le fasi procedurali di questo test e spiegava la reazione che si verificava in ogni fase. Infine, abbiamo esplorato alcuni esperimenti di esempio che hanno dimostrato l’applicabilità di questo metodo. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

Labeling of cell surface proteins with biotin presents a powerful tool to study cellular transport pathways involved in regulating membrane proteins. A cell maintains a tightly regulated set of proteins at the surface, so that it can receive and respond to extracellular information via several signaling pathways. Endocytosis, a process of engulfing, is suggested to be involved in regulation of these cell surface proteins by causing their internalization. Therefore, labeling these proteins before they are endocytosed with agents like biotin helps scientists quantify their internalization and study their roles in cellular pathways.

In this video, we will discuss the principles and methodology of cell-surface biotinylation assays, and explore some ways in which scientists are adapting this method today.

Let’s first review the principles behind the cell-surface biotinylation assay.

As mentioned earlier, cells use endocytic pathways to regulate the spatiotemporal density and distribution of surface proteins. Internalized proteins are transported through specific cellular pathways, following which they can be either shunted to the lysosome for degradation, or recycled back to the cell surface for continued activity. Cell-surface biotinylation is designed to measure these processes.

The tag used in this assay, biotin—also known as vitamin H—is a small, water-soluble molecule. A commonly used derivative of biotin for surface labeling experiments is the sulfo-NHS-SS-biotin, which consists of the sulfo group, the N-hydroxy succinimide ester group, the disulfide bond, and of course biotin. Let’s simplify this huge structure by replacing biotin with the letter “B.”

The sulfo group in this structure imparts a strong charge that makes this form of biotin membrane impermeant. Labeling of cell surface proteins is done by adding sulfo-NHS-SS-biotin to cells maintained at a temperature that’s restrictive to endocytosis. The NHS group reacts with the primary amines on surface proteins, forming covalent bonds.

Then, the labeled cells are moved to a temperature that is permissive to endocytosis, during which some of the labeled proteins will be internalized. Finally, cells are moved back to the restrictive temperature to stop endocytosis. In order to specifically quantify internalized proteins, a hydrophilic, membrane-impermeant reducing agent—like L-glutathione—is added. This will react with the disulfide bonds on unendocytosed sulfo-NHS-SS biotin, and cleave biotin groups off. At this point, remaining biotinylated proteins are those whose labels were protected from the reducing agent because they were previously internalized.

Cells are then lysed, and the endocytosed biotinylated proteins are isolated to be quantified. Isolation is usually performed by adding cell lysates to synthetic beads coated with streptavidin. Since streptavidin has an extremely high affinity for biotin, the biotinylated proteins attach themselves to the coated beads. A series of washing steps to remove contaminating proteins, and lastly an elution step, is performed to release bound proteins. The target proteins can then be analyzed by techniques like Western blotting.

Since now you know the concepts behind the biotinylation assay, let’s look at a generalized protocol showing how to perform this procedure to measure endocytosis of surface proteins.

Start with cultured cells cooled to 4°C. Place them on ice to maintain the temperature that is restrictive to endocytosis. Next, the membrane impermeable sulfo-NHS-SS-biotin reagent is added, and cells are incubated in the dark for approximately 30 minutes. This allows sufficient time for biotin labels to covalently attach to the surface proteins. Cells are then removed from ice and incubated at 37°C for approximately 30 minutes. At this temperature, biotinylated surface proteins are endocytosed. Following incubation, the cells are cooled to 4°C, and a hydrophilic reducing agent like L-glutathione is added. This reacts with disulfide bonds and releases the biotin groups from labeled, unendocytosed proteins.

Next, cells are lysed by centrifugation, thus breaking cell membranes and exposing biotinylated proteins. Following this, lysates are added to streptavidin-coated beads and biotinylated proteins are allowed to bind. Beads are washed with cold phosphate buffered saline and eluted with a buffer containing detergents and reducing agents. These reagents denature bound proteins off beads and enable their recovery in the eluate. Proteins in the eluate are separated on the basis of their molecular mass by gel electrophoresis. Lastly, Western blotting and probing of the blot with protein-specific antibodies allow visualization of the target protein. Percentage endocytosed protein can be quantified from the resulting band densities.

Now that you understand the methodology of cell biotinylation, let’s look at how it’s used in specific experiments.

The most common application of this biotinylation protocol is to measure the endocytic rate of specific cell surface proteins. Here, scientists were interested in evaluating the internalization of dopamine transporter or DAT. By following the standard protocol, scientists were able to measure the percentage of endocytosed DATs. This is a representative immunoblot showing lane T, corresponding to “total” amount of protein before internalization, lane S is for “stripped” samples where cells were never allowed to proceed through endocytosis but treated with reducing agent, and lane I represents results of “internalized” proteins.

In addition to just measuring endocytosis of surface proteins, scientists also examine the effects of drugs on this process. In this study, researchers assessed the surface density of DATs in response to treatment with an activator of protein kinase C (PKC), whose action has been suggested to induce DAT internalization. Scientists confirmed this by adapting the in vitro biotinylation protocol for use in an ex vivo assay on mouse brain tissue. The data revealed an approximately 30% loss of DAT from the cell membrane, in response to PKC activation.

Lastly, by tweaking the biotinylation assay, scientists can also measure recycling of membrane proteins. Here, researchers were investigating the surface channel protein, CFTR, responsible for conducting chloride ions. To assess recycling, researchers performed a standard biotinylation protocol in one group of cells, and modified the protocol for the second group of cells by adding steps after cleaving biotin off of the unendocytosed surface proteins. These additional steps included raising the temperature back to 37°C to allow recycling of some of the internalized, biotin tagged receptor proteins. By calculating the difference between the internalized proteins before and after recycling takes place, these scientists were able to quantify percent CFTR recycled back to the membrane.

You just watched JoVE’s introduction to cell-surface biotinylation assay. The video described the procedural steps of this assay, and explained the reaction occurring at each step. Lastly, we explored some example experiments that demonstrated the applicability of this method. As always, thanks for watching!

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