Applicazione di microscopia di velocità ad alta velocità super-risoluzione in Live cilio primario

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare le vie di trasporto delle proteine nelle ciglia primarie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle ciglia, come le differenze di percorso di trasporto delle proteine nelle ciglia normali e disfunzionali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha una risoluzione sufficientemente alta per vedere le vie di trasporto delle proteine di subdiffrazione nelle cellule vive.

Per iniziare, scongelare le celle NIH-3T3 appositamente ingegnerizzate a 37 gradi Celsius, una settimana e mezza prima dell'esperimento. Trasferire le cellule scongelate in un pallone di coltura cellulare quadrato di 25 centimetri contenente tre millilitri di terreno preriscaldato. Mantenere le celle a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica.

Coltivare le cellule fino a raggiungere l'80% di confluenza, quindi dividere le cellule. Per dividere le cellule, tripsinizzarle con lo 0,25% di tripsina per due minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la breve incubazione, aspirare la tripsina e sostituirla con due millilitri di terreno di coltura preriscaldato.

Pipettare il terreno per rompere eventuali gruppi di cellule, quindi rimuovere il 75% delle cellule dal pallone e riportare il volume totale del terreno fino a tre millilitri. Dividere le cellule almeno tre volte prima dell'esperimento per garantire l'omogeneità del loro ciclo cellulare. Due giorni prima dell'esperimento, dividere le cellule e piastrellarle al 60-70% di confluenza su una piastra di vetro da 35 millimetri con 1,5 millilitri dello stesso terreno di coltura.

Quindi, un giorno prima dell'esperimento, trasfettare chimicamente le cellule con il plasmide desiderato. Mescolare 500-1000 nanogrammi di plasmide in un rapporto da uno a 2,5 con il reagente di trasfezione e 0,25 millilitri di terreno sierico ridotto senza antibiotici per 30 minuti. Una volta formato il complesso di trasfezione, aspirare il terreno dal piatto di vetro da 35 millimetri e sostituirlo con la miscela di trasfezione da 0,25 millimetri e altri 1,25 millimetri di siero ridotto senza antibiotici e rimettere la piastra nell'incubatore.

Per le celle con costrutto SSTR3 marcato esternamente, rimuovere il terreno dal piatto con fondo di vetro un'ora prima dell'esperimento. Lavare le cellule cinque volte con un millilitro di PBS e aggiungere un millilitro di terreno sierico ridotto integrato con un micromolare di streptavidina coniugata Alexa 647. Non più di 15 minuti prima dell'esperimento, rimuovere il terreno dal piatto con fondo di vetro e lavare le cellule cinque volte con un millilitro di PBS.

Quindi aggiungere un millilitro di tampone di imaging nel piatto di vetro con fondo. Fissare la piastra inferiore in vetro al tavolino nel microscopio. Trovare una cellula GFP express utilizzando il set di filtri GFP e individuare una cellula che esprime correttamente SSTR3-GFP in una ciglia primaria.

Una volta trovata una cella adatta, allineare il punto NPHP4-mCherry alla base delle ciglia primarie con la posizione sul piano di imaging che corrisponde all'illuminazione a punto singolo del laser. Utilizzando la funzione snap, nella scheda della fotocamera della finestra dei controlli di messa a fuoco, acquisisci un'immagine in epifluorescenza delle proteine NPHP4-mCherry e SSTR3 contrassegnate con la proteina a fluorescenza verde. Una volta ottenute le immagini di riferimento, ridurre localmente la concentrazione di singole molecole marcate fotosbiancando la zona di transizione con un'illuminazione laser da un milliwatt per 20 secondi.

Per prepararti al tracciamento di singole molecole, riduci la potenza di illuminazione del laser a 0,5 milliwatt per le molecole marcate con Alexa 647. Impostate il guadagno e l'intensificazione al massimo e la frequenza dei fotogrammi a due millisecondi. Quindi fare clic sul pulsante di streaming nella scheda della fotocamera della finestra dei controlli di messa a fuoco e attivare il laser di illuminazione appropriato.

Registrare le singole molecole marcate non fotosbiancate mentre vengono trasportate attraverso la regione fotosbiancata della zona di transizione. E ricordate di registrare non più di due minuti di video per evitare gli effetti della deriva ciliare. Dopo aver catturato le singole molecole, elabora i video utilizzando un algoritmo di adattamento gaussiano 2D come Glimpse del laboratorio Gelles, che localizza con precisione il baricentro del punto di eccitazione di ogni singola molecola, la funzione di diffusione e un'area di interesse che lo comprende.

Infine, selezionare tutte le posizioni delle singole molecole con una precisione migliore di 10 nanometri e correggere il centro delle ciglia in base alla distribuzione delle posizioni delle singole molecole dotate di una funzione gaussiana 2D. Come descritto in questo video, l'illuminazione a punto singolo può essere utilizzata per tracciare una molecola SSTR3 marcata AF647 attraverso la zona di transizione contrassegnata da NPHP4-mCherry. Prima dell'analisi dei dati, la sovrapposizione del video della singola molecola all'illuminazione ad ampio campo è un'utile fase di convalida per assicurarsi che il laser sia allineato correttamente e che vi sia un adeguato rapporto segnale/rumore.

Qui è raffigurata una cellula con un cilio primario identificato dalla colorazione. IFT20 è un componente del complesso di trasporto intraflagellare che trasporta il carico lungo i microtubuli all'interno delle ciglia primarie, marcato da Arl13b-mCherry. Una volta identificata, la microscopia veloce viene utilizzata per tracciare le singole proteine IFT20-GFP.

Successivamente, viene utilizzato un algoritmo di trasformazione da 2D a 3D per produrre la distribuzione spaziale della densità di probabilità della proteina all'interno delle ciglia primarie lungo una singola dimensione. Questa regione ad alta densità probabilmente colocalizza con i microtubuli assonomici in accordo con la posizione nota della via di trasporto intraflagellare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante allineare con precisione il campione con il laser per ridurre al minimo l'errore sistematico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il tracciamento di singole molecole con la microscopia veloce e saprai come ottenere il percorso di trasporto di una singola molecola nelle ciglia primarie.