Applicazione di microscopia di velocità ad alta velocità super-risoluzione in Live cilio primario
16 gennaio 2018
Recentemente abbiamo mappato le posizioni spaziali (3D) tridimensionale delle vie di trasporto per varie proteine dispostamento all'interno ciliari in cellule vive. Qui questo dettagli di carta la messa a punto sperimentale, il processo di campioni biologici e l'analisi dei dati per la fluorescenza 3D Super-resolution imaging approccio appena applicati in live ciliari.
L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare le vie di trasporto delle proteine nelle ciglia primarie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle ciglia, come le differenze di percorso di trasporto delle proteine nelle ciglia normali e disfunzionali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha una risoluzione sufficientemente alta per vedere le vie di trasporto delle proteine di subdiffrazione nelle cellule vive.
Per iniziare, scongelare le celle NIH-3T3 appositamente ingegnerizzate a 37 gradi Celsius, una settimana e mezza prima dell'esperimento. Trasferire le cellule scongelate in un pallone di coltura cellulare quadrato di 25 centimetri contenente tre millilitri di terreno preriscaldato. Mantenere le celle a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica.
Coltivare le cellule fino a raggiungere l'80% di confluenza, quindi dividere le cellule. Per dividere le cellule, tripsinizzarle con lo 0,25% di tripsina per due minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la breve incubazione, aspirare la tripsina e sostituirla con due millilitri di terreno di coltura preriscaldato.
Pipettare il terreno per rompere eventuali gruppi di cellule, quindi rimuovere il 75% delle cellule dal pallone e riportare il volume totale del terreno fino a tre millilitri. Dividere le cellule almeno tre volte prima dell'esperimento per garantire l'omogeneità del loro ciclo cellulare. Due giorni prima dell'esperimento, dividere le cellule e piastrellarle al 60-70% di confluenza su una piastra di vetro da 35 millimetri con 1,5 millilitri dello stesso terreno di coltura.
Quindi, un giorno prima dell'esperimento, trasfettare chimicamente le cellule con il plasmide desiderato. Mescolare 500-1000 nanogrammi di plasmide in un rapporto da uno a 2,5 con il reagente di trasfezione e 0,25 millilitri di terreno sierico ridotto senza antibiotici per 30 minuti. Una volta formato il complesso di trasfezione, aspirare il terreno dal piatto di vetro da 35 millimetri e sostituirlo con la miscela di trasfezione da 0,25 millimetri e altri 1,25 millimetri di siero ridotto senza antibiotici e rimettere la piastra nell'incubatore.
Per le celle con costrutto SSTR3 marcato esternamente, rimuovere il terreno dal piatto con fondo di vetro un'ora prima dell'esperimento. Lavare le cellule cinque volte con un millilitro di PBS e aggiungere un millilitro di terreno sierico ridotto integrato con un micromolare di streptavidina coniugata Alexa 647. Non più di 15 minuti prima dell'esperimento, rimuovere il terreno dal piatto con fondo di vetro e lavare le cellule cinque volte con un millilitro di PBS.
Quindi aggiungere un millilitro di tampone di imaging nel piatto di vetro con fondo. Fissare la piastra inferiore in vetro al tavolino nel microscopio. Trovare una cellula GFP express utilizzando il set di filtri GFP e individuare una cellula che esprime correttamente SSTR3-GFP in una ciglia primaria.
Una volta trovata una cella adatta, allineare il punto NPHP4-mCherry alla base delle ciglia primarie con la posizione sul piano di imaging che corrisponde all'illuminazione a punto singolo del laser. Utilizzando la funzione snap, nella scheda della fotocamera della finestra dei controlli di messa a fuoco, acquisisci un'immagine in epifluorescenza delle proteine NPHP4-mCherry e SSTR3 contrassegnate con la proteina a fluorescenza verde. Una volta ottenute le immagini di riferimento, ridurre localmente la concentrazione di singole molecole marcate fotosbiancando la zona di transizione con un'illuminazione laser da un milliwatt per 20 secondi.
Per prepararti al tracciamento di singole molecole, riduci la potenza di illuminazione del laser a 0,5 milliwatt per le molecole marcate con Alexa 647. Impostate il guadagno e l'intensificazione al massimo e la frequenza dei fotogrammi a due millisecondi. Quindi fare clic sul pulsante di streaming nella scheda della fotocamera della finestra dei controlli di messa a fuoco e attivare il laser di illuminazione appropriato.
Registrare le singole molecole marcate non fotosbiancate mentre vengono trasportate attraverso la regione fotosbiancata della zona di transizione. E ricordate di registrare non più di due minuti di video per evitare gli effetti della deriva ciliare. Dopo aver catturato le singole molecole, elabora i video utilizzando un algoritmo di adattamento gaussiano 2D come Glimpse del laboratorio Gelles, che localizza con precisione il baricentro del punto di eccitazione di ogni singola molecola, la funzione di diffusione e un'area di interesse che lo comprende.
Infine, selezionare tutte le posizioni delle singole molecole con una precisione migliore di 10 nanometri e correggere il centro delle ciglia in base alla distribuzione delle posizioni delle singole molecole dotate di una funzione gaussiana 2D. Come descritto in questo video, l'illuminazione a punto singolo può essere utilizzata per tracciare una molecola SSTR3 marcata AF647 attraverso la zona di transizione contrassegnata da NPHP4-mCherry. Prima dell'analisi dei dati, la sovrapposizione del video della singola molecola all'illuminazione ad ampio campo è un'utile fase di convalida per assicurarsi che il laser sia allineato correttamente e che vi sia un adeguato rapporto segnale/rumore.
Qui è raffigurata una cellula con un cilio primario identificato dalla colorazione. IFT20 è un componente del complesso di trasporto intraflagellare che trasporta il carico lungo i microtubuli all'interno delle ciglia primarie, marcato da Arl13b-mCherry. Una volta identificata, la microscopia veloce viene utilizzata per tracciare le singole proteine IFT20-GFP.
Successivamente, viene utilizzato un algoritmo di trasformazione da 2D a 3D per produrre la distribuzione spaziale della densità di probabilità della proteina all'interno delle ciglia primarie lungo una singola dimensione. Questa regione ad alta densità probabilmente colocalizza con i microtubuli assonomici in accordo con la posizione nota della via di trasporto intraflagellare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante allineare con precisione il campione con il laser per ridurre al minimo l'errore sistematico.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il tracciamento di singole molecole con la microscopia veloce e saprai come ottenere il percorso di trasporto di una singola molecola nelle ciglia primarie.
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Panoramica
Questo studio si concentra sulla mappatura delle posizioni spaziali tridimensionali (3D) delle vie di trasporto delle proteine nei cigli primari mediante imaging fluorescente a super-risoluzione. L'allestimento sperimentale e le analisi dei dati sono descritti in dettaglio per fornire informazioni sul trasporto proteico in cellule vive.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Immagini a fluorescenza
Contesto
- Le ciglia primarie svolgono un ruolo cruciale nella segnalazione cellulare.
- Comprendere le vie di trasporto delle proteine può rivelare differenze tra ciglia normali e disfunzionali.
- Le tecniche di imaging ad alta risoluzione sono essenziali per lo studio di questi processi in cellule vive.
- Questa ricerca contribuisce alla comprensione più ampia della funzione e disfunzione ciliare.
Scopo dello studio
- Identificare le vie di trasporto delle proteine nelle ciglia primarie.
- Studiare le differenze nelle vie di trasporto tra ciglia normali e disfunzionali.
- Applicare una nuova tecnica di imaging per una risoluzione migliorata negli studi su cellule vive.
Metodi Utilizzati
- Imaging fluorescente 3D a super-risoluzione.
- Preparazione di cellule NIH-3T3 per l'imaging in tempo reale.
- Scongelamento e coltura delle cellule in condizioni controllate.
- Analisi dei dati per mappare le vie di trasporto delle proteine.
Risultati principali
- Mappatura riuscita delle vie di trasporto delle proteine nei cigli primari vivi.
- Individuazione di differenze chiave nelle vie di trasporto in diverse condizioni.
- Dimostrazione dell'efficacia della tecnica di imaging.
- Informazioni sulle dinamiche del trasporto proteico nei cigli.
Conclusioni
- Lo studio fornisce una nuova prospettiva sul trasporto delle proteine nelle ciglia primarie.
- L'imaging ad alta risoluzione può rivelare informazioni fondamentali sul funzionamento delle ciglia.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi risultati per esplorare il malfunzionamento ciliare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Documento
La mappatura delle vie di trasporto delle proteine nelle ciglia primarie affronta una lacuna fondamentale nella comprensione dei meccanismi di segnalazione ciliare, rilevanti per le ciliopatie e i disturbi neurosviluppali. La microscopia super-risolvente ad alta velocità SPEED consente il tracciamento in tempo reale di singole molecole in cellule vive, fornendo dati spaziali quantitativi che supportano la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nelle fasi iniziali della scoperta. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione di nodi farmacologicamente targettizzabili all'interno delle vie di segnalazione ciliare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione di mappe di densità di probabilità tridimensionali dei percorsi di trasporto delle proteine ciliari in ciglia primarie vive.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale delle target risolvendo i percorsi di trasporto subdiffrazionali di proteine citosoliche e di membrana coinvolti nel trasporto intraflagellare.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio biologico attraverso l'osservazione diretta della dinamica proteica in modelli cellulari rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati (cellule NIH-3T3 che esprimono proteine ciliari marcate con proteine fluorescenti) per lo screening di composti e studi sull'interazione con il bersaglio.
- Output quantitativo: Genera mappe tridimensionali di densità di probabilità spaziale che fungono da letture standardizzate e riproducibili per valutare gli effetti dei composti sul traffico proteico.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma su diverse proteine ciliari (ad esempio, SSTR3, IFT20) e modelli di malattia grazie a protocolli di preparazione del campione e di acquisizione immagini costanti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Si collega all'allineamento dei biomarcatori traslazionali identificando le differenze nei percorsi di trasporto tra ciglia normali e disfunzionali, fornendo indicazioni per la selezione dei modelli preclinici.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica fornendo informazioni meccanicistiche sul trasporto del carico lungo i microtubuli dell'assonema.
- Avanzamento basato sul rischio: Supporta le decisioni di proseguimento/cessazione rivelando difetti di trasporto che si correlano ai fenotipi di disfunzione ciliare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Posizionata all'interno del percorso della scoperta, la microscopia SPEED supporta la verifica delle ipotesi nella fase iniziale della scoperta, consente sistemi pronti per saggi per lo screening e fornisce analisi spaziali quantitative che informano l'identificazione dei composti promettenti e il passaggio alla fase preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi attraverso la mappatura dei percorsi tridimensionali di trasporto delle proteine ciliari in cellule vive.
- Screening: Garantisce la prontezza per saggi grazie alla preparazione standardizzata di modelli di ciglia primarie vive e a risultati riproducibili di tracciamento di singole molecole.
- Analisi: Fornisce misurazioni spaziali ad alta precisione (localizzazione sub-10 nm) e distribuzioni di densità di probabilità che permettono il confronto tra condizioni e la quantificazione degli effetti.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica associando i percorsi di trasporto osservati a meccanismi noti di trasporto intraflagellare e a fenotipi associati a malattie.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità di imaging riutilizzabile su multipli bersagli e linee cellulari grazie alla sua adattabilità a diverse proteine ciliari marcate con fluorescenza.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nel trasporto delle proteine ciliari.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione attraverso protocolli definiti per la preparazione delle cellule, la trasfezione e l'acquisizione delle immagini.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo un rilevamento precoce di potenziali criticità legate al trasporto, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei bersagli ciliari in base al rischio, basandosi su dati funzionali sul trasporto ottenuti da modelli cellulari viventi.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a super-risoluzione, tracciamento di singole molecole e tecniche di imaging in cellule vive.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusa illuminazione laser ad alta velocità, telecamere sensibili (ad esempio EMCCD) e controllo ambientale per il mantenimento delle cellule vive.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda l'efficienza di trasfezione, i livelli di espressione e i protocolli di fotodegradazione, al fine di garantire la comparabilità dei dati.
- Richiede considerazioni di adattamento nell'applicare il metodo a diverse proteine ciliari o tipi cellulari, a causa della variabilità nell'efficienza di trasfezione e nella formazione delle ciglia.
- È limitato dalla necessità di un allineamento preciso tra laser e campione per minimizzare gli errori sistematici nella trasformazione da 2D a 3D e nell'accuratezza della mappatura spaziale.
