Induzione e Micro-CT Imaging delle malformazioni cavernose cerebrali nel modello del topo
September 4th, 2017
Questo protocollo dimostra l'induzione della malattia di malformazione cavernosa cerebrale in un modello murino e usi contrasto migliorato micro tomografia computerizzata per misurare il carico lesionale. Questo metodo aumenta il valore di modelli murini stabilito per lo studio delle basi molecolari e le terapie potenziali per malformazione cavernosa cerebrale e altre malattie cerebrovascolari.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre malformazioni cavernose cerebrali nei topi neonatali e misurare il carico di malattia utilizzando la micro-CT. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie vascolari cerebrali, come le malformazioni cavernose cerebrali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il carico di malattia da malformazione cavernosa cerebrale nei modelli murini neonatali può essere determinato in modo accurato ed efficiente rispetto ai metodi esistenti.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'induzione della malformazione cavernosa cerebrale e le fasi di analisi della micro-CT sono difficili da imparare, perché richiedono esperienza e l'uso di software sofisticati. Iniziare sciogliendo la 4-HT in etanolo al 100% fino a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro. Preparare 30 microlitri di alaquad, quindi conservare a meno 80 gradi Celsius.
Il giorno dell'uso, diluire l'alaquad a 4-HT in olio di mais a 0,5 milligrammi per millilitro. Quindi utilizzare una siringa da insulina per iniettare introgastricamente 50 microlitri di 4-HT nei cuccioli neonatali P1 per indurre lesioni sperimentali CCM. Iniziare la preparazione del campione riempiendo una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 29 con tre millilitri di paraformaldeide al 2% e PBS.
Quindi eseguire la profusione intracardiaca sul cucciolo di P8 eutenizzato inserendo l'ago nel ventricolo del cuore del topo e iniettando lentamente l'intero volume di paraformaldeide. Dopo aver usato le forbici per staccare la testa, rimuovere la pelle dalla testa e staccare il cranio usando una pinza per sezionare l'intero cervello in paraformaldeide al 4% e PBS. Dopo aver fissato il cervello durante la notte a 4 gradi Celsius.
Il giorno seguente, staccare il cervello posteriore usando una pinza e risciacquare con una soluzione di PBS. Quindi incubare il cervello posteriore nella soluzione di iodio di Lugol, per 48 ore. Dopo l'incubazione, asciugare brevemente all'aria il cervello posteriore per rimuovere la soluzione di iodio in eccesso di Lugol.
Quindi imballare il cervello posteriore colorato di iodio del Lugol in provette da microcentrifuga da 0,65 microlitri e sigillare completamente con un film di paraffina di plastica per evitare il restringimento dei tessuti. Posizionare le provette per microcentrifuga in provette di plastica da cinque millilitri con spugne per evitare che si muovano durante la scansione. Montare verticalmente il tubo contenente un cervello posteriore su un supporto in alluminio nel sistema micro-CT.
Impostare i parametri di scansione. Utilizzare 540 proiezioni e un tempo di esposizione di due secondi con condizioni di sorgente di 50 kilovolt e 10 Watt per acquisire i set di dati tomografici. I grafici radio della scansione vengono ricostruiti automaticamente dal software di ricostruzione della proiezione basato su hardware, fornito dal sistema micro-CT, producendo una serie di immagini di fette assiali a 16 bit.
Lo iodio di Lugol ha contrastato la micro-TC e ha rilevato sufficientemente le lesioni CCM. Le immagini a raggi X scansionate sono state ricostruite per produrre immagini 3D del cervello del topo, che hanno permesso la visualizzazione di intere lesioni nel parenchima cerebrale, a diverse profondità e orientamenti, e la valutazione della struttura nella posizione 3D delle lesioni nel cervello. Questa tabella mostra un esempio di output quantitativo delle singole lesioni marcate.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie vascolari per esplorare il meccanismo e le opzioni terapeutiche per le malformazioni cavernose cerebrali in modelli murini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la lesione CCM nei modelli murini e come acquisire e analizzare il carico di lesione CCM con la tecnica micro-CT.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra l'induzione della malattia delle malformazioni cavernose cerebrali nei topi neonatali e utilizza la micro-TC per misurare il carico di lesioni. Questo metodo migliora la comprensione della base molecolare e delle potenziali terapie per la malformazione cavernosa cerebrale e altre malattie cerebrovascolari.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia vascolare
- Modelli murini
Contesto
- Le malformazioni cavernose cerebrali (CCM) sono lesioni vascolari che possono portare a significativi problemi neurologici.
- I metodi esistenti per misurare il carico di malattia nei modelli murini sono spesso inefficienti.
- La micro-TC offre un modo non invasivo per visualizzare e quantificare le lesioni.
- Comprendere le CCM può fornire informazioni su altre malattie cerebrovascolari.
Obiettivo dello studio
- Indurre malformazioni cavernose cerebrali nei topi neonatali.
- Misurare accuratamente il carico di malattia utilizzando la micro-TC.
- Migliorare le metodologie per studiare le malattie cerebrovascolari.
Metodi utilizzati
- Sciogliere 4-HT in etanolo per creare una soluzione per l'induzione delle CCM.
- Preparazione di aliquote per la conservazione a -80 gradi Celsius.
- Utilizzo della micro-TC con contrasto per l'imaging.
- Dimostrazione visiva del processo di induzione e analisi.
Risultati principali
- Il metodo permette una determinazione accurata ed efficiente del carico di malattia CCM.
- La micro-TC fornisce una chiara visualizzazione delle lesioni nei modelli murini.
- L'induzione delle CCM è stata realizzata con successo nei topi neonatali.
- Questo approccio può facilitare ulteriori ricerche su potenziali terapie.
Conclusioni
- Questo protocollo migliora il valore dei modelli murini per studiare le CCM.
- La micro-TC è uno strumento potente per valutare il carico di malattia cerebrovascolare.
- Studi futuri possono basarsi su questa metodologia per esplorare opzioni terapeutiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations (CCMs) in genetically engineered mouse models enables precise assessment of lesion burden, supporting mechanistic de-risking and target validation in cerebrovascular disease research. This approach enhances predictive confidence for early-stage therapeutic hypothesis testing and informs portfolio triage by providing robust, reproducible lesion quantification. Integration of high-resolution imaging with genetic disease models positions this workflow as a critical inflection point for translational continuity in vascular biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of CCM gene function and pathway involvement in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying lesion formation following targeted gene deletion.
- Provides functional target validation through direct measurement of disease-relevant phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in selecting or deprioritizing molecular targets for further study.
Screening & Assay Development
- Establishes validated mouse models and imaging protocols for downstream compound screening.
- Delivers standardized, quantitative lesion metrics suitable for assay development and reproducibility assessment.
- Enables scalable, high-throughput evaluation of therapeutic interventions in preclinical settings.
- Supports reliable comparison of experimental conditions through consistent imaging outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease genetics for translational biomarker development.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Reduces translational risk by providing quantitative endpoints for disease progression and intervention efficacy.
- Strengthens mechanistic understanding of cerebrovascular pathology relevant to clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven genetic manipulation and quantitative phenotyping in mouse models, supporting lead identification and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing and pathway clarification through genetic lesion induction and quantification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Delivers volumetric and numerical lesion data to support statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects genetic models to disease-relevant endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse cerebrovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes lesion quantification and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic mouse model handling and micro-CT imaging protocols.
- Demands access to high-resolution micro-CT instrumentation and specialized analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data interpretation.
- May require adaptation of protocols for different genetic backgrounds or lesion types.
- Dependent on precise sample preparation and imaging conditions to ensure data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
