Induzione e Micro-CT Imaging delle malformazioni cavernose cerebrali nel modello del topo
4 settembre 2017
Questo protocollo dimostra l'induzione della malattia di malformazione cavernosa cerebrale in un modello murino e usi contrasto migliorato micro tomografia computerizzata per misurare il carico lesionale. Questo metodo aumenta il valore di modelli murini stabilito per lo studio delle basi molecolari e le terapie potenziali per malformazione cavernosa cerebrale e altre malattie cerebrovascolari.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre malformazioni cavernose cerebrali nei topi neonatali e misurare il carico di malattia utilizzando la micro-CT. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie vascolari cerebrali, come le malformazioni cavernose cerebrali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il carico di malattia da malformazione cavernosa cerebrale nei modelli murini neonatali può essere determinato in modo accurato ed efficiente rispetto ai metodi esistenti.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'induzione della malformazione cavernosa cerebrale e le fasi di analisi della micro-CT sono difficili da imparare, perché richiedono esperienza e l'uso di software sofisticati. Iniziare sciogliendo la 4-HT in etanolo al 100% fino a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro. Preparare 30 microlitri di alaquad, quindi conservare a meno 80 gradi Celsius.
Il giorno dell'uso, diluire l'alaquad a 4-HT in olio di mais a 0,5 milligrammi per millilitro. Quindi utilizzare una siringa da insulina per iniettare introgastricamente 50 microlitri di 4-HT nei cuccioli neonatali P1 per indurre lesioni sperimentali CCM. Iniziare la preparazione del campione riempiendo una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 29 con tre millilitri di paraformaldeide al 2% e PBS.
Quindi eseguire la profusione intracardiaca sul cucciolo di P8 eutenizzato inserendo l'ago nel ventricolo del cuore del topo e iniettando lentamente l'intero volume di paraformaldeide. Dopo aver usato le forbici per staccare la testa, rimuovere la pelle dalla testa e staccare il cranio usando una pinza per sezionare l'intero cervello in paraformaldeide al 4% e PBS. Dopo aver fissato il cervello durante la notte a 4 gradi Celsius.
Il giorno seguente, staccare il cervello posteriore usando una pinza e risciacquare con una soluzione di PBS. Quindi incubare il cervello posteriore nella soluzione di iodio di Lugol, per 48 ore. Dopo l'incubazione, asciugare brevemente all'aria il cervello posteriore per rimuovere la soluzione di iodio in eccesso di Lugol.
Quindi imballare il cervello posteriore colorato di iodio del Lugol in provette da microcentrifuga da 0,65 microlitri e sigillare completamente con un film di paraffina di plastica per evitare il restringimento dei tessuti. Posizionare le provette per microcentrifuga in provette di plastica da cinque millilitri con spugne per evitare che si muovano durante la scansione. Montare verticalmente il tubo contenente un cervello posteriore su un supporto in alluminio nel sistema micro-CT.
Impostare i parametri di scansione. Utilizzare 540 proiezioni e un tempo di esposizione di due secondi con condizioni di sorgente di 50 kilovolt e 10 Watt per acquisire i set di dati tomografici. I grafici radio della scansione vengono ricostruiti automaticamente dal software di ricostruzione della proiezione basato su hardware, fornito dal sistema micro-CT, producendo una serie di immagini di fette assiali a 16 bit.
Lo iodio di Lugol ha contrastato la micro-TC e ha rilevato sufficientemente le lesioni CCM. Le immagini a raggi X scansionate sono state ricostruite per produrre immagini 3D del cervello del topo, che hanno permesso la visualizzazione di intere lesioni nel parenchima cerebrale, a diverse profondità e orientamenti, e la valutazione della struttura nella posizione 3D delle lesioni nel cervello. Questa tabella mostra un esempio di output quantitativo delle singole lesioni marcate.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie vascolari per esplorare il meccanismo e le opzioni terapeutiche per le malformazioni cavernose cerebrali in modelli murini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la lesione CCM nei modelli murini e come acquisire e analizzare il carico di lesione CCM con la tecnica micro-CT.
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Panoramica
Questo protocollo illustra l'induzione della malformazione cavernosa cerebrale in topi neonati e utilizza la micro-TC per misurare il carico lesionale. Questo metodo migliora la comprensione della base molecolare e delle potenziali terapie per la malformazione cavernosa cerebrale e altre malattie cerebrovascolari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Vascolare
- Modelli Murini
Sfondo
- Le malformazioni cavernose cerebrali (CCM) sono lesioni vascolari che possono causare gravi problemi neurologici.
- I metodi attuali per misurare il carico di malattia nei modelli murini sono spesso inefficienti.
- La micro-TC offre un metodo non invasivo per visualizzare e quantificare le lesioni.
- La comprensione delle CCM può fornire informazioni utili su altre malattie cerebrovascolari.
Scopo dello studio
- Indurre malformazioni cavernose cerebrali nei topi neonati.
- Misurare con precisione il carico della malattia utilizzando la micro-TC.
- Migliorare le metodologie per lo studio delle malattie cerebrovascolari.
Metodi Utilizzati
- Scioglimento del 4-HT in etanolo per creare una soluzione per l'induzione dei CCM.
- Preparazione di aliquote per la conservazione a -80 gradi Celsius.
- Utilizzo della micro-CT con mezzo di contrasto per l'acquisizione di immagini.
- Dimostrazione visiva del processo di induzione e analisi.
Risultati principali
- Il metodo consente una determinazione accurata ed efficiente del carico patologico della malattia CCM.
- La micro-TC fornisce una visualizzazione chiara delle lesioni nei modelli murini.
- L'induzione dei CCM è stata raggiunta con successo nei topi neonati.
- Questo approccio può facilitare ulteriori ricerche su potenziali terapie.
Conclusioni
- Questo protocollo aumenta il valore dei modelli murini per lo studio delle CCM.
- La micro-TC è uno strumento potente per valutare il carico di malattia cerebrovascolare.
- Studi futuri possono basarsi su questa metodologia per esplorare opzioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La micro-TC quantitativa nell'imaging delle malformazioni cavernose cerebrali (CCM) in modelli murini geneticamente modificati consente una valutazione precisa del carico lesionale, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici e la validazione degli obiettivi nella ricerca sulle malattie cerebrovascolari. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nei test ipotesi terapeutici in fase precoce e orienta la selezione del portafoglio fornendo una quantificazione robusta e riproducibile delle lesioni. L'integrazione dell'imaging ad alta risoluzione con modelli genetici di malattia posiziona questo flusso di lavoro come un punto critico di svolta per la continuità traslazionale nei percorsi di biologia vascolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi rigorosa della funzione dei geni CCM e del loro coinvolgimento nelle vie patologiche nei modelli di malattia.
- Supporta la riduzione del rischio biologico quantificando la formazione di lesioni a seguito dell'eliminazione mirata di geni.
- Fornisce una validazione funzionale degli obiettivi attraverso la misurazione diretta di fenotipi rilevanti per la malattia.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione o deprioritizzazione di bersagli molecolari per ulteriori studi.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce modelli murini validati e protocolli di imaging per lo screening di composti successivi.
- Fornisce metriche quantitative standardizzate delle lesioni adatte allo sviluppo di saggi e alla valutazione della riproducibilità.
- Permette una valutazione scalabile ad alto rendimento di interventi terapeutici in contesti preclinici.
- Consente un confronto affidabile tra condizioni sperimentali grazie a risultati di imaging costanti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli preclinici alla genetica delle malattie umane per lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Garantisce una continuità dalla scoperta genetica alla validazione preclinica di ipotesi terapeutiche.
- Riduce il rischio traslazionale fornendo endpoint quantitativi per il decorso della malattia e l'efficacia delle interazioni.
- Consolida la comprensione meccanicistica della patologia cerebrovascolare in relazione alla traslazione clinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica, consentendo manipolazioni genetiche guidate da ipotesi e fenotipizzazione quantitativa in modelli murini, sostenendo l'identificazione dei composti promettenti e l'allineamento di biomarcatori traslazionali.
- Biologia della scoperta: Facilita il test dell'ipotesi nulla e la chiarificazione dei percorsi mediante l'induzione e la quantificazione di lesioni genetiche.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per la preparazione del saggio e la valutazione di composti.
- Analisi: Fornisce dati numerici e volumetrici sulle lesioni per supportare il confronto statistico tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega modelli genetici a endpoint rilevanti per le malattie, garantendo continuità preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging e analisi riutilizzabile per diversi programmi di ricerca cerebrovascolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Standardizza la quantificazione delle lesioni e i flussi di lavoro di imaging per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza del capitale fornendo dati preclinici solidi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento, corretti per il rischio, dei programmi per le malattie vascolari.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'utilizzo di modelli murini genetici e nelle procedure di imaging con micro-TC.
- Richiede l'accesso a strumentazione micro-TC ad alta risoluzione e a software specializzati per l'analisi.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i parametri di imaging e l'interpretazione dei dati.
- Potrebbe richiedere l'adattamento delle procedure a seconda dello sfondo genetico o del tipo di lesione.
- Dipende da una preparazione accurata del campione e da condizioni di imaging precise per garantire la qualità dei dati.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
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Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
