Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare la morfologia delle vescicole extracellulari purificate ed eseguire la localizzazione di proteine specifiche all'interno delle vescicole extracellulari utilizzando la microscopia elettronica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel periodo di ricerca sulle vescicole extracellulari, come la categorizzazione dell'esosoma e delle proteine specifiche situate al suo interno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per osservare la porzione di proteine specifiche situate sia all'interno che all'esterno dell'esosoma.

L'implicazione di questa tecnica è quella di garantire la diagnosi di diverse malattie, tra cui il cancro e le infezioni batteriche. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'esosoma, può essere applicato anche ad altri campioni biologici, all'incubazione microcellulare e alla localizzazione di proteine specifiche. In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della creazione di contaminazione mentre il legame non specifico della particella di immunogold.

Utilizzando tecniche standard, preparare gli esosomi in coltura. Quindi ultracentrifugare il surnatante di coltura delle cellule HCT116 per pellettare gli esosomi dal terreno. Una volta pellettato, rimuovere con cura il surnatante di coltura.

Per fissare il pellet di esosoma purificato, aggiungere un millilitro di glutaraldeide al 2,5% in una soluzione di cacodilato di soldium 0,1 molare a PH 7,0. Incubare le vescicole dello strato lipidico per un'ora a quattro gradi Celsius. Quindi, rimuovere il fissativo e sciacquare i pellet con un millilitro di una soluzione tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare a temperatura ambiente per 10 minuti.

Quindi postfissare i campioni con un millilitro di tetrossido di osmio al 2% per un'ora a quattro gradi Celsius. Rimuovere il fissativo e sciacquare il pellet dell'esosoma tre volte con il tampone di cacodilato di sodio molare 0,1, cambiando il tampone ogni dieci minuti. Quindi disidratare il campione agitandolo per 10 minuti ciascuno in una serie di concentrazioni di acetone graduate.

Quindi, mescola una soluzione di tre parti di acetone e una parte di miscela di incorporamento a bassa viscosità. Sostituire l'acetone con questa miscela e incubare il campione per 30 minuti. Continuare ad aumentare il rapporto del terreno di inclusione a bassa viscosità, incubando per 30 minuti ad ogni passaggio.

Infine, incubare il pellet di esosoma nel 100% della miscela di inclusione a bassa viscosità per una notte a temperatura ambiente. Il giorno seguente, incorporare il campione in una miscela di inclusione pura a bassa viscosità utilizzando uno stampo da inclusione e cuocerlo per 24 ore a 65 gradi Celsius. Utilizzando un ultramicrotomo, preparare sezioni con uno spessore di 60 nanometri.

Posizionare le sezioni su una griglia di nichel e colorare due volte alcune di esse con il 2% di acetato di uranile per 20 minuti, seguito da citrato di piombo per 10 minuti. Quindi, posizionare la sezione colorata in un microscopio elettronico a trasmissione e visualizzare il campione utilizzando 80 kilovolt e seguire le impostazioni automatiche per il tempo di esposizione. Con un'immagine dell'esosoma in vista, acquisire e salvare l'immagine utilizzando il software del microscopio.

Per iniziare, incubare griglie contenenti sezioni non colorate spesse 60 nanometri in gocce da 50 microlitri di glicina molare 0,02 per 10 minuti per estinguere i gruppi aldeidici liberi. Quindi, sciacquare le sezioni in 100 microlitri di acqua distillata tre volte per 10 minuti ciascuna. Dopo l'ultimo risciacquo, incubare le sezioni per un'ora a temperatura ambiente in PBS contenente l'1% di BSA.

Quindi, incubare le griglie in gocce da 50 a 100 microlitri di un anticorpo anti-KRS per un'ora. Successivamente, lavare le griglie cinque volte per 10 minuti ciascuna in una goccia di PBS contenente lo 0,1% di BSA. Quindi, trasferire le griglie in una goccia di un anticorpo secondario appropriato e incubare le sezioni per un'ora a temperatura ambiente.

Ora, lava le griglie cinque volte per 10 minuti, ciascuna con una goccia separata di PBS contenente lo 0,1% di BSA. Colorare due volte le sezioni con acetato di uranile al 2% per 20 minuti al buio seguito da citrato di piombo Reynolds per 10 minuti. Posizionare la sezione colorata in un microscopio elettronico a trasmissione e visualizzare il campione utilizzando 80 kilovolt e visualizzarli come mostrato in precedenza.

Per eseguire la colorazione negativa, fissare gli esosomi purificati dopo l'isolamento con un millilitro di paraformaldeide al 2% per cinque minuti. Trattare per un minuto griglie EM in rame sottili, rivestite con film di carbonio/formvar/film di carbonio, con scarica a incandescenza, quindi caricare da cinque a sette microlitri della soluzione di sospensione dell'esosoma su una griglia e incubarla per un minuto. Se la concentrazione di esosoma è troppo alta, diluire la concentrazione a un livello appropriato.

Colorare immediatamente gli esosomi con circa 20 gocce di una soluzione filtrata di acetato di uranile all'1% sulla superficie della griglia EM. Rimuovere la soluzione di acetato di uranile in eccesso dalla griglia a contatto con il bordo della griglia con carta da filtro, quindi sciacquare rapidamente la griglia con una goccia d'acqua. Usa un paio di pinzette per posizionare la griglia sul tavolo e copri parzialmente la griglia con un piatto di coltura.

Lasciare asciugare la griglia per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi creare un'immagine della griglia o conservarla in una scatola a griglia per microscopio elettronico per osservazioni future. Inizia trattando le sottili griglie EM in rame da 200 mesh rivestite con film di formvar/carbonio con scarica a bagliore per 30 secondi. Quindi, caricare da cinque a sette microlitri di esosomi fissati in una soluzione di paraformaldeide al 2% sulla griglia e incubarli lì per cinque minuti.

Successivamente, sciacquare gli esosomi con 100 microlitri di PBS, tre volte ciascuno per 10 minuti. Trattare le griglie contenenti esosoma con 50 microlitri di una soluzione di glicina 0,5 molare per 10 minuti per estinguere i gruppi aldeidici liberi. Quindi, trasferisci le griglie su una goccia di PBS contenente l'1% di BSA e blocca per 30 minuti.

Ora incubare le griglie con 50-100 microlitri di anticorpo anti-PD-L1 per un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare la griglia con cinque gocce separate di PBS contenenti lo 0,1% di BSA per 10 minuti ciascuna, quindi trasferire la griglia in una goccia dell'anticorpo secondario per un'ora. Quindi, lavare la griglia con cinque gocce separate di PBS contenenti lo 0,1% di BSA per 10 minuti ciascuna, quindi lavare la griglia con due gocce separate di acqua distillata.

Al termine, eseguire la colorazione negativa con acetato di uranile al 2%, come mostrato in precedenza, e visualizzare i campioni, oppure conservarli in una scatola a griglia EM per osservazioni future. La morfologia dell'esosoma osservata qui è il prodotto della colorazione negativa. Questi esosomi mostrano una tipica morfologia a forma di coppa, che è un artefatto che può verificarsi durante il processo di essiccazione.

Ulteriori informazioni possono essere ottenute utilizzando la colorazione con immunogold a montatura intera, come la posizione di proteine specifiche nell'esosoma. Qui, le frecce bianche indicano la posizione di PD-L1. Nelle immagini sezionate, le vescicole mostravano una struttura del lume nota come caratteristica strutturale degli esosomi.

Anche questi possono essere colorati con immunogold per identificare proteine specifiche in tutti gli esosomi. Una volta padroneggiata, la tecnica di colorazione con immunogold può essere eseguita in cellule fibrose dopo una semplice preparazione e sezionamento, se eseguita correttamente. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la doppia colorazione immunologica per identificare contemporaneamente la posizione di due diverse proteine.

Dopo ogni sviluppo, questa tecnica può essere utilizzata nel campo delle vescicole extracellulari per esplorare le diagnosi di malattia nelle biopsie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare la localizzazione di proteine specifiche all'interno dell'esosoma. Non dimenticare che stanno lavorando con soluzioni fissative, come cloridrato, paraformaldeide e tetrossido di osmio possono essere estremamente pericolose e precauzioni come cappa aspirante ventilata e guanti in lattice dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.