Name: Un modello di trofoblasto umano primario per studiare leffetto di infiammazione associata con lobesità materna sulla regolazione dellautofagia nella Placenta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Impara a isolare trofoblasti primari da tessuto villoso placentare umano per studiare l'effetto dell'infiammazione mediata da TNFα sulla regolazione genica. Questo modello aiuta a comprendere le disfunzioni placentari legate all'obesità materna.

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Gli autori ringraziano le donne che hanno donato loro placente per questo studio. Ringraziamo anche il dipartimento di consegna al OHSU e materno e fetale Team di ricerca e lavoro per coordinare la raccolta di placente. Siamo grati a Eric Wang, pH.d. e Kelly Kuo, MD per supporto e aiuto con metodi sperimentali e ottimizzazione.
Questo lavoro è stato finanziato da NIH HD076259A (AM) e AHA GRNT29960007 (AM).

placente sono stati raccolti dall'unità di consegna all'ospedale universitario e del lavoro nell'ambito di un protocollo approvato dall'istituzionale Review Board of Oregon Health and Science University a Portland, Oregon, con il consenso informato il pazienti.
 1. raccolta di tessuto placentare <ol><li>preparazione Nota: tutte le attrezzature che incontra il tessuto devono essere sterile.
	<ol><li>L'apparecchiatura per dissezione di sterilizzare in autoclave per 60 min a 121 ° C.</li>
		<li>Utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE): laboratorio cappotti/abiti/scrub, guanti e maschera con una visiera o occhiali di protezione.</li>
		<li>Disabilita il bagnomaria e insieme a 37 ° C.</li>
		<li>Caldo due provette coniche da 50 mL, ciascuna contenente 25 mL di completa per i media (Iscove &#39; s Modified Dulbecco &#39; s supplementato con 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina, tabella 3) in bagnomaria a 37 ° C.</li>
		<li>Con consenso informato del paziente, ottenere una placenta subito dopo la consegna dalla sezione cesarean.</li>
		<li>Acquisire familiarità con la placenta. Il cordone ombelicale viene inserito sul lato fetale (piatto corionico) e vasi sanguigni può essere visto che si irradiano fuori dal sito per l'inserzione del cordone ombelicale. Sul lato opposto è il lato materno, o piastra basale. Esso comprende la decidua e strutture che contengono gli alberi di nave, chiamati cotiledoni.</li>
	</ol></li> <li>Campionamento del tessuto Villous Nota: tessuto Villous deve essere campionato dalla placenta appena possibile dopo il parto, preferibilmente in 30 min o meno.
	<ol><li>Con piatto corionico rivolto verso l'alto, asportare sezioni di pieno-spessore 2-3 (circa 2,5 cm x 2,5 cm nel formato) 2-3 cm dalla periferia della placenta a casuale, usando pinze e le forbici ( Figura 1A). 
		Nota: Evitare di parti della placenta che appaiono anormali (cioè bianche calcificazioni).</li>
		<li>Tagliare via le piastre corioniche e basale e qualsiasi grandi vasi sanguigni.</li>
		<li>Posizionare il tessuto villous risultante ( Figura 1B, circa 80-120 g totale) in media completi caldi e iniziare isolamento trofoblasto entro 30 min di campionamento. 
		Nota: Alcuni saggi a valle e applicazioni sono interessate dalla lunghezza del periodo di latenza tra consegna, campionamento e l'isolamento di trofoblasto. Si consiglia di mantenere questi periodi più breve possibile e coerente tra isolamenti.</li>
		<li>Utilizzando le tecniche descritte nei passaggi 1.2.1 - 1.2.2, campione 5 sezioni casuale 1 x 1 cm di tessuto villous da altro lato la placenta (tra cui il centro).</li>
		<li>Taglio ogni campione di tessuto villous di 1 x 1 cm in 4-5 piccoli pezzi (circa 30 mg ciascuna), posto in provette microcentrifuga da 2 mL e flash freeze liquido N 2. Conservare a-80 ° C per uso nelle analisi successive.</li>
	</ol></li></ol> 2. Isolamento di trofoblasti da tessuto Villous <ol><li>preparazione Nota: utilizzare attrezzature sterili ed eseguire procedure che coinvolgono le cellule in una cappa a flusso laminare.
	<ol><li>Disgelo quattro gradienti di densità congelati (tabella 1, vedere la tabella della forniture essenziali, reagenti e attrezzature, materiale supplementare) a 4 ° C la notte prima la placenta arriva. 
		Nota: In alternativa, gradienti di densità possono essere fatta il giorno dell'isolamento.</li>
		<li>Disabilita il centrifuga e insieme a 20 ° C. 
		Nota: Tutte le fasi di centrifugazione sono alla massima accelerazione e decelerazione se non specificato diversamente.</li>
		<li>Preparare 1 x soluzione salina tamponata HEPES (HBSS) completati con Ca + 2 e Mg + 2 (tabella 3).</li>
		<li>Tripsina calda a 37 ° C.</li>
		<li>Dnasi diluire a circa 2720 kilounits/mL in sterile completati HBSS.</li>
		<li>Caldo 50 mL di siero di vitello appena nato (NCS) a 37 ° C.</li>
		<li>Caldo completa per i media a 37 ° C.</li>
		<li>Caldo media congelamento (90% FBS, 10% DMSO, tabella 3) a 37 ° C. 
		Attenzione: DMSO è tossico e deve essere maneggiato con guanti.</li>
		Buffer di <li>preparazione digestione (tabella 2 e 3) mescolando 308 mL di completati HBSS, 50 mL di tripsina (3751.7 BAEE unità/mL) e 0,5 mL di dnasi (379.4 kilounits/mL) in una bottiglia sterile. 
		Nota: Il tempo approssimativo necessario per isolare le cellule dal tessuto villous è h. 7</li>
	</ol></li> <li>Elaborazione il tessuto Villous <ol><li>risciacquo ogni pezzo di tessuto villous in una provetta conica da 50 mL riempita con temperatura ambiente fosfato tampone salino (PBS). Ripetere e sostituire il PBS come necessario, fino a quando il sangue in eccesso viene rimosso (risciacquo PBS sarà rosso chiaro o rosa quando il tessuto è accuratamente sciacquato).</li>
		<li>Inserire il tessuto villous in una capsula di Petri sterile e rimuovere come molti vasi sanguigni possibili raschiando delicatamente fuori il morbido tessuto villous dai vasi utilizzando un vetrino da microscopio.</li>
		<li>Tritare finemente il tessuto villous risultante utilizzando forbici.</li>
	</ol></li> <li>Digestione del tessuto villous e grezzo isolamento di trofoblasti <ol><li>trasferire il tessuto villous macinato a un flacone sterile con soluzione di digestione secondo i volumi calcolati basata sull'attività specifiche della tripsina e dnasi (165 mL, tabella 2).</li>
		<li>Dopo 35 min di incubazione in un bagnomaria a 37 ° C con agitazione a 70 giri al minuto (rpm), inclinare la bottiglia di digestione di lato e lasciare i pezzi non digeriti del tessuto a stabilirsi nella parte inferiore della bottiglia. Redigere con cura il surnatante con una pipetta sierologica, evitando il tessuto depositato.</li>
		<li>Dispensare il surnatante attraverso un colino di cella di 100 µm equamente tra provette coniche da 50 mL. 
		Nota: Per risparmiare tempo, si consiglia di iniziare la seconda digestione con l'aggiunta di soluzione di digestione (110 mL, tabella 2) per i restanti si stabilirono tessuto e ripresa di incubazione come descritto al punto 2.3.2.</li>
		<li>Delicatamente strato 3-5 mL di NCS sotto il surnatante filtrato sopprimendo lentamente da una pipetta sierologica nella parte inferiore del tubo. Un menisco tra la sforzata surnatante (contenente trofoblasti) e NCS dovrebbe essere visibile ( Figura 2A).</li>
		<li>Centrifugare i surnatanti sopra NCS a 1.250 x g per 15 min a 20 ° C. Il pellet risultante includerà globuli rossi nello strato inferiore più seguito da uno strato bianco che contiene le cellule del trofoblasto ( Figura 2B).</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.3.2 - 2.3.5 per ciascuna delle digestioni seconda e il terza (aggiunta di 110 mL e 83,5 m, rispettivamente, della soluzione di digestione alla bottiglia del tessuto, tabella 2).</li>
		<li>Una volta che tutti i surnatanti sono stati centrifugati, ogni risospendere in 5 mL di calda completa per i media e quindi riunire le sospensioni.</li>
		<li>Dividere la sospensione cellulare equamente tra due provette coniche da 50 mL e centrifugare a 1.250 x g per 15 min a 20 ° C.</li>
		<li>Delicatamente rimuovere il supernatante e risospendere ciascuno dei pellet cellulare in 6 mL di caldo complETE media.</li>
	</ol></li> <li>Densità centrifugazione <ol><li>dividere la sospensione cellulare ugualmente fra quattro gradienti di densità (3 mL ciascuno) da lentamente e con attenzione la sospensione cellulare nella parte superiore i gradienti di densità con una pipetta da trasferimento di stratificazione.</li>
		<li>Centrifugare i gradienti di densità a 1.250 x g per 20 min a 20 ° C con minimo accelerazione e decelerazione. Questo dovrebbe produrre distinguibili fasce delle cellule sedimentate (tabella 4).</li>
		<li>Lentamente e con attenzione rimuovere gli strati superiori dei media gradiente di densità (DGM) fino a raggiungere le bande opaco contenente cellule del trofoblasto (tra 35-50% DGM) (tabella 4).</li>
		<li>Trasferire le bande di trofoblasto in due provette coniche da 50 mL e riempire con caldi completi media.</li>
		<li>Capovolgere delicatamente le provette 3 - 6 volte per mescolare e centrifugare a 1.250 x g per 15 min a 20 ° C.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e risospendere ogni cellulare in 5 mL di calda completa per i media. Combinare le sospensioni cellulari e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e Trypan blu (o cella comodo metodo di conteggio).</li>
	</ol></li> <li>Contando le cellule con un emocitometro <ol><li>mescolare la sospensione delle cellule pipettando su e giù con una pipetta sierologica o capovolgendo delicatamente la provetta diverse volte.</li>
		<li>Combinare parti uguali di sospensione cellulare e Trypan blu (cioè 20 µ l ciascuna) in un tubo separato e mescolare delicatamente.</li>
		<li>Incubare per 1-2 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Delicatamente versare 15-20 µ l di cella-Trypan blu miscela tra il vetrino coprioggetto e l'emocitometro e permettono alle cellule di diffuso attraverso la griglia per capillarità.</li>
		<li>Contare cellule vitali (le cellule morte saranno colorate blu profondo) in ciascuno dei quadranti quattro 4x4 con un contatore di riscontro. Impiegare un sistema di conteggio per garantire le celle non sono conteggiate più di una volta (cioè non contare le celle che toccano il fondo o limiti sinistro). 
		Nota: Ciascun 4x4 quadrante dovrebbe contenere tra 50-150 cellule. Troppo poche o troppe cellule possono portare a un eccessivo o sottovalutazione del numero di cell.</li>
		<li>Media cella totale conta da ciascuno dei 4x4 quadranti, moltiplicare per 10 4 e quindi moltiplicare per il fattore di diluizione (sospensione di cellule tripan blu) per calcolare il numero di cellule per mL.</li>
		<li>Moltiplicare il numero di cellule per mL per il volume totale della sospensione di cellule per calcolare il rendimento delle celle totale. 
		Nota: Sono attesi circa 100 milioni di cellule per isolamenti a partire con 80-120 g di tessuto villous.</li>
	</ol></li> <li>Cellule placcatura <ol><li>piastra 3 milioni di cellule/pozzetto (3,3 x 10 5 cellule per cm 2) in una piastra a 6 pozzetti (2 mL di sospensione per pozzetto) e delicatamente oscillare avanti e indietro e lato a altro per distribuire uniformemente le cellule. 
		Nota: Trophoblasts richiedono piastre di coltura del tessuto trattato di aderire correttamente. Un monostrato di cellule è necessaria per promuovere syncytialization.</li>
		<li>Lasciare le cellule placcate nella cappa a flusso laminare per circa 30 minuti consentire alle cellule di distribuire uniformemente, stabilirsi e iniziare ad aderire al fondo dei pozzi prima di mettere nell'incubatore.</li>
		<li>Cellule di cultura per fino a 72 h (con variazioni giornaliere di media) in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e 95% di umidità. 
		Nota: Esaminare il trofoblasto con un microscopio a 10-20 x ogni 24 h di cultura. Trofoblasto non proliferano e non può essere attraversate. Nel corso di 72 ore di coltura, il rotondi trofoblasti individuali si fondono per formare un sincizio ( Figura 3A e B).</li>
	</ol></li> <li>Congelamento cellule <ol><li>Pellet le celle inutilizzate per centrifugazione a 1.250 x g per 10 min a 20 ° C.</li>
		<li>Aspirare tanto mezzi possibili dal pellet.</li>
		<li>Risospendere il pellet in congelamento media (tabella 3).</li>
		<li>Congelare le aliquote a-80 ° C in un contenitore di congelamento riempito con 100% isopropanolo. Trasferire le aliquote congelate al liquido N 2 il giorno seguente per immagazzinaggio a lungo termine. 
		Nota: Le cellule possono essere coltivate dopo congelamento.</li>
	</ol></li> <li>Scongelamento cellule <ol><li>rimuovere un'aliquota di cellule congelate e scongelare a bagnomaria a 37 ° C mentre vorticoso. Rimuovere l'aliquota dal bagno di acqua appena prima che esso sia completamente sciolto ad un liquido.</li>
		<li>Trasferire immediatamente le cellule scongelate un tubo conico di 15 ml. Inizio rallentamento in un primo momento, aggiungere 10 mL di multimediale completo con miscelazione intermittente.</li>
		<li>Capovolgere la provetta diverse volte per mescolare.</li>
		<li>Centrifugare a 200 x g per 10 min a 20 ° C.</li>
		<li>Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 2-5 mL di caldi completi media.</li>
		<li>Contare le cellule e la piastra come descritto in precedenza.</li>
	</ol></li></ol> 3. Trattamento dei trofoblasti primario con TNFα, collezione di lisati cellulari e Western Blotting <ol><li>preparazione <ol><li>calda completa per i media a 37 ° C.</li>
		<li>Fare un magazzino di 10 µ g/mL di TNFα in media completi e conservare a-20 ° C fino a che pronto per l'uso.</li>
		<li>Fare un 1 µ g/mL lavoro magazzino di TNFα in completa per i media quando si è pronti per trattare le cellule. Serie diluire lo stock di lavoro TNFα 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL e 125 pg/mL in completa per i media. 
		Nota: La concentrazione di TNFα 10 4 pg/ml è moderatamente citotossica. Regolazione delle concentrazioni di TNFα testato dipenderà molto le specifiche delle applicazioni a valle desiderate.</li>
	</ol></li> <li>Trattando le celle con TNFα <ol><li>dopo 24 h di cultura, aspirare la coltura dalle cellule e sostituire con 2 mL di TNFα completati medias per pozzetto in piastre da 6 pozzetti (almeno due pozzi al trattamento e veicolo controllo).</li>
		<li>Dopo 24 h di TNFα-esposizione (48 h della cultura), sostituire i medias TNFα completati con completi media.</li>
	</ol></li> <li>Raccolta di cellule e proteine totali <ol><li>dopo 72 h della cultura (24 h dopo rimozione del TNFα), aspirare media, sciacquare delicatamente le cellule con temperatura ambiente PBS e aggiungere 80 µ l di ghiaccio freddo Radioimmunoprecipitation Assay Tampone (RIPA) contenente appena aggiunto inibitori di proteasi e fosfatasi (tabella 3) direttamente a ciascun pozzetto.</li>
		<li>Rimuovere le celle dalla piastra con un raschietto di cella. Trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, pool di pozzi all'interno di gruppi di trattamento.</li>
		<li>Lisare le cellule nel Vortex i tubi in alto per almeno tre intervalli di 15 s.</li>
		<li>Incubare le cellule a 4 ° C con dondolo per 15 min. 
		Nota: in alternativa, dopo passaggio 3.3.3., le cellule possono essere incubate in ghiaccio per 15 minuti con agitazione intermittente, spostando il tubo, Vortex, o pipettaggio fino e doWN.</li>
		<li>Ripetere il punto 3.3.3.</li>
		<li>Centrifugare le provette a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C a pellet detriti cellulari.</li>
		<li>Transfer il surnatante (contenente proteine cellulari) a un nuovo microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a -80 ° C. 
		Nota: Il protocollo può essere fermato qui e ripreso in un secondo momento. Si consiglia di fare diverse aliquote di campioni di proteina cellulare da evitare più cicli di congelamento-scongelamento.</li>
		<li>Determinare la concentrazione nella proteina totale con un metodo preferito, ad esempio, un saggio di acido bicinconinico (BCA, vedere tabella della forniture essenziali, reagenti e attrezzature, materiale supplementare).</li>
	</ol></li> <li>SDS-PAGE e Western Blotting per Rubicon o proteina di interesse Nota: Segui Western blotting protocolli secondo produttore &#39; s istruzioni utilizzando un sistema di laboratorio preferito.
	Gel <ol><li>carico tra 20-40 µ g di proteine totali nel buffer del campione (tabella 3) per pozzetto su un 12% di acrilammide. Separare le proteine da SDS-PAGE in esecuzione di tampone (tabella 3).</li>
		<li>Wet-trasferimento le proteine dal gel su una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) secondo produttore &#39; s istruzioni in tampone di trasferimento (tabella 3).</li>
		<li>Incubare la membrana in 5% latte in polvere in Buffered Saline con 0.1% Tween 20 (TBST, tabella 3) per almeno 1 h a temperatura ambiente con dondolo.</li>
		<li>Incubare la membrana in un anticorpo primario di Rubicon (Vedi tabella della forniture essenziali, reagenti e attrezzature, materiale supplementare) a 1: 500 a 1% latte in polvere in TBST durante la notte a 4 ° C con dondolo.</li>
		<li>Lavare delicatamente la membrana 3 x 5 min in TBST e 1 x 5 min in TBS a temperatura ambiente con dondolo.</li>
		<li>Incubare la membrana in 1: 2000 - 1: 5000 anticorpo secondario (HRP-collegato o preferito coniugato visibile, vedere tabella della forniture essenziali, reagenti e attrezzature, materiale supplementare) in 5% latte in polvere in TBST per almeno 1 h a temperatura ambiente con dondolo.</li>
		<li>Ripetere la procedura di lavaggio descritta nel passaggio 3.4.5 e visualizzare il blot con un substrato di visualizzazione appropriato (cioè chemiluminescente) su un sistema di imaging.</li>
		<li>Ripetere la procedura di lavaggio descritta nel passaggio 3.4.5 e sonda la membrana per β-actina o un controllo comodo caricamento secondo produttore &#39; istruzioni s.</li>
		<li>Il software di analisi di immagine preferita, analizzare l'espressione di Rubicon da manuale quantificazione dell'assorbanza (intensità di banda), sottrazione dell'assorbanza di fondo e la normalizzazione di carico corrispondente controllo intensità di banda. Eseguire analisi statistiche come appropriato per testare cambiamenti statisticamente significativi nei livelli della proteina.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Yang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autophagy+Regulator+Rubicon+Is+a+Feedback+Inhibitor+of+CARD9-Mediated+Host+Innate+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity.</a> Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).</li>
<li>Zi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rubicon+deficiency+enhances+cardiac+autophagy+and+protects+mice+from+lipopolysaccharide-induced+lethality+and+reduction+in+stroke+volume%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).</li>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La placenta, responsabile della regolazione della crescita del feto, esibisce funzione compromessa in obesi ambiente6. Nonostante le elevate esigenze metaboliche di trofoblasto, placente con l'obesità materna esibiscono disfunzionali respirazione mitocondriale6,19. Cambiamenti nel metabolismo placenta possono contribuire all'aumento di incidenza di complicanze e i risultati fetali avversi osservati in gravidanze obesi3</s...

L'obesità è uno stato infiammatorio caratterizzato da infiammazione cronica, derivante dal tessuto adiposo in eccesso e disponibilità di nutrienti. Nell'obesità, citochine proinfiammatorie sono elevate nei tessuti metabolici così come sistematicamente in circolazione. Un robusto corpo di prova ha dimostrato che TNFα è significativamente elevato nella regolazione dell'obesità con implicazioni in insulino-resistenza e disfunzione metabolica1. Attivazione di TNFα contribuisce alla patogenesi della malattia in condizioni come il cancro e l'autoimmunità, che lo rende un obiettivo terapeutico attraente2.
L'infiammazione nell'obesità è aggravata dalla gravidanza, inoltre, un stato proinflammatory3,4. Precedentemente è stato indicato che placentare TNFα contenuto aumenta con adiposità materna nelle gravidanze con feti di sesso femminile. Inoltre, il trattamento di TNFα inibisce la respirazione mitocondriale nelle cellule del trofoblasto femminile ma non male, suggerendo che il TNFα è coinvolto nella regolazione del metabolismo placenta in un modo sessualmente dimorphic5. L'obesità materna è associata con l'incidenza aumentata di una varietà di complicazioni durante la gravidanza, tra cui il feto nato morto, con feti maschi, essendo il più suscettibile3,6,7,8 . Dovuto il relativo ruolo chiave a livello di interfaccia materno-fetale, cambiamenti nella capacità funzionale della placenta nell'ambiente intrauterino obeso in risposta alla segnalazione infiammatoria possono svolgere un ruolo importante nel mediare gli esiti delle gravidanze obesi.
Cytotrophoblasts e syncytiotrophoblasts nel tessuto dei villi della placenta sono fondamentali per la segnalazione endocrina e scambio di nutrienti e ossigeno tra la madre e sviluppo feto9. Interruzioni nella capacità funzionale di villous cytotrophoblasts (in appresso denominato trofoblasto) possono compromettere lo sviluppo e la salute del feto. Questo protocollo descrive un metodo per il campionamento del tessuto dei villi della placenta umana a termine distanza dissezionando le piastre corioniche e basale insieme a una procedura ottimizzata per l'isolamento di trofoblasti per colture cellulari primarie. Questo protocollo è derivato da metodologie consolidate che coinvolgono digestione enzimatica del tessuto villous di rilasciare cellule dalla matrice extracellulare seguita da centrifugazione differenziale densità per isolare trofoblasti10, 11,12. Questo dettagli del protocollo un approccio in cui primari trofoblasti da placente da gravidanze magre sono trattati con mezzi di coltura completati con TNFα per simulare un componente del milieu infiammatorio associato con l'obesità materna. Infine, è descritta una procedura semplice per la raccolta lisati cellulari totali dal trofoblasto TNFα-trattati, seguita da Western blotting per rilevare i cambiamenti nell'espressione genica.
Mentre questo modello non ricapitolare obesogenico nell'utero ambiente nella sua interezza, esso fornisce un sistema controllato che permette di analizzare il contributo individuale di TNFα-mediata di infiammazione in risposta dei trofoblasti a obesità materna. Questo modello offre sia l'opportunità di scoprire o confermare bersagli molecolari direttamente disciplinate dal TNFα segnalazione nel trofoblasto, nonché permette di verificare se i cambiamenti nel pattern di espressione genica osservati in vivo in placente con materna l'obesità può essere un risultato di infiammazione TNFα-mediata.
L'approccio qui descritto è stato implementato per testare l'effetto di infiammazione TNFα-mediata sulla regolazione dell'autofagia nel trofoblasto umano. Trofoblasto da obese gravidanze con feti di sesso maschile Mostra perturbato autofagica fatturato o autofagosoma maturazione13. Una proteina chiamata Rubicon (RUN dominio proteina d'interazione Beclin1 e ricche di cisteina contenente), che è localizzato per i lisosomi e late endosomes, recentemente è stata descritta come un "freno" nel processo di autofagia fatturato perché funziona come un negativo regolatore di autofagosoma maturazione14,15. Infatti, il Rubicon è un raro esempio di una proteina che trattiene l'autofagia, che lo rende un prezioso obiettivo terapeutico. Poche informazioni sono disponibili circa il significato patofisiologico di Rubicon, fatta eccezione per i suoi ruoli nella risposta immunitaria innata a microbials16,17 e del cardiomyocyte protezione18. Mediante il protocollo descritto qui, si è constatato che il Rubicon è upregulated nel trofoblasto femminile primario in risposta al trattamento con aumento delle concentrazioni di TNFα fino a 250 pg/mL. Il regolamento di Rubicon può svolgere un ruolo in come femmina feti tariffa migliore rispetto ai maschi nelle gravidanze con l'obesità materna. Ricapitolando l'infiammazione associata con l'obesità materna ex vivo esponendo trofoblasto umano di TNFα esogena fornisce una piattaforma per studiare l'impatto dell'ambiente intrauterino obeso sulla regolamentazione dei percorsi critici in trofoblasto e, per estensione, la funzione placentare.

<table><tbody><tr><td>10X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (anhyd.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (anid.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS002139</tr><tr><td>Inibitori della proteasi/fosfatasi</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>88668</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-600</td><td></td></tr><tr><td>Sodio desossicolato.</td><td>Fisher Scientific AAJ6228822</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco' modificato s Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero neonatale per vitelli (NCS)</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (Pen/Streptomica)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-427-098</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alfa;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3177-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td></td></tr><tr><td>K2EDTA Provette per prelievo di sangue vacutainer</td><td>BD</td><td>366450</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (Density Gradient Media, DGM)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Provette Safe-Lock 2,0 mL, naturali</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658033</td><td></td></tr><tr><td>TGX FastCast Acrilammide Kit, 12% </td><td>Bio-Rad</td><td>1610175</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean 3 Camera di Multi-Colata</td><td>Bio-Rad</td><td>1654112</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli Tampone per campioni</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Latte secco scremato istantaneo</td><td>Garofano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubicon (D9F7) Tecnologia</td><td>di segnalazione cellulare</td> mAb di coniglio <td>8465S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-&beta;-actina prodotto nel topo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228-100UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coniglio IgG, tecnologia</td><td>di segnalazione cellulare</td> anticorpo legata a HRP <td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-topo, anticorpo</td> <td>legato a HRPTecnologia di segnalazione cellulare</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Substrato chemiluminescente</td><td>Thermo Scientific</td><td>34578</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella placenta

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

L'obesità materna è associata con un rischio aumentato di esiti perinatali negativi che sono probabilmente mediati da compromissione della funzione placentare che può essere attribuito, in parte, la disregolazione dell'autofagia. Aberrante cambiamenti nell'espressione di regolatori dell'autofagia in placente da gravidanze obese possono essere regolati tramite i processi infiammatori connessi con l'obesità e la gravidanza. Un protocollo per il campionamento del tessuto villous e isolamento di cytotrophoblasts dei villi della placenta umana a termine per colture cellulari primarie è descritto qui. Questa è seguita da un metodo per simulare il milieu infiammatorio nell'ambiente intrauterino obeso trattando trofoblasti primari da magre gravidanze con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF), una citochina proinflammatory che è elevata nell'obesità e nella gravidanza. Attraverso l'implementazione del protocollo descritto qui, è trovato che l'esposizione a esogeno TNFα regola l'espressione di Rubicon, un regolatore negativo dell'autofagia, nel trofoblasto da magre gravidanze con feti di sesso femminile. Mentre una varietà di fattori biologici nell'ambiente intrauterino obeso mantenere il potenziale di modulare le vie critiche nel trofoblasto, questo sistema ex vivo è particolarmente utile per determinare se espressione modelli osservata in vivo in placente umane con l'obesità materna sono un risultato diretto di TNFα segnalazione. In definitiva, questo approccio offre l'opportunità di analizzare le implicazioni normative e molecolare di infiammazione associata con l'obesità materna su autophagy e su altre vie cellulari critici nel trofoblasto che hanno il potenziale di impatto funzione placentare.

Termine le placente umane dal magro (pre-gravidanza massa corporea (BMI) &lt; 25) le madri con gravidanze semplici che trasportano prole femminile sono stati raccolti e campionate entro 15 minuti di consegna dalla sezione cesarean (non lavoro). Le placente sono state esaminate per l'assenza di calcificazioni e sviluppo tipico: peso compreso tra 300-600 g con il cordone ombelicale e membrane rimosse, rotondo in forma, tra 15-25 cm di diametro e inserito nel mezzo del cordone ombelicale la ...

Presentato qui è un protocollo per il campionamento del tessuto villous placenta umano seguito da isolamento di cytotrophoblasts per colture cellulari primarie. Trattamento del trofoblasto con TNFα ricapitola l'infiammazione nell'ambiente intrauterino obeso e facilita la scoperta di bersagli molecolari regolati da infiammazione in placente con l'obesità materna.

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

L'obiettivo generale di questo modello di coltura cellulare del trofoblasto è misurare l'effetto dell'infiammazione correlata all'obesità sulla regolazione delle vie critiche nei trofoblasti. Il vantaggio principale di questo sistema di controllo è che stabilisce una relazione tra l'infiammazione mediata dal TNF alfa e la regolazione genica nella placenta nel contesto dell'obesità materna. Il vantaggio principale di questo sistema sperimentale è che stabilisce relazioni tra l'infiammazione mediata dal TNF-alfa e la regolazione genica nella placenta nel contesto dell'obesità materna.A dimostrare la procedura saranno Bailey Simon e Matt Bucher, tecnici del mio laboratorio. Il tessuto villoso deve essere prelevato dalla placenta il prima possibile dopo il parto, preferibilmente in 30 minuti o meno. Con la placca corionica rivolta verso l'alto, usa una pinza e delle forbici per asportare, a caso, due o tre sezioni a tutto spessore, a due o tre centimetri dalla periferia della placenta.Evitare le parti della placenta che appaiono anormali. Taglia via le placche coriali e basali e tutti i vasi sanguigni di grandi dimensioni. Posizionare il tessuto villoso risultante in un terreno caldo e

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In questo protocollo, si descrive la dissezione placentae dal mouse sulla gravidanza D10.5, seguito da isolamento di cellule trofoblastiche mediante gradiente di Percoll. Abbiamo poi dimostrare l'utilizzo delle cellule isolate in un saggio di invasione Matrigel.

Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto

Questo manoscritto presenta un modello unico in vitro di cellule di citotrofoblasto villoso umano immunopurificate coltivate in ipossia/riossigenazione. Questo modello è adatto per studiare gli effetti protettivi di trattamenti promettenti, come la melatonina, sulle complicanze della gravidanza associate all'aumento dello stress ossidativo e all'alterazione della funzione placentare.

Umana Trophoblast primaria coltura cellulare modello per studiare gli effetti protettivi della melatonina contro ipossia / riossigenazione Disruption-indotta

Questo protocollo consente un ricercatore di isolare e caratterizzare residente in tessuto hallmark macrofagi in vari tessuti infiammati estratte dai modelli indotta da dieta di disordini metabolici.

Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

Qui, presentiamo un protocollo altamente accessibile per valutare il movimento delle cellule in cellule del trofoblasto umano utilizzando tre saggi in vitro: l'analisi di gratta e Vinci, l'analisi di invasione di transwell e l'analisi di proliferazione delle cellule.

Test in Vitro per valutare la migrazione, invasione e la proliferazione di linee cellulari immortalizzate umano primo-acetonide Trophoblast

Abbiamo sviluppato un modello di corioamionite per simulare l'esposizione fetale all'infiammazione materna (FEMI) senza complicazioni di organismi vivi per esaminare gli effetti del FEMI sullo sviluppo del tratto intestinale della prole. Ciò consente lo studio delle cause meccaniche per lo sviluppo di lesioni intestinali a seguito della corioamionite.

Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

Qui viene presentato un protocollo per fornire oligonucleotidi come RNA a piccola interferenza (siRNA), imitazioni di micro-RNA (miR) o anti-micro-RNA (anti-miR) in adipociti maturi per modulare l'espressione di proteine e micro-RNA.

Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti

Ecco un protocollo per la coltura di espianti placentari in condizioni di flusso costante. Questo approccio migliora i tradizionali sistemi di coltura statica dei villi consentendo la replicazione di ambienti fisiologici dinamici.

Ex Vivo Coltura a flusso di espianto placentare - Imitazione delle condizioni dinamiche in utero

Questo protocollo consente la purificazione, la caratterizzazione e la coltura dei trofoblasti extravillosi primari HLA-G+ (EVT) dalla decidua basali e dalla membrana corionica delle placente a termine umane. Le colture primarie di EVT mantengono la vitalità per 96 ore, permettendo la co-coltura con cellule immunitarie materne abbinate a campioni e la successiva analisi citometrica e molecolare del flusso delle loro interazioni.

Purificazione di trofoblasti extravillosi HLA-G+ da tessuti placentari a termine umani per fenotipizzazione e analisi funzionale

Utilizzando un modello ex vivo di espianti, piccoli pezzi della porzione rostrale del tessuto adiposo bianco viscerale di topi magri vengono coltivati per 7–10 giorni, permettendo l'induzione e lo studio dell'infiammazione del tessuto adiposo durante l'alimentazione ricca di grassi.

Un modello topino ex vivo per l'infiammazione del tessuto adiposo ad alto contenuto di grassi

Descriviamo un modello murino del disturbo post traumatico da stress (PTSD) che rivela le alterazioni persistenti della funzione neuroendocrina e del ritardato a lungo termine, di risposta paura esagerata, caratteristici dei pazienti con PTSD. Il modello animale e metodi descritti qui sono utili per correlare biomarcatori nei nuclei del cervello, che sono meccanicistica ma non possono essere misurati nei pazienti, con biomarcatori nelle periferie globuli bianchi, che può.

Biomarcatori in un modello animale per Rivelare correlati neurali, ematologiche, e comportamentali di PTSD

Impara a isolare trofoblasti primari da tessuto villoso placentare umano per studiare l'effetto dell'infiammazione mediata da TNFα sulla regolazione genica. Questo modello aiuta a comprendere le disfunzioni placentari legate all'obesità materna.

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare leffetto di infiammazione associata con lobesità materna sulla regolazione dellautofagia nella Placenta (Video) | JoVE Journal

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

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