Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

L'obiettivo generale di questo modello di coltura cellulare del trofoblasto è misurare l'effetto dell'infiammazione correlata all'obesità sulla regolazione delle vie critiche nei trofoblasti. Il vantaggio principale di questo sistema di controllo è che stabilisce una relazione tra l'infiammazione mediata dal TNF alfa e la regolazione genica nella placenta nel contesto dell'obesità materna. Il vantaggio principale di questo sistema sperimentale è che stabilisce relazioni tra l'infiammazione mediata dal TNF-alfa e la regolazione genica nella placenta nel contesto dell'obesità materna.

A dimostrare la procedura saranno Bailey Simon e Matt Bucher, tecnici del mio laboratorio. Il tessuto villoso deve essere prelevato dalla placenta il prima possibile dopo il parto, preferibilmente in 30 minuti o meno. Con la placca corionica rivolta verso l'alto, usa una pinza e delle forbici per asportare, a caso, due o tre sezioni a tutto spessore, a due o tre centimetri dalla periferia della placenta.

Evitare le parti della placenta che appaiono anormali. Taglia via le placche coriali e basali e tutti i vasi sanguigni di grandi dimensioni. Posizionare il tessuto villoso risultante in un terreno caldo e completo.

Entro 30 minuti dal campionamento del tessuto villoso, iniziare l'isolamento del trofoblasto. Posizionare ogni pezzo di tessuto villoso in una provetta conica da 50 millilitri riempita con PBS a temperatura ambiente e agitare delicatamente per rilasciare il sangue in eccesso nel tessuto. Decantare il PBS e sostituirlo con un PBS nuovo.

Ripetere il risciacquo PBS fino a rimuovere la maggior parte del sangue in eccesso. Il risciacquo PBS sarà rosso chiaro o rosa quando il fazzoletto viene risciacquato accuratamente. Posizionare il tessuto villoso in una capsula di Petri sterile e rimuovere il maggior numero possibile di vasi sanguigni utilizzando un vetrino da microscopio per raschiare delicatamente il tessuto molle villoso dai vasi.

Usando le forbici, tritare finemente il tessuto villoso risultante. Trasferire il tessuto villoso tritato in un flacone sterile con soluzione digestiva secondo i volumi calcolati in base all'attività specifica della tripsina e della DNasi. Incubare il flacone per la digestione in un bagnomaria a 37 gradi Celsius agitando a 70 giri/min per 35 minuti.

Dopo 35 minuti, inclinare la bottiglia di digestione su un lato e lasciare che i pezzi di tessuto non digeriti si depositino sul fondo della bottiglia. Aspirare con cura il surnatante con una pipetta sierologica, evitando che il tessuto si depositi. Erogare il surnatante attraverso un filtro cellulare da 100 micron in modo uniforme tra provette coniche da 50 millilitri.

Iniziare la seconda digestione aggiungendo la soluzione digestiva al tessuto sedimentato rimanente e incubando la bottiglia nel bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Stratificare delicatamente da tre a cinque millilitri di siero per vitelli neonati, o NCS, sotto il surnatante filtrato dalla prima digestione erogandolo lentamente da una pipetta sierologica sul fondo del tubo. Dovrebbe essere visibile un menisco tra il surnatante filtrato contenente il trofoblasto e la NCS.

Centrifugare i surnatanti su NCS a 1, 250 volte g a 20 gradi Celsius per 15 minuti. Il pellet risultante includerà globuli rossi nello strato più basso, seguiti da uno strato bianco contenente cellule del trofoblasto. Allo stesso modo, filtrare il surnatante dalla seconda e terza digestione.

Stratificare l'NCS sotto il surnatante filtrato e centrifugare a 1.250 volte g a 20 gradi Celsius per 15 minuti. Una volta che tutti i surnatanti sono stati centrifugati e gli strati di NCS e surnatante rimossi, sospendete nuovamente ogni pellet in cinque millilitri di terreno caldo e completo e poi raggruppate le sospensioni. Dividere equamente la sospensione cellulare tra due provette coniche da 50 millilitri e centrifugare a 1.250 volte g a 20 gradi Celsius per 15 minuti.

Rimuovere delicatamente il surnatante e risospendere ciascuno dei pellet cellulari in sei millilitri di terreno caldo e completo. Per iniziare questa procedura, dividere equamente la sospensione cellulare tra quattro gradienti di densità utilizzando una pipetta di trasferimento per sovrapporre lentamente e con attenzione la sospensione cellulare sopra i gradienti di densità. Centrifugare i gradienti di densità a 1, 250 volte g a 20 gradi Celsius per 20 minuti con accelerazione e decelerazione minime.

Questo dovrebbe produrre bande distinguibili di cellule sedimentate. Rimuovere lentamente e con attenzione lo strato superiore del gradiente di densità fino a raggiungere la banda opaca contenente le celle del trofoblasto. Trasferire le bande di trofoblasto in due provette coniche da 50 millilitri e riempire con un terreno caldo e completo.

Capovolgere delicatamente le provette da tre a sei volte per mescolare e centrifugare a 1.250 volte g a 20 gradi Celsius per 15 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet di cella in cinque millilitri di terreno caldo e completo. Combinare le sospensioni cellulari e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e il blu di tripano.

Il passo successivo dopo il conteggio delle cellule consiste nel piastrare. Piastra tre milioni di cellule per pozzetto in ogni piastra a sei pozzetti. Agitare delicatamente la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro per distribuire uniformemente le cellule.

Lasciare le cellule placcate nello sfiato a flusso laminare per circa 30 minuti per consentire alle cellule di distribuirsi uniformemente, depositarsi e iniziare ad aderire al fondo dei pozzetti. Dopo 30 minuti, posizionare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità. Esaminare il trofoblasto al microscopio dopo 24 ore di coltura per confermare l'attaccamento e la corretta morfologia del trofoblasto.

Le cellule possono essere trattate dopo 24 ore di coltura. Aspirare il terreno di coltura dalle cellule e sostituirlo con due millilitri di terreno integrato con TNF alfa per pozzetto. Rimetti le piastre nell'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Dopo 24 ore di esposizione al TNF alfa, sostituire il terreno integrato con TNF alfa con un terreno completo. Incubare per altre 24 ore. 24 ore dopo la rimozione del TNF alfa, aspirare il terreno e sciacquare delicatamente le cellule con PBS a temperatura ambiente.

Aggiungere direttamente a ciascun pozzetto 80 microlitri di tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione a freddo ghiacciato contenente inibitori della proteasi e della fosfatasi appena aggiunti. Rimuovere le celle dalla piastra con un raschietto per cellule. Trasferire le cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri, raggruppando i pozzetti all'interno dei gruppi di trattamento.

Ghiacciare le cellule facendo vorticare i tubi in alto per almeno tre intervalli di 15 secondi. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius con dondolo per 15 minuti. Agitare nuovamente i tubi in alto.

Centrifugare a 10.000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per pellettare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Conservare i campioni di proteine cellulari a 80 gradi Celsius fino all'analisi mediante Western blotting per la proteina di interesse.

Dopo 72 ore di coltura, l'analisi immunocitochimica della citocheratina 7, mostrata in rosso, nei trofoblasti primari conferma che le cellule sono state sottoposte a sincizializzazione evidenziata dalla presenza di masse cellulari multinucleate. Inoltre, l'analisi immunocitochimica della vimentina, anch'essa in rosso, ha rivelato pochissimi fibroblasti contaminanti. La controcolorazione nucleare è mostrata in blu in entrambe le immagini.

Trattamento con TNF alfa fino a 250 picogrammi per millilitro di espressione di rubicone up-regolata. A concentrazioni di TNF alfa superiori a 250 picogrammi per millilitro, i livelli di espressione del rubicon sono diminuiti verso il basale e anche al di sotto. Allo stesso modo, il rubicio è significativamente sovraregolato nelle biopsie di tessuto villoso congelate in flash da placente da gravidanze obese con feti femminili rispetto ai controlli magri.

Una volta padroneggiato, l'isolamento del trofoblasto dal tessuto villoso può essere eseguito in sei-sette ore se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante preparare i materiali e i reagenti in anticipo in modo da poter lavorare in modo deliberato ed efficiente. Seguendo questa procedura, altri test, come quelli che misurano la bioenergetica cellulare, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio l'infiammazione nell'ambiente intrauterino obeso influisce sulla capacità metabolica dei trofoblasti?

Successivamente, questo metodo di sviluppo ha aperto la strada ai ricercatori placentari per stabilire l'effetto dell'ambiente materno sulla funzione del trofoblasto. Dopo aver visto questo video avrai una buona comprensione di come isolare i trofoblasti dal tessuto villoso per il tuo esperimento di coltura cellulare e come determinare l'effetto dell'infiammazione mediata dal TNF alfa nella regolazione delle vie critiche nei trofoblasti. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani, cellule in coltura, DMSO, acrilammide e reagenti riducenti può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare DPI adeguati e utilizzare una tecnica asettica.