Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

L'obiettivo generale di questo test è osservare l'effetto dell'infezione fungina nell'organismo modello C.Elegans. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande meccanicistiche chiave nel campo delle malattie infettive, come i fattori di virulenza dei patogeni, gli effettori immunitari dell'ospite e la scoperta di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un sistema trattabile sperimentalmente per studiare le interazioni ospite-patogeno da entrambi i punti di vista.

È un sistema veloce, facile ed economico. Sebbene questo particolare metodo possa fornire informazioni sui patogeni fungini, può essere applicato anche ad altri agenti infettivi, come batteri o persino più organismi, per studiare le interazioni microbiche in un ospite vivo. Per fare un plettro a vite senza fine, taglia un pezzo di filo di alluminio di 1,5 centimetri, quindi inserisci con cura circa 0,5 centimetri di filo nella punta di una pipetta pasteur.

Utilizzando un bruciatore Bunsen o una lampada ad alcool, fondere il puntale della pipetta in vetro ruotandolo lentamente nella fiamma fino a quando il filo non aderisce saldamente alla pipetta senza compromettere la forma originale del puntale della pipetta. Infine, usando una pinza, piega con cura l'estremità del filo per creare un piccolo anello. Per trasferire rapidamente grandi quantità di vermi su nuove piastre, utilizzare una spatola per tagliare un pezzo di agar NGM contenente i vermi selezionati.

Quindi rimuovere il pezzo tagliato e posizionarlo a faccia in giù sul bordo del cerotto di OP50 su una nuova piastra. Per trasferire i vermi singolarmente, fiammare il filo nel plettro fino a renderlo rosso, quindi rimuoverlo dalla fiamma e lasciarlo raffreddare per alcuni secondi. Usando il filo sul plettro, raschiare delicatamente il cerotto della coltura OP50 cresciuta sulla nuova piastra, coprendo il filo sul plettro.

La coltura viscosa che copre la punta del filo fa sì che i vermi si attacchino alla punta del nocciolo. Quindi usa un movimento di scorrimento per raccogliere delicatamente i vermi selezionati. Una volta raccolti, i vermi selezionati li posiziona su un nuovo piatto facendo scorrere delicatamente la coltura sull'agar.

Quindi posizionare il filo nella fiamma per rimuovere la coltura rimanente sul plettro. Posizionare circa 20 animali adulti raccogliendoli o tagliandoli a pezzi su un piatto con 50 microlitri di E.coli ceppo OP50. Per raccogliere le uova dopo uno o due giorni, inondare la piastra con 10 millilitri di tampone M9.

Quindi, utilizzando una pipetta sierologica di vetro, agitare delicatamente il contenuto sulla piastra di agar per rilasciare gli animali adulti o le uova attaccate a OP50. Raccogli tutto il liquido contenente le uova e gli adulti. Trasferire la soluzione M9 e OP50 in una provetta conica da 15 millilitri.

Centrifugare la provetta a 2,100 x g per due minuti. Quindi aspirare circa nove millilitri di surnatante senza disturbare il pellet. Quindi, utilizzare due millilitri di acqua sterile, un millilitro di candeggina e un millilitro di idrossido di sodio molare 0,25 per risospendere il pellet.

Mescolare delicatamente per inversione fino a quando circa il 70% degli animali adulti appare lisato. In genere le uova rimangono intatte durante questo breve trattamento di candeggina a causa del loro guscio. È fondamentale che la quantità di esposizione alla candeggina sia limitata in questa fase.

L'esposizione prolungata alla candeggina distruggerà le uova. Se la preparazione delle uova non riesce, limitare la durata dell'esposizione alla candeggina o diluire la soluzione. Centrifugare la provetta conica a 990 x g per due minuti.

Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi risospendere il pellet in 10 millilitri di tampone M9. Dopo aver girato di nuovo e rimosso il surnatante senza disturbare il pellet, utilizzare 200 microlitri di tampone M9 per risospendere il pellet.

Erogare da tre a cinque millilitri di YPD in una provetta sterile e utilizzare un ansa sterile per inocularla con una singola colonia di Candida albicans. Posizionare il tubo su un tamburo rotante a 30 gradi Celsius per circa 16-18 ore. Etichettare un tubo microfuge da 1,5 millilitri per contenere C.albicans e un altro per contenere OP50, quindi registrare il peso di ciascun tubo vuoto.

Trasferire 500 microlitri di coltura notturna di C.albicans nella provetta etichettata con C.Albicans. E 1500 microlitri della coltura OP50 durante la notte nella provetta etichettata OP50. Centrifugare le provette per 10 minuti a 16, 100 x g, quindi aspirare il surnatante senza disturbare i pellet.

Utilizzare 500 microlitri di acqua sterile per risospendere ogni pellet. Quindi centrifugare le provette a 16, 100 x g per cinque minuti. Aspirare il surnatante senza disturbare i pellet.

Quindi registrare il peso finale dei tubi di microfuga. Determinare il peso di ogni pallino sottraendo il peso iniziale dei tubi di microfuga dal peso finale. Utilizzando acqua sterile, risospendere il pellet di C.albicans a 10 milligrammi per millilitro e il pellet OP50 a 20 milligrammi per millilitro.

Quindi preparare una miscela di infezione principale combinando 10 microlitri di una soluzione da 50 milligrammi per millilitro di streptomicina, 2,5 microlitri di coltura OP50, 0,5 microlitri di coltura di C.Albicans e 7 microlitri di acqua sterile.

Per le piastre di controllo, creare una miscela master sostituendo il volume della coltura di C.albicans con acqua sterile. Quindi utilizzare una micropipetta per seminare 20 microlitri di miscela per l'infezione o soluzione di controllo OP50 al centro delle piastre NGM. Dopo aver preparato le uova come mostrato in precedenza in questo video, contare le uova sotto l'oscilloscopio di dissezione.

E usa M9 per diluire la soluzione di uova fino a raggiungere una concentrazione di circa cinque o sei uova sane per microlitro. Utilizzando una pipetta, erogare un campione da 20 microlitri contenente circa 30 uova su una piastra NGM preparata nell'area tra la coltura batterica e il lato della piastra. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per 48 ore.

Quindi, al microscopio da dissezione, contare il numero di vermi adulti vivi e morti su ciascuna piastra, considerando l'animale morto se non risponde all'essere picchiettato sulla testa da un filo di alluminio o picchiettando la piastra. Conta anche il numero di vermi con Dar e conferma se un animale ha Dar picchiettando rapidamente la piastra sul tavolino del microscopio di dissezione.

Gli animali senza Dar si sposteranno immediatamente all'indietro, mentre gli animali con Dar avranno bisogno di ripetuti giri di tocchi per invertire la loro direzione o non lo faranno affatto. A giorni alterni, trasferisci i vermi adulti rimanenti raccogliendo i vermi su una nuova piastra di infezione o di controllo. A questo punto, se necessario, eseguire un test di sopravvivenza monitorando il numero di vermi vivi, morti e mancanti ogni giorno.

È importante trasferire i vermi almeno a giorni alterni. Ciò garantisce che i vermi adulti che vengono valutati in questo test non vengano confusi nella loro progenie. C.elegans è stato esposto a C.albicans per un periodo di sei giorni e osservato per segni di infezione, progressione della malattia e morte.

Il fenotipo Dar è più visibile entro il quarto giorno del test di sopravvivenza, come notato da una regione anale sporgente che non è visibile nell'animale non infetto. I vermi infettati da C.albicans sono anche noti per mostrare gonfiore nella regione della vulva. In entrambi i casi, il verme non è in grado di eliminare l'infezione dopo aver raggiunto questo stadio.

Al fine di visualizzare la colonizzazione di C. albicans nel lume intestinale, i vermi sono stati alimentati con C. albicans selvatico marcato con RFP che causa la fluorescenza delle aree di colonizzazione. C.albicans colonizza il lume intestinale entro il terzo giorno del test. Come mostrato qui, i vermi infetti hanno mostrato una distensione intestinale più grave di quella osservata nel controllo non infetto.

In questo esperimento, è stata testata la capacità dei vermi di sopravvivere all'infezione causata dal doppio mutante virulento C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. I vermi infettati dal doppio mutante vivono statisticamente significativamente più a lungo dei controlli. Suggerendo che questi due geni sono necessari per la virulenza di C.albicans contro C.Elegans.

Una volta padroneggiata, ogni parte di questa tecnica può essere eseguita in una o due ore al giorno della durata della vita del verme. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che si potrebbe usare agenti infettivi. Pertanto, dovrebbero essere praticate adeguate precauzioni di biosicurezza.

È possibile apportare piccole modifiche a questa procedura di base, come l'introduzione di agenti microbici aggiuntivi per studiare le interazioni microbiche nel contesto di un ospite vivo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie infettive per esplorare la virulenza microbica, i meccanismi delle risposte immunitarie innate dell'ospite e la scoperta di nuovi agenti antimicrobici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come mantenere e manipolare C.Elegans e utilizzare l'organismo per studiare le interazioni dei microbi ospiti a livello molecolare.

Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni microbici e reagenti chimici, come l'azide di sodio, può essere pericoloso e dovrebbero essere impiegate precauzioni di sicurezza appropriate come DPI e metodi di smaltimento dei rifiuti.