Name: Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Scopri come utilizzare Caenorhabditis elegans come modello versatile per studiare interazioni ospite-microbo, in particolare infezioni fungine. Questo metodo permette di analizzare virulenza patogena e risposte immunitarie in vivo.

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Quest'opera è stata eseguita presso e supportata da Worcester Polytechnic Institute.

1. preparazione del Nematode crescita medio (NGM) <ol><li>per 1 L di media, unire 20 g di agar, fonte di azoto organico 2,5 g (ad es., bacto-peptone) e 3 g di cloruro di sodio in un pallone da 2 L. Aggiungere 975 mL di acqua sterile.
	<ol><li>Aggiungi in un ancoretta sterile. Se si utilizza un versatore automatico dei supporti, la tubazione di autoclave e la media per 15 min; media dovrebbe essere sterilizzato nell'autoclave per più se viene effettuato un volume più alto.</li>
	</ol></li> <li>Impostare media sulla piastra di mescolare e lasciare per raffreddare.
	<ol><li>Una volta media è calda al tatto in modo asettico (circa 60 ° C) aggiungere 1 mL di 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL di 1 M CaCl 2, 25 mL di KPO 4 e 1 mL di colesterolo di 0,5% in etanolo.</li>
		<li>Versare media (a mano, o di pompa automatica) sotto flusso laminare in 35 x 10 mm Petri sterili. Lasciare per asciugare sotto cappa per 1-2 giorni prima dell'uso. 
		Nota: Piastre devono essere conservate a 4 ° C per evitare la contaminazione.</li>
	</ol></li></ol> 2. Facendo un Worm Pick <ol><li>tagliare un pezzo di filo di alluminio 1,5 cm. Inserire la punta di una pipetta di Pasteur attentamente circa 0,5 cm di questa lunghezza.
	<ol><li>Utilizza un bruciatore di Bunsen o lampada dell'alcool, sciogliere la punta della pipetta di vetro ruotandolo lentamente nella fiamma fino a quando il filo è rispettato in modo sicuro la pipetta, senza compromettere la forma originale della punta della pipetta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Preparazione della cultura di e. coli <ol><li>con un'ansa sterile, inoculare singola colonia di e. coli ceppo OP50 in 200 mL di brodo di Luria. Incubare per una notte con agitazione a 37 ° C.</li>
	<li>La coltura liquida è pronta per l'uso il giorno seguente e possono essere conservata a 4 ° C quando non in uso. 
	Nota: Il ceppo di e. coli, OP50, viene utilizzato come una fonte di cibo per elegans del c. Questa cultura può essere utilizzata per fino a diversi mesi se conservato a 4 ° C.</li>
</ol> 4. Essenziale di c. elegans manutenzione <ol><li>seme preparato piatti di agar NGM con e. coli individuando circa 50-100 µ l di preparati OP50 coltura liquida al centro del piatto.</li>
	<li>Piastre di copertura e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per 24 h. Una volta asciutto, posizionare le piastre a 37 ° C durante la notte per una crescita rapida o conservare a temperatura ambiente, se non si desidera una crescita più lenta.</li>
	<li>Aggiungere vermi alla piastra da uno &#34; chunking, &#34; (Vedi protocollo passo 5 &#34; Chunking e Picking worm &#34;), picking vermi individualmente o disporre le uova di verme direttamente sulla piastra (Vedi protocollo passo 6 &#34; uovo preparazione &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking e Picking worm Nota: &#34; Chunking, &#34; si riferisce ad una pratica che è comune nella manutenzione di c. elegans. Si tratta di taglio di una sezione della piastra di agar NGM che contiene worm e trasferendo questo pezzo su un piatto nuovo, trasferendo così anche un gran numero di vermi nel processo. Contaminazione può anche essere tagliato fuori il piatto in questo modo. Quando la raccolta vermi, è importante mantenere l'integrità dell'agar perché vermi possono essere perso in fori nell'agar. Inoltre, è importante consentire il prelievo si raffreddi prima di toccare la piastra per evitare che l'agar di fusione o bruciare i vermi.
<ol><li>Al fine di trasferire rapidamente grandi quantità di vermi sulle nuove piastre, tagliare un pezzo di agar NGM contenente i vermi selezionati utilizzando una spatola. Rimuovere il pezzo tagliato e appoggiarlo sul bordo del prato di OP50 su un piatto nuovo.</li>
	<li>Trasferimento worm singolarmente, come descritto di seguito nel passaggio di protocollo 8.2, &#34; analisi di sopravvivenza, &#34; usando un verme pick. Fiamma il filo nel verme prendere fino a quando è rosso. Rimuoverlo dal fuoco e lasciarla raffreddare per pochi secondi.</li>
	<li>Utilizzando il filo nel prelievo, raschiare delicatamente il prato della cultura OP50 coltivata sulla nuova piastra, che copre il filo nel prelievo.</li>
	<li>La cultura viscosa che copre la punta del filo rende worm bastone fino alla punta del plettro, così delicatamente raccogliere vermi selezionati usando un movimento swiping.</li>
	<li>Una volta selezionati vermi sono raccolte, metterli su un piatto nuovo scorrendo delicatamente coltura agar. Posizionare il filo in fiamma per rimuovere cultura rimanente nel prelievo.</li>
</ol> 6. Preparazione di uova <ol><li>posto circa 20 animali adulti (circa 2-3 giorni dopo la schiusa, quando coltivate a 20 ° C) da prelievo o suddivisione in blocchi come descritto nel protocollo passaggio 5, &#34; Chunking e Picking worm, &#34; su un piatto seminato con 50 µ L di e. coli ceppo, OP50.</li>
	<li>Per raccogliere le uova, inondare la piastra con 10 mL di buffer di M9 dopo 1-2 giorni. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro, turbolenza e agitare delicatamente il contenuto sulla piastra di agar a rilasciare le uova attaccate alla OP50 o animali adulti. Raccogliere tutto il liquido che contiene le uova e gli adulti.</li>
	Tubo di <li>trasferire M9 e OP50 soluzione in un 15 mL conico. Centrifugare la provetta conica da 15 mL a 2.100 x g per 2 min.</li>
	<li>Aspirare circa 9 mL di surnatante senza disturbare il pellet OP50.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 2 mL di acqua sterile, 1 mL di candeggina e 1 mL di NaOH di 0.25 M.</li>
	<li>Mescolare delicatamente capovolgendo fino a quando la maggioranza (circa il 70 per cento) di animali adulti appaiono lisata; in genere, le uova rimangono intatte durante questo trattamento breve candeggina a causa delle loro coperture. Centrifugare la provetta conica a 990 x g per 2 min.</li>
	<li>Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 10 mL di buffer di M9.</li>
	<li>Centrifugare la provetta conica in 990 x g per 2 min. aspirare il surnatante senza pellet inquietante. Risospendere il pellet con 200 µ l di tampone di M9. 
	Nota: Preparazione uovo può richiedere prove multiple. Le uova possono essere distrutte se sono esposti per candeggiare per troppo tempo. Se non si schiudono le uova, o diminuire la concentrazione di candeggina in soluzione o diminuire la durata dell'esposizione alla candeggina.</li>
</ol> 7. Set-up piatto infezione <ol><li>dispensare 3-5 mL di YPD in una provetta sterile e inoculare esso con una singola colonia di Candida albicans con un'ansa sterile.
	<ol><li>Posizionare il tubo su un tamburo rotatorio per circa 16-18 h a 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Etichetta uno 1,5 mL microfuge tubo per contenere i albicans del c. e un altro per contenere OP50. Registrare il peso di ogni provetta vuota.
	<ol><li>Posto 500 µ l del pernottamento albicans del c. cultura nella provetta etichettata albicans del c. e 1.500 µ l della cultura OP50 durante la notte (dal punto 3.1) nella provetta etichettata OP50.</li>
		<li>Centrifuga per 10 min a 16.100 x aspirare il surnatante g. senza pellet inquietante.</li>
		<li>Ri-sospendere ogni pallina con 500 µ l di acqua sterile. Centrifugare per 5 min 16.100 x g.</li>
		<li>Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Registrare il peso finale dei tubi del microfuge.</li>
		<li>Determinare il peso di ogni pallina sottraendo il peso iniziale dei tubi dal peso finale del microfuge.</li>
	</ol></li> <li>Con acqua sterile, risospendere il pellet di albicans del c. a 10 mg/mL e il pellet OP50 a 200 mg/mL. Rendere un'infezione master mix combinando 10 µ l di una soluzione di 50 mg/mL di streptomicina, 2,5 µ l di cultura OP50, 0,5 µ l di albicans del c. cultura e 7 µ l di acqua sterile.
	<ol><li>Per placche di comando, è necessario creare un mix master sostituendo il volume della cultura di albicans del c. con acqua sterile. Seme di 20 µ l di miscela di infezione o soluzione di controllo OP50 sulle piastre centro di NGM utilizzando una micropipetta. 
		Nota: Circa 100 vermi sono necessari per determinare la significatività statistica durante l'analisi. Questo test viene in genere eseguito in triplice copia. Così, un 3.2 x mix infezione nonché un 3.2 x soluzione di controllo è fatto. Queste miscele sono fatte per essere leggermente oltre 3 volte l'originale per garantire che un pieno 20 µ l è seminato in ogni piatto, lasciando spazio per l'errore. Questo mix master è creato perché la faringe del worm è troppo piccola durante le fasi iniziali di larvale (L1-L3) a consumare c. albicans. Per l'esposizione agli agenti farmacologici quali fluconazolo ( Figura 3B), l'agente è stato introdotto per la miscela di infezione. La concentrazione dell'agente è determinata empiricamente. Ad esempio, in Figura 3B, 50 µM Fluconazole è rappresentata, tuttavia 0, 12,5, 25, 50 e 100 µM Fluconazole erano anche testato usando lo stesso protocollo.</li>
	</ol></li></ol> 8. Analisi del fenotipo di regione anale deformato (Dar) e analisi di sopravvivenza <ol><li>Visualize il fenotipo di Dar Nota: Dar meglio viene visualizzato nella fase L3 e oltre. Dar si presenta come una piccola sporgenza della regione anale post del worm ( Figura 2A), che diventa più evidente nel corso del tempo.
	<ol><li>Conferma se un animale ha Dar rapidamente toccando la piastra sul palco del microscopio di dissezione; animali senza Dar volontà spostare all'indietro immediatamente, mentre gli animali con il Dar che verranno sia bisogno ripetuti giri di maschiatura per invertire la loro direzione, o non farlo affatto.</li>
	</ol></li> <li>Analisi di sopravvivenza <ol><li>preparazione completa uovo come precedentemente descritto nel protocollo passaggio 6, &#34; uovo preparazione &#34;. Contare le uova nell'ambito di dissezione e diluire la soluzione di uovo con M9 finché non si ottiene una concentrazione di circa 5-6 uova sane per µ l. Usando una pipetta, dispensare 20 µ l di campione contenente circa 30 uova sul piatto preparato di NGM, nella zona tra la coltura batterica e il lato della piastra (uova e vite senza fine alimentare, OP50, sono in due punti distinti).</li>
		<li>Piastre Incubate a 20 ° C per 48 h. Sotto un microscopio di dissezione, contare il numero di vermi vivi e morti adulti su ogni piatto, così come il numero di vermi con Dar. Registrare la percentuale con Dar.</li>
		<li>Considera un animale morto, se non risponde di essere sfruttato sulla testa di un filo di alluminio o toccando la piastra.</li>
		<li>Ogni altro giorno, trasferire i vermi adulti restanti scegliendo come descritto nel protocollo passaggio 5, &#34; Chunking e Picking worm, &#34; su un piatto di infezione o controllo di nuovo. A questo punto, se necessario, eseguire un'analisi di sopravvivenza di rilevamento del numero di vermi dal vivo, morti e mancante ogni giorno. 
		Nota: Questo test può eseguire per due settimane, cominciando con preparazione di uova. Inoltre, la soluzione di uovo non dovrebbe essere erogata sulla cultura batterica, come la soluzione può contenere tracce di candeggina che può uccidere il OP50. La soluzione dovrebbe essere erogato circa 0,5 cm dal bordo della piastra, come le uova possono restare bloccate tra i lati della piastra e l'agar. Inoltre, a causa della rapida proliferazione di vermi, trasferendo gli adulti sulle nuove piastre è fondamentale per separarli dalla loro progenie.</li>
	</ol></li> <li>Analizzare sopravvivenza <ol><li>analizzare risultati utilizzando software di analisi di sopravvivenza curva (vedere elenco dei materiali).</li>
		Curve di <li>Confronta sopravvivenza utilizzando il metodo Grehan-Breslow-Wilcoxon (supponendo che i dati dai primi tempi di sopravvivenza sono più accurati di epoche successive, peso di conseguenza i dati) così come di strumenti statistici di Logrank 45. 
		Nota: Ad esempio, in Figura 4B -C, la sopravvivenza di vermi trattati con mutante c. albicans è rispetto a quelli trattati con isogeni selvaggio-tipo controlli o complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I metodi per analizzante infezione di c. elegans e sopravvivenza sopra esposizione in vita a albicans del c. che abbiamo descritto possono essere modificati per testare un altro agente patogeno. Colture liquide di un altro batteri o funghi possono essere formate e alimentate al c. elegans in modo simile. Inoltre, possono essere dosate seriale infezioni prima esponendo la larva di un agente patogeno come descritto, e quindi trasferire gli animali su un nuovo piatto contenente un agente patogeno ...

C. elegans è stato utilizzato come organismo modello potente per più di 50 anni. Nel 1960, biologo sudafricano Sydney Brenner ha sperimentato l'uso di c. elegans per studiare lo sviluppo neuronale, aprendo la strada a una lunga stirpe di scienziati per studiare vari aspetti della biologia delle cellule e animali nei nematodi. Questo lignaggio include vincitori del premio Nobel Craig Mello e Andrew Fire per il loro lavoro di RNAi1, Robert Horvitz e John Sulston per il loro lavoro per lo sviluppo dell'organo e apoptosi2,3,4e Martin Chalfie per il suo lavoro sulla proteina fluorescente verde5. Anche se questo organismo di modello è stato tradizionalmente usato per studiare la biologia molecolare e dello sviluppo, negli ultimi 15 anni, i ricercatori hanno cominciato ad usare c. elegans per studiare la biologia di vari agenti patogeni umani, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericae Serratia marcescens6,7,8,9,10. Questi studi hanno rivelato che molti dei meccanismi coinvolti nell'interazione umano-patogeno sono conservati in nematodi, ma anche che ci sono alcuni meccanismi di immunità che sono unici per questo modello organismo11,12. In natura, c. elegans incontra una varietà di minacce da ingerito agenti patogeni presenti nel terreno e questo ha fornito una forte pressione selettiva per evolvere e mantenere un sofisticato sistema immunitario innato nel suo lume intestinale. Molti dei geni e meccanismi coinvolti nella protezione del lume intestinale sono orchestrati da elementi altamente conservata che esistono anche in più alti mammiferi11,13. C. elegans rappresenta quindi un ottimo modello per studiare gli agenti patogeni gastrointestinali come Salmonella enterica14, Shigella boydii15o vibrione del colera16.
Qui si evidenzia la notevole versatilità di c. elegans come un host di modello per lo studio di agenti infettivi quali c. albicans. C. elegans come un host di modello consente di screening su vasta scala per la virulenza che è meno costoso e che richiede tempo che un modello del topo, che è comunemente usato per studiare la candidosi42.
In questo studio, mostriamo che questo modello e l'analisi di sopravvivenza manuale può essere utilizzati in modo affidabile per lo studio di host innata gli effettori immunitari importanti per contrastare le infezioni, fattori determinanti di agente patogeno che guidano la virulenza, e composti farmacologici che possono intervenire nella patogenesi. Dissimile da saggi descritti in precedenza, questo metodo fornisce un mezzo per studiare l'esposizione ad un agente patogeno per tutta la durata dell'animale, dalla fase larvale di età adulta, piuttosto che solo nell'età adulta a morte43,44. In sintesi, il nostro c. elegans - modello c. albicans è uno strumento potente e versatile che può essere utilizzato non solo per studiare le basi genetiche che guidano l'infezione e l'immunità, ma anche di identificare nuovi composti per intervento terapeutico.

<table><tbody><tr><td>Agar (granulato, grado batteriologico)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Filo di alluminio (95% Pt, 32 calibro)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Microscopio invertito</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ceppo Bli-3</td><td>Caenorhabditis Centro di genetica</td><td>Bli-3 (e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo, grado Sigma, minimo 99%</td> <td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Provette di coltura monouso (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione (NI-150 Illuminatore ad alta intensità)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Software per l'analisi della curva di sopravvivenza)</td><td>Software GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller's)</td><td>Apex BioResearch Prodotti</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri medie (35 x 10 mm)</td><td>Falco</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

il nematode caenorhabditis elegans - un modello versatile in vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Dimostriamo un metodo utilizzando Caenorhabditis elegans come un host di modello per studiare l'interazione microbica. I microbi vengono introdotti attraverso la dieta rendendo l'intestino il luogo primario per la malattia. L'intestino del nematode strutturalmente e funzionalmente imita gli intestini dei mammiferi ed è trasparente che lo rende suscettibile di uno studio al microscopio della colonizzazione. Qui vi mostriamo che gli agenti patogeni possono causare la malattia e la morte. Siamo in grado di identificare microbiche mutanti che mostrano alterata virulenza. Sua risposta innata conservata a stress biotici rende c. elegans un eccellente sistema per sondare le sfaccettature delle interazioni immune innata ospite. Indichiamo che padroni di casa con le mutazioni nel gene raddoppiano ossidasi non può produrre le specie reattive dell'ossigeno e sono in grado di resistere insulto microbico. Noi dimostrare ulteriormente la versatilità del dosaggio sopravvivenza presentato mostrando che può essere utilizzato per studiare gli effetti degli inibitori della crescita microbica. Questo dosaggio può anche essere usato per scoprire i fattori di virulenza fungine come bersagli per lo sviluppo di nuovi agenti antifungini, nonché a fornire l'opportunità di scoprire ulteriori interazioni ospite-microbo. Il design di questo test si presta bene a throughput elevato schermi intero genoma, mentre la possibilità di crioconservare worm per un utilizzo futuro lo rende un modello animale intero conveniente e attraente per studiare.

Un'analisi di patogenesi (Figura 1) usando i albicans del c. e c. elegans precedentemente è stato descritto dal nostro laboratorio17,18 e altri laboratori19,20. Dimostriamo la disponibilità dell'utilizzo di c. elegans per studiare la virulenza di albicans del c. mostrando che le cellule di c. albicans</e...

Qui, presentiamo il nematode Caenorhabditis elegans come un modello versatile host per studiare l'interazione microbica.

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

L'obiettivo generale di questo test è osservare l'effetto dell'infezione fungina nell'organismo modello C.Elegans. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande meccanicistiche chiave nel campo delle malattie infettive, come i fattori di virulenza dei patogeni, gli effettori immunitari dell'ospite e la scoperta di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un sistema trattabile sperimentalmente per studiare le interazioni ospite-patogeno da entrambi i punti di vista.È un sistema veloce, facile ed economico. Sebbene questo particolare metodo possa fornire informazioni sui patogeni fungini, può essere applicato anche ad altri agenti infettivi, come batteri o persino più organismi, per studiare le interazioni microbiche in un ospite vivo. Per fare un plettro a vite senza fine, taglia un pezzo di filo di alluminio di 1,5 centimetri, quindi inserisci con cura circa 0,5 centimetri di filo nella punta di una pipetta pasteur.Utilizzando un bruciatore Bunsen o una lampada ad alcool, fondere il puntale della pipetta in vetro ruotandolo lentamente nella fiamma fino a quando il filo non aderisce saldamente alla pipetta senza compromettere la forma originale del puntale della pipetta. Infine, usando una pinza, piega con cura l'estremità del filo per creare un piccolo anello. Per trasferire rapidamente grandi quantità di vermi su nuove piastre, utilizzare una spatola per tagliare un pezzo di agar NGM contenente i vermi selezionati.Quindi rimuovere il pezzo tagliato e posizionarlo a faccia in giù sul bordo del cerotto di OP50 su una nuova piastra. Per trasferire i vermi singolarmente, fiammare il filo nel plettro fino a renderlo rosso, quindi rimuoverlo dalla fiamma e lasciarlo raffreddare per alcuni secondi. Usando il filo sul plettro, raschiare delicatamente il cerotto della coltura OP50 cresciuta sulla nuova piastra, coprendo il filo sul plettro.La coltura viscosa che copre la punta del filo fa sì che i vermi si attacchino alla punta del nocciolo. Quindi usa un movimento di scorrimento per raccogliere delicatamente i vermi selezionati. Una volta raccolti, i vermi selezionati li posiziona su un nuovo piatto facendo scorrere delicatamente la coltura sull'agar.Quindi posizionare il filo nella fiamma per rimuovere la coltura rimanente sul plettro. Posizionare circa 20 animali adulti raccogliendoli o tagliandoli a pezzi su un piatto con 50 microlitri di E.coli ceppo OP50. Per raccogliere le uova dopo uno o due giorni, inondare la piastra con 10 millilitri di tampone M9.Quindi, utilizzando una pipetta sierologica di vetro, agitare delicatamente il contenuto sulla piastra di agar per rilasciare gli animali adulti o le uova attaccate a OP50. Raccogli tutto il liquido contenente le uova e gli adulti. Trasferire la soluzione M9 e OP50 in una provetta conica da 15 millilitri.Centrifugare la provetta a 2,100 x g per due minuti. Quindi aspirare circa nove millilitri di surnatante senza disturbare il pellet. Quindi, utilizzare due millilitri di acqua sterile, un millilitro di candeggina e un millilitro di idrossido di sodio molare 0,25 per risospendere il pellet.Mescolare delicatamente per inversione fino a quando circa il 70% degli animali adulti appare lisato. In genere le uova rimangono intatte durante questo breve trattamento di candeggina a causa del loro guscio. È fondamentale che la quantità di esposizione alla candeggina sia limitata in questa fase.L'esposizione prolungata alla candeggina distruggerà le uova. Se la preparazione delle uova non riesce, limitare la durata dell'esposizione alla candeggina o diluire la soluzione. Centrifugare la provetta conica a 990 x g per due minuti.Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi risospendere il pellet in 10 millilitri di tampone M9. Dopo aver girato di nuovo e rimosso il surnatante senza disturbare il pellet, utilizzare 200 microlitri di tampone M9 per risospendere il pellet.Erogare da tre a cinque millilitri di YPD in una provetta sterile e utilizzare un ansa sterile per inocularla con una singola colonia di Candida albicans. Posizionare il tubo su un tamburo rotante a 30 gradi Celsius per circa 16-18 ore. Etichettare un tubo microfuge da 1,5 millilitri per contenere C.albicans e un altro per contenere OP50, quindi registrare il peso di ciascun tubo vuoto.Trasferire 500 microlitri di coltura notturna di C.albicans nella provetta etichettata con C.Albicans. E 1500 microlitri della coltura OP50 durante la notte nella provetta etichettata OP50. Centrifugare le provette per 10 minuti a 16, 100 x g, quindi aspirare il surnatante senza disturbare i pellet.Utilizzare 500 microlitri di acqua sterile per risospendere ogni pellet. Quindi centrifugare le provette a 16, 100 x g per cinque minuti. Aspirare il surnatante senza disturbare i pellet.Quindi registrare il peso finale dei tubi di microfuga. Determinare il peso di ogni pallino sottraendo il peso iniziale dei tubi di microfuga dal peso finale. Utilizzando acqua sterile, risospendere il pellet di C.albicans a 10 milligrammi per millilitro e il pellet OP50 a 20 milligrammi per millilitro.Quindi preparare una miscela di infezione principale combinando 10 microlitri di una soluzione da 50 milligrammi per millilitro di streptomicina, 2,5 microlitri di coltura OP50, 0,5 microlitri di coltura di C.Albicans e 7 microlitri di acqua sterile.Per le piastre di controllo, creare una miscela master sostituendo il volume della coltura di C.albicans con acqua sterile. Quindi utilizzare una micropipetta per seminare 20 microlitri di miscela per l'infezione o soluzione di controllo OP50 al centro delle piastre NGM. Dopo aver preparato le uova come mostrato in precedenza in questo video, contare le uova sotto l'oscilloscopio di dissezione.E usa M9 per diluire la soluzione di uova fino a raggiungere una concentrazione di circa cinque o sei uova sane per microlitro. Utilizzando una pipetta, erogare un campione da 20 microlitri contenente circa 30 uova su una piastra NGM preparata nell'area tra la coltura batterica e il lato della piastra. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per 48 ore.Quindi, al microscopio da dissezione, contare il numero di vermi adulti vivi e morti su ciascuna piastra, considerando l'animale morto se non risponde all'essere picchiettato sulla testa da un filo di alluminio o picchiettando la piastra. Conta anche il numero di vermi con Dar e conferma se un animale ha Dar picchiettando rapidamente la piastra sul tavolino del microscopio di dissezione.Gli animali senza Dar si sposteranno immediatamente all'indietro, mentre gli animali con Dar avranno bisogno di ripetuti giri di tocchi per invertire la loro direzione o non lo faranno affatto. A giorni alterni, trasferisci i vermi adulti rimanenti raccogliendo i vermi su una nuova piastra di infezione o di controllo. A questo punto, se necessario, eseguire un test di sopravvivenza monitorando il numero di vermi vivi, morti e mancanti ogni giorno.È importante trasferire i vermi almeno a giorni alterni. Ciò garantisce che i vermi adulti che vengono valutati in questo test non vengano confusi nella loro progenie. C.elegans è stato esposto a C.albicans per un periodo di sei giorni e osservato per segni di infezione, progressione della malattia e morte.Il fenotipo Dar è più visibile entro il quarto giorno del test di sopravvivenza, come notato da una regione anale sporgente che non è visibile nell'animale non infetto. I vermi infettati da C.albicans sono anche noti per mostrare gonfiore nella regione della vulva. In entrambi i casi, il verme non è in grado di eliminare l'infezione dopo aver raggiunto questo stadio.Al fine di visualizzare la colonizzazione di C. albicans nel lume intestinale, i vermi sono stati alimentati con C. albicans selvatico marcato con RFP che causa la fluorescenza delle aree di colonizzazione. C.albicans colonizza il lume intestinale entro il terzo giorno del test. Come mostrato qui, i vermi infetti hanno mostrato una distensione intestinale più grave di quella osservata nel controllo non infetto.In questo esperimento, è stata testata la capacità dei vermi di sopravvivere all'infezione causata dal doppio mutante virulento C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. I vermi infettati dal doppio mutante vivono statisticamente significativamente più a lungo dei controlli. Suggerendo che questi due geni sono necessari per la virulenza di C.albicans contro C.Elegans.Una volta padroneggiata, ogni parte di questa tecnica può essere eseguita in una o due ore al giorno della durata della vita del verme. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che si potrebbe usare agenti infettivi. Pertanto, dovrebbero essere praticate adeguate precauzioni di biosicurezza.È possibile apportare piccole modifiche a questa procedura di base, come l'introduzione di agenti microbici aggiuntivi per studiare le interazioni microbiche nel contesto di un ospite vivo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie infettive per esplorare la virulenza microbica, i meccanismi delle risposte immunitarie innate dell'ospite e la scoperta di nuovi agenti antimicrobici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come mantenere e manipolare C.Elegans e utilizzare l'organismo per studiare le interazioni dei microbi ospiti a livello molecolare.Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni microbici e reagenti chimici, come l'azide di sodio, può essere pericoloso e dovrebbero essere impiegate precauzioni di sicurezza appropriate come DPI e metodi di smaltimento dei rifiuti.

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La facilità di mantenere e diffondere il...

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

I nematodi caenorhabditis selvatici sono associati a molti microbi, spesso nel lume intestinale o infettando l'intestino. Questo protocollo descrive un metodo per arricchire i microbi incolturabili che colonizzano l'intestino, sfruttando la resistenza della cuticola dauer.

Pulizia selettiva dei nematodi caenorhabiditi selvatici per arricchire i batteri del microbioma intestinale

L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del parassita microsporidiano Nematocida parisii consente ai vermi di produrre prole altamente resistente allo stesso agente patogeno. Questo è un esempio di immunità ereditaria, un fenomeno epigenetico poco compreso. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità ereditaria in un modello di verme geneticamente trattabile.

Studio dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da microsporidi di Caenorhabditis elegans

I microbi intestinali, compresi i batteri extracellulari e gli agenti patogeni intracellulari come il virus Orsay e i microsporidi (funghi), sono spesso associati ai nematodi selvatici di Caenorhabditis . Questo articolo presenta un protocollo per rilevare e quantificare i microbi che colonizzano e / o infettano i nematodi C. elegans e per misurare il carico patogeno dopo infezioni controllate in laboratorio.

Ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino di Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive un'interruzione di 96 pozzi di singole Caenorhabditis elegans colonizzate battericamente a seguito di paralisi fredda e sbiancamento superficiale per rimuovere i batteri esterni. La sospensione risultante è placcata su piastre di agar per consentire una quantificazione accurata e di media produttività della carica batterica in un gran numero di singoli vermi.

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

Caenorhabditis elegans è una delle principali specie modello in biologia, ma quasi tutte le ricerche vengono eseguite in assenza dei suoi microbi naturalmente associati. I metodi qui descritti aiuteranno a migliorare la nostra comprensione della diversità dei microbi associati come base per la futura ricerca funzionale di C. elegans.

Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans

I microcosmi di compost portano la diversità microbica presente in natura in laboratorio per facilitare la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans. Qui sono forniti protocolli per la creazione di esperimenti di microcosmo, con gli esperimenti che dimostrano la capacità di modulare la diversità microbica ambientale per esplorare le relazioni tra diversità microbica ambientale e composizione del microbioma intestinale del verme.

Microcosmi di compost come ambienti microbicamente diversi e simili a quelli naturali per la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans è un potente modello per esaminare i determinanti molecolari che guidano le interazioni ospite-microbioma. Presentiamo una pipeline ad alto rendimento che profila i livelli di colonizzazione del microbioma intestinale dei singoli animali insieme ad aspetti chiave della fisiologia di C. elegans.

Applicazione della vermimetria a flusso per la quantificazione e l'analisi del microbioma intestinale di Caenorhabditis elegans

Qui forniamo istruzioni su come utilizzare efficacemente SegElegans, un sistema di deep learning che abbiamo sviluppato per la segmentazione automatizzata di singoli vermi in immagini di microscopia a campo largo, per il successivo utilizzo in software di analisi delle immagini come ImageJ. Forniamo modi per utilizzare il sistema sia online che offline.

Analisi automatizzata delle immagini a fluorescenza di C. elegans utilizzando SegElegans

Descriviamo una strategia di sostituzione genica robusta per manipolare geneticamente il fungo fuliggine Ustilago maydis. Questo protocollo spiega come generare mutanti di delezione di indagare fenotipi infezione. Può essere esteso per modificare geni in qualsiasi modo desiderato, per esempio, aggiungendo una sequenza codificante un tag proteina fluorescente.

La manipolazione genetica del patogeno per le piante<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Per studiare Fungal Biology and Plant Microbo Interazioni

Scopri come utilizzare Caenorhabditis elegans come modello versatile per studiare interazioni ospite-microbo, in particolare infezioni fungine. Questo metodo permette di analizzare virulenza patogena e risposte immunitarie in vivo.

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

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