Valutazione di fragilità dell'osso corticale bovino utilizzando Scratch test
30 novembre 2017
Questo studio valuta la tenacità alla frattura dell'osso corticale bovino a livello sub-meso utilizzando test graffi microscopici. Si tratta di un obiettivo originale, rigoroso, e riproducibile metodo proposto sondare la tenacità a frattura sotto la scala macroscopica. Potenziali applicazioni stanno studiando modifiche nella fragilità ossea a causa di malattie come l'osteoporosi.
L'obiettivo generale di questo studio è caratterizzare il comportamento fratturato dell'osso corticale alla mesoscala utilizzando il test di graffio microscopico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biomeccanica e della meccanica delle fratture, come la fragilità dei tessuti biologici o il rimodellamento dell'osso compatto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è adeguata per piccoli esemplari.
È rigoroso, riproducibile ed è semi-distruttivo. Inoltre, il metodo è oggettivo perché ci basiamo esclusivamente su misurazioni di forza e profondità. A dimostrare la procedura sarà Kavya Mendu, uno studente laureato nel mio laboratorio.
Per iniziare questa procedura, scongelare i femori congelati in un contenitore con acqua per circa due ore a temperatura ambiente. Quindi, tagliare più dischi di circa 10-15 millimetri di spessore dalla regione della diafisi media utilizzando una sega a nastro diamantata da tavolo per produrre campioni con un'area della sezione trasversale uniforme dell'osso corticale. Successivamente, utilizzare un kit di dissezione per rimuovere i tessuti molli o la carne attaccati all'osso corticale.
Tagliare le sezioni trasversali dei femori utilizzando una lama di wafering diamantata a bassa velocità lungo l'asse longitudinale dell'osso in condizioni di umidità per ottenere sezioni cuboidali multiple e arruffate. Successivamente, pulire i campioni nella soluzione di detergente anionico all'1,5% e candeggina al 5% per 20 minuti in un pulitore a ultrasuoni. Successivamente, incorporare i campioni di osso corticale in resina acrilica per facilitarne la manipolazione e la stabilità, rivestendo prima le pareti dello stampo con un agente distaccante.
Quindi, mescolare la resina acrilica e l'indurente in un becher. Posizionare uno dei campioni di osso corticale tagliati in ogni stampo con la superficie da graffiare rivolta verso il basso. Versare la miscela di resina acrilica in questi portacampioni preparati.
Rimuovere le bolle d'aria intrappolate durante il processo di miscelazione. Lasciamo che gli esemplari si curino per noi per quattro o cinque ore. Successivamente, tagliare i campioni incorporati in dischi di cinque millimetri di spessore a bassa velocità esponendo la superficie da graffiare.
Quindi, montare i campioni sui dischi di alluminio di diametro 34 millimetri e altezza cinque millimetri utilizzando adesivo cianoacrilato. Quindi, avvolgere i campioni in un calibro ammortizzato in HBSS. E conservare in frigorifero a quattro gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.
In questa procedura, macinare i campioni di osso corticale bovino a temperatura ambiente utilizzando carte in carburo di silicio a grana 400 e 600 per un minuto e cinque minuti rispettivamente. Mantenere la levigatrice lucidatrice alla velocità di base rispettivamente di 100 giri/min e 150 giri/min. Successivamente, la macchina macina i campioni di osso corticale bovino a temperatura ambiente sulle carte a grana 800 e 1200 per una durata di 15 minuti ad ogni passaggio.
Mantenere la levigatrice lucidatrice alla velocità base di 150 giri/min, alla velocità della testa di 60 giri/min e al carico operativo di una libbra. Lucidare i campioni utilizzando soluzioni di sospensione di diamante da tre micrometri, un micrometro e 0,25 micrometri nello stesso ordine su un panno duro, perforato e non tessuto per una durata di 90 ciascuno a temperatura ambiente. Mantenere il carico operativo per ogni passaggio a una libbra, con le velocità della base e della testa della lucidatrice rispettivamente a 300 giri/min e 60 giri/min.
Successivamente, lucidare il campione utilizzando una soluzione di sospensione di allumina da 0,05 micrometri su un morbido panno sintetico di rayon per una durata di 90 minuti a una libbra, con una velocità di base e testa rispettivamente di 100 giri/min e 60 giri/min anche a temperatura ambiente. La levigatura e la lucidatura dei campioni sono fondamentali per ottenere la struttura piana senza alterare in modo significativo la microstruttura. Tra una fase e l'altra della levigatura e della lucidatura, posizionare i campioni in un becher con acqua diionizzata e tenere il becher in un bagno a ultrasuoni per due minuti per pulire il residuo ed evitare la contaminazione incrociata.
Quindi, visualizza le caratteristiche della superficie utilizzando un microscopio ottico o l'imaging SEM. Prima di eseguire l'analisi dei campioni di osso corticale, calibrare la punta del penetratore Rockwell utilizzando il policarbonato. Successivamente, posizionare il campione di osso corticale sul tavolino e scegliere la vista del test di graffio utilizzando il microscopio ottico integrato nel modulo micro scratch test.
Quindi, applicare un carico progressivo lineare con un carico iniziale di 30 millinewton e un carico finale di 30 newton. La velocità di caricamento deve essere impostata su 60 newton al minuto e la lunghezza del graffio su tre millimetri. È imperativo selezionare una regione ad alta densità per l'osso compatto.
Le zone vicine all'osso spongoso, allargano i micropori, devono essere evitate, in quanto determinano bassi valori di resistenza alla frattura. Successivamente, eseguire una serie di test di graffio sui campioni corticali corticali cortici corticani. Bagnare la superficie del campione con HBSS dopo ogni serie di tre o quattro test di graffio per mantenerli idratati.
Successivamente, analizza i dati del test di graffio basati su modelli meccanici di frattura non lineari. Qui è mostrata un'immagine al microscopio ottico del panorama del boschetto di graffi. Ecco il grafico corrispondente della forza rispetto alla profondità lungo la lunghezza del boschetto di graffio.
La forza orizzontale corrisponde alla forza resistiva rilevata dai sensori collegati allo stadio del micro scratch test. E la forza verticale corrisponde alla forza lineare progressiva applicata sul campione osseo corticale. Le immagini SEM del boschetto di graffio mostrano i micromeccanismi come la deflessione della cricca, il ponte della cricca, il ponte della fibra e la scheggiatura a 40X, 10.000X, 2, 400X e 5.000X.
Durante il tentativo di preparazione del campione, è importante monitorare l'umidità relativa e mantenere i campioni sempre bagnati per prevenire la disidratazione locale. Seguendo questa procedura, altri metodi come gli esperimenti di tomografia computerizzata a raggi X possono essere preformati per rispondere a domande aggiuntive come i micromeccanismi di frattura su scala meso e microscopica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire test microscopici di frattura da graffio su tessuti biologici duri.
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Panoramica
Questo studio caratterizza il comportamento fratturato dell'osso corticale a scala mesoscopica mediante test di graffio al microscopio. Questo metodo fornisce informazioni sulla fragilità dei tessuti biologici e sul rimodellamento dell'osso compatto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biomeccanica
- Meccanica della frattura
- Biologia ossea
Sfondo
- La tenacità alla frattura è fondamentale per comprendere la fragilità ossea.
- I metodi attuali spesso si concentrano su scale macroscopiche.
- Il test di micrograffio offre un approccio innovativo.
- L'adeguatezza di campioni di piccole dimensioni rappresenta un vantaggio significativo.
Scopo dello studio
- Valutare la tenacità alla frattura dell'osso corticale bovino.
- Analizzare i cambiamenti nella fragilità ossea dovuti a malattie come l'osteoporosi.
- Fornire un metodo rigoroso e riproducibile per la ricerca futura.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di prova di graffio al microscopio.
- Misurazione della forza e della profondità per garantire oggettività.
- Approccio di prova semi-distruttivo.
- Applicazione su piccoli campioni ossei.
Risultati principali
- Caratterizzazione del comportamento fratturativo a livello sub-mesoscopico.
- Approfondimenti sulla fragilità dei tessuti biologici.
- Dimostrazione della riproducibilità e rigorosità del metodo.
- Potenziali applicazioni nello studio dell'osteoporosi.
Conclusioni
- Il metodo è efficace per lo studio della tenacità alla frattura.
- Può portare a una migliore comprensione della fragilità ossea.
- La ricerca futura potrà basarsi su questo approccio rigoroso.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
La valutazione della fragilità ossea a scale microscopiche e mesoscopiche affronta un'importante lacuna nella ricerca preclinica sull'osteoporosi, in cui i test macroscopici attuali limitano la comprensione meccanicistica dell'inizio della frattura. Questo metodo consente la validazione degli obiettivi quantificando la resistenza alla frattura in microstrutture ossee rilevanti per la malattia, supportando la riduzione del rischio meccanicistico di candidati anti-riassorbenti e anabolici. La natura riproducibile e semi-distruttiva del test di graffio facilita studi longitudinali in modelli preclinici, migliorando la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti promettenti per terapie mirate all'osso.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando la tenacità alla frattura a livelli gerarchici dell'osso coinvolti nell'osteoporosi.
- Valore operativo: Fornisce letture oggettive basate su forza e profondità, riducendo la variabilità negli studi sull'interazione con il bersaglio.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico collegando meccanismi microscopici (deviazione della frattura, ponteggiamento) alla qualità funzionale dell'osso.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera metriche quantitative di resistenza alla frattura a partire dall'analisi delle striature per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Utilizza campioni di piccole dimensioni (dischi con spessore inferiore a 5 mm), consentendo lo screening ad alto rendimento degli effetti dei composti sulle proprietà materiali dell'osso.
- Valore operativo: Il mantenimento dei campioni in condizioni umide con HBSS garantisce rilevanza fisiologica e riproducibilità tra le ripetizioni del test.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega il comportamento microscopico della frattura al cedimento mesoscopico, migliorando la fedeltà del sistema nei modelli di osteoporosi rilevanti per la malattia.
- Valore operativo: Il test semi-distruttivo consente acquisizioni sequenziali di immagini (SEM, ottiche) e potenziali analisi micro-TC successive per una validazione multilivello.
- Valore scientifico: Cattura l'eterogeneità dell'osso corticale, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento personalizzate in base alla coerenza del materiale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'efficacia preclinica, in cui le proprietà del materiale osseo fungono da biomarcatore meccanicistico per i cambiamenti indotti dal composto nella qualità dell'osso.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su come gli agenti farmacologici alterino la resistenza alla frattura attraverso percorsi micro-meccanicistici.
- Screening: Permette la prontezza del saggio mediante preparazione standardizzata dei campioni e parametri di graffiatura controllati (carico da 30 mN a 30 N, lunghezza di 3 mm).
- Analisi: Fornisce misurazioni della forza in funzione della profondità e modelli di frattura non lineari per il confronto quantitativo tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i test su scala microscopica al comportamento di frattura mesoscopico, favorendo la continuità preclinica nella ricerca sull'osteoporosi.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione di composti mirati all'osso in numerosi studi preclinici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso la misurazione diretta dei meccanismi di fragilità ossea.
- Valore operativo: Standardizzazione mediante un rigoroso protocollo di levigatura/lucidatura dei campioni e controlli ambientali (idratazione, umidità).
- Valore strategico: Riduzione del rischio biologico in fase avanzata identificando precocemente i composti che non migliorano la qualità del materiale osseo.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei candidati in base al miglioramento della tenacità alla frattura in sistemi rilevanti per la malattia, adeguata al rischio.
Considerazioni relative all'implementazione
- Competenze in biomeccanica, meccanica della frattura e preparazione di campioni per tessuti biologici duri.
- Strumentazione: tester microscopico per prova di graffio con controllo del carico (velocità di 60 N/min), imaging ottico/stereo microscopico (SM) e camera ambientale per idratazione con HBSS.
- Standardizzazione intersettoriale: protocolli condivisi per l'inclusione dei campioni, la sequenza di lucidatura (grana da 400 a 1200, sospensioni al diamante/ossido di alluminio) e l'orientamento del test (longitudinale corto).
- Considerazioni sull'adattamento: evitare aree prossime al tessuto osseo cancellare e regioni ricche di micropori per garantire la validità delle misurazioni.
- Limitazione pratica: la natura semi-distruttiva del test impedisce prove longitudinali sullo stesso campione, richiedendo una dimensione campionaria adeguata (n=102 nello studio) per garantire potenza statistica.
