Name: Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Impara a registrare correnti sinaptiche focali dalla giunzione neuromuscolare di larve di Drosophila. Questa tecnica elettrofisiologica permette di monitorare l'attività di singoli bouton sinaptici con cinetica rapida.

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1. fabbricazione di elettrodi di registrazione <ol><li>tirando gli elettrodi di vetro <ol><li>uso il seguente protocollo per l'estrattore di microelettrodi (Vedi Tabella materiali): <ol><li>linea 1: calore 510 tirare - velocità 30 tempo 250; Linea 2: Calore 490 Pull - velocità 30 tempo 250. 
			Nota: Unità di tempo corrisponde a 0,5 ms per unità; le altre unità sono relative. Il valore del calore deve essere regolato per ogni filamento dopo viene eseguito il test rampa.</li>
		</ol></li> <li>Utilizzare un microscopio (ingrandimento x 35) per garantire che il diametro interno dell'elettrodo tirato è nella gamma di 7-10 µm ( Figura 1A). Conservare i capillari in contenitori ben chiusi per prevenire l'accumulo di polvere.</li>
	</ol></li> <li>Fuoco lucidatura <ol><li>capillari di fuoco polacco (80-90% del valore massimo del calore per 1-2 s) utilizzando una micro-forgia (Vedi Tabella materiali). Garantire il diametro interno finale dell'elettrodo lucido è 5 µm ( Figura 1A) 27.</li>
	</ol></li> <li>Piegatura Nota: due curve sono realizzate al fine di posizionare l'elettrodo sulla parte superiore del muscolo sotto un obiettivo ad alto ingrandimento.
	<ol><li>Uso l'apparecchio mostrato in Figura 1B. Difficoltà l'elettrodo nel manipolatore e posizionare la punta sul filamento, non toccando it.</li>
		<li>Set valore al 60-70% del massimo calore e premere il pedale della micro-forgia per 1-2 s (Vedi Tabella materiali) per riscaldare il filamento. Utilizzare un ago a forma di L per tirare delicatamente verso il basso la punta dell'elettrodo ( Figura 1B allargata). Fai la curva a circa 90 o ( Figura 1).</li>
		<li>Tenere l'elettrodo sopra la fiamma della torcia a mano usando il forcipe e fare alla seconda curva ad una distanza di 7-10 mm dal primo tornante e ad un angolo di circa 120 o ( Figura 1).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg"> Figura 1. Fasi finali di fabbricazione micropipetta. (A) elettrodo suggerimenti dopo tirando e lucidatura di fuoco. (B. 1) l'installazione per la piegatura di punta. (B. 2), l'area circoscritta è mostrato allargata a destra. L'elettrodo e il filamento sono fissati in modo che la punta dell'elettrodo è posizionato leggermente di sopra del filo e non toccare. (C. 1) l'elettrodo di registrazione. (C. 2), l'area circoscritta è mostrato allargata a destra. La prima curva ha un angolo di circa 90°, e la distanza tra la prima curva e la punta dell'elettrodo è di circa 1 mm. scala bar = 3 mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
 2. ulteriori passaggi preparatori <ol><li>preparare heamolymph-come (HL3) soluzione (in mM): 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trealosio, saccarosio 115, 5 HEPES e 1 mM CaCl 2; regolare il pH a 7,3 - 7.4. conservare la soluzione in frigorifero e fanno fresco ogni settimana.</li>
	<li>Rendere pipette di stimolazione lo stesso modo come registrazione vetro pipette, salvo non vi è alcuna necessità di piegarle. 
	Nota: La preparazione di elettrodi di stimolazione è descritto in dettaglio in 28 e 27. Il diametro finale dopo lucidatura a fuoco dovrebbe essere nella gamma di 5-7 µm.</li>
	<li>Inserto una pipetta di stimolazione in un supporto di microelettrodo collegata ad una siringa.</li>
	<li>Piastre di dissezione di fabbricazione da piccole capsule di Petri (35 x 10 mm) rivestiti con resina epossidica di gomma del silicone (Vedi Tabella materiali), come descritto in 28. 
	Nota: Gomma di Silicone dovrebbe essere completamente indurita prima dell'uso.</li>
	<li>Scegli un errante larve di terza-instar e sezionarla come descritto in 27 , 28 , 29 , 30. 
	Nota: Per visualizzare boutons, utilizzare il ceppo volo CD8-GFP (Vedi Tabella materiali) <ol><li>forcipe di utilizzo (Vedi Tabella materiali), pick 3 rd instar larve da un flaconcino.</li>
		<li>Pin le larve, ponendo il primo perno posteriore e un altro pin anteriore (vicino a bocca ganci).</li>
		<li>Soluzione aggiungere HL3.</li>
		<li>Fare un taglio con forbici di primavera (Vedi Tabella materiali) fin dal perno superiore a quella inferiore sul lato dorsale delle larve.</li>
		<li>Pin il filetto di larve, immissione 2 pin aggiuntivi a sinistra e a destra delle larve.</li>
		<li>Rimuovere le budella e trachee utilizzando forcipe.</li>
		<li>Tagliare i nervi appena fuori il cavo ventrale del nervo usando forbici di primavera.</li>
	</ol></li></ol> 3. Le registrazioni elettriche della EJC <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg"> Figura 2. La configurazione di registrazione. Il campione NMJ appuntato al silicio rivestito di Petri (freccia) è posizionato sopra la fase mobile del microscopio composto verticale dotato di funzionalità di epifluorescenza, un obiettivo di alto ingrandimento e due micromanipolatori. Il microscopio è disposto su un tavolo antivibrazione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>Registrazione <ol><li>posto di Petri con la preparazione sul tavolino del microscopio ( Figura 2). Inserire l'elettrodo di riferimento nel bagno.</li>
		<li>Riempire l'elettrodo di registrazione con HL3 soluzione. Nell'ambito dell'obiettivo 10x (Vedi Tabella materiali), immergere l'elettrodo nel bagno e posto sopra i muscoli 6 e 7 dei segmenti addominali 2, 3 o 4 utilizzando il micromanipolatore (Vedi Tabella materiali) ( Figura 3 A. 1 e a. 2).</li>
		<li>Passare l'obiettivo a 60 x (Vedi Tabella materiali). Concentrarsi sulla zona di interesse utilizzando epi-fluorescenza o ottica DIC. Posizionare la punta dell'elettrodo in cima bouton sinaptico ( Figura 3 b. 1-3).</li>
		<li>Premere l'elettrodo molto delicatamente sul muscolo. Una pressione eccessiva può danneggiare la giunzione neuromuscolare o indurre un aumento nell'attività sinaptica spontanea. Assicurarsi che la punta dell'elettrodo non sia intasato - in questo caso, sostituire it.</li>
		<li>Accendere l'amplificatore, scheda A/D e il computer.</li>
		<li>Scegliere la modalità di morsetto di tensione dell'amplificatore.</li>
		<li>Avviare il software di acquisizione e scegliere il ' privo di gap ' modalità.</li>
		<li>Osservare la comparsa di mEJCs sullo schermo del computer.</li>
		<li>Assicurarsi che l'ampiezza del mEJCs è nella gamma di 0,2 - 0,7 na. 
		Nota: EJC più piccoli indicano che l'elettrodo di registrazione ha difetti o che non è posizionato correttamente.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg"> Figura 3. Visualizzazione dei boutons sinaptici. (A), A immagine di campo chiaro di un hemi-segmento sotto i 10 x ingrandimento (a. 1) e l'area circoscritta allargata che mostra i muscoli 6 e 7 (a. 2, la freccia contrassegna l'elettrodo di registrazione). Barra della scala = 50 µm. (B) boutons sinaptici sono visualizzati in una riga di Drosophila con un marcatore neuronale geneticamente codificato (CD8-GFP) utilizzando l'imaging epi-fluorescenza (b. 1) o DIC ottica (b. 2). Immagini sono prese con il 60 x obiettivo e il cubo di filtro per l'imaging di GFP (Vedi Tabella materiali). Synaptiboutons c sono contrassegnati con le frecce, e una sovrapposizione di fluorescente e DIC immagini è mostrata in b. 3. Barra della scala = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"> <li>stimolazione <ol><li>utilizzando un micromanipolatore, sotto un controllo visivo, posizionare l'elettrodo di stimolazione vicino l'assone che innervano segmenti addominali 2-4.</li>
		<li>Applica pressione negativa tirando il pistone della siringa collegato alla pinza porta elettrodo, in modo che l'axon è tirato dentro l'elettrodo ( Figura 2).</li>
		<li>Accendere lo stimolatore. Ruotare la manopola sull'unità di isolamento (Vedi Tabella materiali) impostare una corrente pari a zero, e poi delicatamente aumentare, fino a quando appaiono EJC (o fino a quando non viene raggiunta la soglia).</li>
		<li>Eseguire la stimolazione in un regime di suprathreshold, con la corrente di stimolazione aumentata circa due volte, rispetto alla soglia per l'osservazione della EJC. 
		Nota: Nella nostra esperienza, tale intensità di stimolazione è ottimale per evitare errori di potenziale di azione e di infornamento del potenziale di azione. Ad esempio, se EJC comparire la corrente di stimolazione di 0.2 mA, utilizzare una corrente di 0,4 mA in tutto l'esperimento.</li>
	</ol></li> <li>Guarnizione di <ol><li>misurare la resistenza di tenuta dell'elettrodo macropatch registrazione girando l'interruttore di resistenza dell'elettrodo dell'amplificatore a " prova di tenuta " posizione. Osservare che il valore della resistenza di guarnizione in GΩ verrà visualizzato nel " attuale " finestra.</li>
		<li>Assicurarsi che la resistenza di tenuta è nella gamma di 0.5 - 2 M Ω. I valori fuori di questo intervallo indicano che l'elettrodo è lucidato non correttamente o non correttamente posizionato.</li>
		<li>Monitorare la resistenza di tenuta durante la registrazione, facendo attenzione che rimanga costante in tutto l'esperimento.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analisi <ol><li>analizza le registrazioni che impiegano software per analisi personalizzato (Vedi Tabella materiali). 
	Nota: Il nostro laboratorio utilizza software in-House Quantan 31, che è personalizzato per il rilevamento della EJC e mEJCs registrato focale ( Figura 4). Questo software include un filtro gaussiano digitale e permette la rilevazione dei picchi quantal sovrapposte eventi multi-quantali ( Figura 4A). Altri approcci sono descritti in 17.</li>
</ol> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg"> Figura 4. Analisi quantale. Rilevamento di mEJCs (A) ed EJC (B) da Quantan software. L'area eventi è contrassegnato in verde, e picchi sono contrassegnati da frecce rosse. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).</li>
<li>Katz, B., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+on+the+synaptic+delay+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction.</a> J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).</li>
<li>Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+proteins+and+quantal+release+at+single+active+zones+of+amphibian+%28Bufo+marinus%29+motor-nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).</li>
<li>Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+secretion+and+nerve-terminal+cable+properties+at+neuromuscular+junctions+in+an+amphibian+%28Bufo+marinus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus).</a> J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).</li>
<li>Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of active zones.</a> Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).</li>
<li>Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+quantal+secretion+from+visualized+sympathetic+nerve+varicosities+on+the+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens.</a> J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).</li>
<li>Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transmitter+release+by+synapsin+II+in+mouse+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals.</a> J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).</li>
<li>Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab3a-mediated+vesicle+recruitment+regulates+short-term+plasticity+at+the+mouse+diaphragm+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse.</a> Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).</li>
<li>Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+currents+evoked+by+graded+intracellular+depolarization+of+crayfish+motor+axon+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals.</a> J Physiol. 383, 587-599 (1987).</li>
<li>Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+and+its+facilitation+in+crayfish.+I.+Saturation+kinetics+of+release%2C+and+of+entry+and+removal+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium.</a> Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).</li>
<li>Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+changes+in+synaptic+release+sites+at+the+crayfish+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crayfish+neuromuscular+facilitation+activated+by+constant+presynaptic+action+potentials+and+depolarizing+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses.</a> J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+statistics+of+transmitter+release+during+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in the statistics of transmitter release during facilitation.</a> J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).</li>
<li>Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+at+the+lobster+neuromuscular+junction%3A+a+stimulus-dependent+mobilization+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model.</a> J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).</li>
<li>Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchrony+of+quantal+events+in+evoked+multiquantal+responses+indicates+presynaptic+quantal+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction.</a> J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).</li>
<li>Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechnisms+underlying+different+facilitation+forms+at+the+lobster+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).</li>
<li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions%2C+and+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).</li>
<li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfusional+control+of+quantal+current+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Postfusional control of quantal current shape.</a> Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).</li>
<li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+maintains+the+reserve+vesicle+pool+and+spatial+segregation+of+the+recycling+pool+in+Drosophila+presynaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons.</a> Brain Res. 1178, 52-64 (2007).</li>
<li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+endosomal+endocytic+pathway+increases+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size.</a> Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).</li>
<li>Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+Complexin+Accessory+Helix+with+Synaptobrevin+Regulates+Spontaneous+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion.</a> Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).</li>
<li>Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+unit+populations+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).</li>
<li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+current+and+release+at+the+crayfish+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).</li>
<li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Ca2%2B+inflow+to+quantal%2C+phasic+transmitter+release+from+nerve+terminals+of+frog+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle.</a> Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).</li>
<li>Marrero, H. G., Lemos, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarrero%2C+HG+%22Loose-Patch-Clamp+method%22">Loose-Patch-Clamp method</a>. , 2 ed, Humana Press. (2007).</li>
<li>Wu, W. H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+recordings+of+high+and+low+output+NMJs+on+the+crayfish+leg+extensor+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+1-43+labeling+of+synaptic+vesicle+pools+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19229190">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Imlach, W., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+methods+for+recording+synaptic+potentials+from+the+NMJ+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+quantal+analysis+more+convenient%2C+fast%2C+and+accurate%3A+user-friendly+software+QUANTAN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN.</a> J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).</li>
<li>Huntwork, S., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complexin+fusion+clamp+regulates+spontaneous+neurotransmitter+release+and+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth.</a> Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).</li>
<li>Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+plasticity+in+Drosophila+memory+mutants+with+a+defective+cyclic+AMP+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade.</a> Science. 251 (4990), 198-201 (1991).</li>
<li>Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+of+vesicle+pools%2C+rates+of+mobilization%2C+and+recycling+at+neuromuscular+synapses+of+a+Drosophila+mutant%2C+shibire%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire.</a> Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).</li>
<li>Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+evoked+release+are+independently+regulated+at+individual+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones.</a> J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Drosophila rappresenta un organismo modello vantaggioso per studiare la trasmissione sinaptica. Sono state utilizzate diverse configurazioni di registrazione alle NMJ larvale, tra cui registrazioni intracellulari di potenziali sinaptici, registrazioni di correnti sinaptiche con due elettrodi tensione morsetto33,34e focale macropatch registrazioni di correnti sinaptiche descritte qui. La seconda tecnica permette la quantificazione precisa della trasmissio...

Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare i meccanismi molecolari che controllano trasmissione sinaptica. Il sistema neuromuscolare in Drosophila è glutamatergici, e pertanto la drosofila giunzione neuromuscolare (NMJ) può essere utilizzata per studiare le caratteristiche conservate di glutamatergic rilascio. Da Jan e Jan Studio1, le larve instar terza è stato largamente utilizzato per studiare la trasmissione sinaptica spontanea ed evocata da monitoraggio potenziali eccitatori giunzione (giuridiche) o correnti (EJC). Giuridiche sono comunemente registrate intracellulare con un micro-elettrodo di vetro taglienti, e riflettono l'attività di NMJ intera, compresi tutti i boutons fare sinapsi al data fibra muscolare.
Al contrario, l'attività di un numero limitato di siti di rilascio possa essere registrata focale posizionando un suggerimento micropipetta vicino terminali neuronali o varicosità sinaptica. Questa tecnica è stata impiegata originariamente da Katz e Miledi2e focale registrazioni extracellulari sono state impiegate con successo in diverse preparazioni di NMJ, tra cui rana3,4,5, mouse6 , 7 , 8, crostaceo9,10,11,12,13,14,15,16e Drosofila17,18,19,20,21,22,23. Questo approccio è stato ulteriormente sviluppato da Dudel, che ottimizzato macropatch ricodifica elettrodi24,25. Nell'implementazione di Dudel, questa tecnica non si discostano l' allentato-patch-clamp metodo26.
NMJ larvale Drosophila ha chiaramente definito boutons sinaptici e linee transgeniche con tag fluorescente neuronale geneticamente codificato (Vedi Tabella materiali) sono prontamente disponibili. Questi vantaggi ci ha permesso di registrare EJC e mEJCs da un bouton sinaptico selezionato20,21,22. Qui, descriviamo questa tecnica in dettaglio.

<table><tbody><tr><td>Sutter P-97</td><td>Sutter instrument</td><td>P-97</td><td>Estrattore di microelettrodi</td></tr><tr><td>Narishige MF-830</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>WPI MF200</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>Capari in vetro</td><td>WPI</td><td>B150-86-10</td><td>Casolari in vetro</td></tr><tr><td>Microtorch 1WG61</td><td>Grainer</td><td>1WG61</td><td>Microtorch</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit Elastomero Siliconico</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td>Silicone per la preparazione delle piastre</td></tr><tr><td>di dissezione Perni di dissezione</td><td>Amazon</td><td>B00J5PMPJA</td><td>Perni per il posizionamento delle</td></tr><tr><td>larve Pinzette</td><td>WPIINC</td><td>500342</td><td>Pinzette per il posizionamento dei perni, la rimozione delle viscere e delle trachee.</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>WPIINC</td><td>501778</td><td>Forbici per tagliare la cuticola delle larve e dei nervi.</td></tr><tr><td>Olympus BX61WI</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td>Microscopio verticale</td></tr><tr><td>Olympus Lumplan FL N 60x</td><td>Olympus</td><td>UPLFLN 60X</td><td>Obiettivo per microscopio 60X</td></tr><tr><td>Olympus UPlan FL N 10x</td><td>Olympus</td><td>Uplanfl N 10X</td><td>Obiettivo per microscopio 10X</td></tr><tr><td>Narishige Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>MHW-3</td><td>Micromanipolatore idraulico ad acqua a tre assi</td></tr><tr><td>npi Electronic GmbH ELC-03XS</td><td>npi Electronic GmbH</td><td>ELC-03XS</td><td>Amplificatore elettrofisiologico</td></tr><tr><td>A.M.P.I Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master 8</td><td>Elettrostimolatore</td></tr><tr><td>A.M.P.I Iso-Flex</td><td>A.M.P.I.</td><td>Iso-Flex</td><td>Stimolo Isolatore</td></tr><tr><td>TMC Tavolo antivibrante TMC</td><td></td><td>63-9090</td><td>Tavolo antivibrante</td></tr><tr><td>TMC Gabbia di Faraday</td><td>TMC</td><td>81-333-90</td><td>Gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Digidata Dell</td><td>Dell Dimension 5150</td><td>Computer con portaelettrodo Win XP OS</td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>MEH3SW</td><td>Portaelettrodo</td></tr><tr><td>Filtro ottico</td><td>Omega optical</td><td>XF 115-2</td><td>Cubo filtrante per il rilevamento di proteine fluorescenti verdi (GFP)</td></tr><tr><td>pCLAMP 8</td><td>Axon Instruments</td><td>8.0.0.81</td><td>Software per la registrazione del segnale</td></tr><tr><td>Quantan</td><td>Software interno</td><td></td> <td>per l'elaborazione del segnale</td></tr><tr><td>Canton-S (Wildtype)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64349</td><td>Linea di mosca di controllo</td></tr><tr><td>cpx SH1</td><td>Generoso dono della linea di mosca knock-out di J.T.</td><td></td> <td>Littleton-Complexin con aumento dell'esocitosi spontanea</td></tr><tr><td>CD8-GFP</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>5137</td><td>Linea di mosca con fluorescenza neuronale (GFP) Tag</td></tr></tbody></table>

macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila della giunzione neuromuscolare (NMJ) è un sistema eccellente modello per studiare la trasmissione sinaptica glutamatergic. Descriviamo la tecnica delle registrazioni macropatch focale delle correnti sinaptiche da boutons visualizzati alle NMJ larvale della drosofila . Questa tecnica richiede la realizzazione personalizzata di registrazione micropipette, come pure un microscopio composto dotato di un alto ingrandimento, obiettivo a immersione in acqua a lunga distanza, ottica (DIC) contrasto differenziale di interferenza e una fluorescente allegato. L'elettrodo di registrazione è posizionato sulla sommità di una bouton sinaptica selezionata visualizzata con ottica DIC, epi-fluorescenza o entrambi. Il vantaggio di questa tecnica è che permette di monitorare l'attività sinaptica di un numero limitato di siti di rilascio. L'elettrodo di registrazione ha un diametro di alcuni micron, e i siti di rilascio posizionati di fuori del cerchio dell'elettrodo non influenzano significativamente le correnti registrate. Le correnti sinaptiche registrate hanno cinetica veloce e possono essere facilmente risolto. Questi vantaggi sono particolarmente importanti per gli studi di linee mutanti volare con maggiore attività sinaptica spontanea o asincrona.

Macropatch focale registrazioni attivare monitoraggio attività sinaptica da selezionati boutons sinaptici (Figura 5). Quando l'elettrodo è posizionato sulla sommità di una bouton sinaptica (Figura 5A, sito 1), il mEJCs registrato (Figura 5, sito 1) hanno un ampiezze significativamente superiore al livello di rumore e affilate lievitazione (in una gamma di millisecondo). Quando l'elettrodo di registra...

Delle correnti sinaptiche possono essere registrate focale da visualizzati boutons sinaptici alla giunzione neuromuscolare larve instar terza della drosofila . Questa tecnica consente il monitoraggio dell'attività di una singola bouton sinaptica.

Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di monitorare l'attività sinaptica dei bottoni sinaptici visualizzati alla giunzione neuromuscolare larvale della drosophila. Un eccellente sistema modello facilmente modificabile alle manipolazioni genetiche. Questa tecnica può rispondere a domande chiave nella tua scienza.Come il modo in cui le mutazioni delle proteine sinaptiche regolano la trasmissione sinaptica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'attività di un numero limitato di siti di rilascio può essere monitorata e registrata correnti di cinetica veloce e può essere facilmente risolta. Per iniziare l'esperimento: preparare l'estrattore per microelettrodi.Utilizzare un microscopio con ingrandimento 35X per assicurarsi che il diametro interno dell'elettrodo estratto sia compreso tra sette e dieci micrometri. Conservare i capillari in contenitori ben chiusi per evitare l'accumulo di polvere. Successivamente, lucidare a fuoco i capillari utilizzando una micro forgia.Assicurarsi che il diametro interno finale dell'elettrodo lucidato sia di cinque micrometri. Quindi, passa alla piegatura. Fissare l'elettrodo nel manipolatore e posizionare la punta sopra il filamento

focal-macropatch-recordings-synaptic-currents-from-drosophila-larval

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Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.

Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

Applicazione di elettrofisiologia di sinapsi accessibile fornisce una misura quantificabile di attività sinaptica, utile per analizzare mutanti sinaptica. Questo articolo descrive un metodo di dissezione utilizzati per esporre le giunzioni neuromuscolari (NMJ)...

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Abbiamo sviluppato una preparazione intatto midollo cerebrale-spinale per registrare e monitorare l'attività elettrica tramite registrazione patch clamp da neuroni e altre cellule Mauthner reticulospinal in embrioni di zebrafish. Quindi, siamo in grado di registrare le correnti sinaptiche eccitatorie e inibitorie, attività del canale voltaggio-dipendente e potenziali d'azione dai neuroni chiave in un embrione in via di sviluppo.

Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

Impara a registrare correnti sinaptiche focali dalla giunzione neuromuscolare di larve di Drosophila. Questa tecnica elettrofisiologica permette di monitorare l'attività di singoli bouton sinaptici con cinetica rapida.

Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila

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