Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di monitorare l'attività sinaptica dei bottoni sinaptici visualizzati alla giunzione neuromuscolare larvale della drosophila. Un eccellente sistema modello facilmente modificabile alle manipolazioni genetiche. Questa tecnica può rispondere a domande chiave nella tua scienza.

Come il modo in cui le mutazioni delle proteine sinaptiche regolano la trasmissione sinaptica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'attività di un numero limitato di siti di rilascio può essere monitorata e registrata correnti di cinetica veloce e può essere facilmente risolta. Per iniziare l'esperimento: preparare l'estrattore per microelettrodi.

Utilizzare un microscopio con ingrandimento 35X per assicurarsi che il diametro interno dell'elettrodo estratto sia compreso tra sette e dieci micrometri. Conservare i capillari in contenitori ben chiusi per evitare l'accumulo di polvere. Successivamente, lucidare a fuoco i capillari utilizzando una micro forgia.

Assicurarsi che il diametro interno finale dell'elettrodo lucidato sia di cinque micrometri. Quindi, passa alla piegatura. Fissare l'elettrodo nel manipolatore e posizionare la punta sopra il filamento senza toccarlo.

Impostare il valore di calore al 60-70% del massimo e premere il pedale della micro forgia per uno o due secondi per riscaldare il filamento. Utilizzare un ago a forma di L per tirare delicatamente verso il basso la punta dell'elettrodo e piegare a circa 90 gradi. Tenere manualmente l'elettrodo sulla fiamma della torcia ed eseguire la seconda curva a sette-dieci millimetri dalla prima curva e con un angolo di circa 120 gradi.

Preparare una soluzione simile all'emolinfa o HL3. Conserva la soluzione nel frigorifero e preparala fresca ogni settimana. Preparare le pipette di stimolazione allo stesso modo delle pipette di vetro per la registrazione, senza piegarle.

Successivamente, inserire una pipetta di stimolazione in un portamicroelettrodi collegato a una siringa. Piastre di dissezione prodotte da piccole piastre di Petri rivestite con resina epossidica in gomma siliconica. Quindi, usando il forcipe, raccogli una larva errante del terzo stadio da una fiala.

Appuntare le larve posizionando il primo perno nella parte posteriore e un altro perno anteriore vicino ai ganci della bocca. Aggiungere la soluzione HL3. Sul lato dorsale delle larve fare un taglio usando le forbici a molla dal perno superiore a quello inferiore.

Appunta il filetto delle larve posizionando due spilli aggiuntivi sui lati sinistro e destro delle larve. Rimuovere le budella e la trachea usando una pinza. Taglia i nervi appena fuori dal cordone nervoso ventrale usando le forbici a molla.

Posizionare la capsula di Petri con il preparato sul tavolino da microscopio. Inserire l'elettrodo di riferimento nella vasca. Riempire l'elettrodo di registrazione con la soluzione HL3.

Sotto l'obiettivo 10X immergere l'elettrodo nella vasca e posizionarlo sopra i muscoli sei e sette dei segmenti addominali di due, tre o quattro utilizzando il micromanipolatore. Quindi, cambia l'obiettivo su 60X e metti a fuoco l'area di interesse utilizzando l'epi-florescenza o l'ottica DIC. Posizionare la punta dell'elettrodo sopra il bottone sinaptico, quindi premere l'elettrodo molto delicatamente sul muscolo poiché una pressione eccessiva potrebbe danneggiare l'NMJ o indurre un aumento dell'attività sinaptica spontanea.

Quindi, accendi l'amplificatore, la scheda AD e il computer. Quindi, scegli la modalità di morsetto di tensione sull'amplificatore. Avvia il software di acquisizione e scegli la modalità senza interruzioni e osserva l'aspetto dei MEJC sullo schermo del computer.

Assicurarsi che l'ampiezza dei MEJC sia compresa tra 0,2 e 0,7 nanoampere. Utilizzando un micro manipolatore sotto controllo visivo, posizionare l'elettrodo di stimolazione vicino all'assone, innervando i segmenti addominali da due a quattro. Applicare una pressione negativa tirando il pistone della siringa collegata al portaelettrodo in modo che l'assone venga tirato all'interno dell'elettrodo.

Quindi, accendi lo stimolatore. Ruotare la manopola sull'unità di isolamento per impostare una corrente zero e poi aumentarla delicatamente fino a quando non compaiono le EJC o fino al raggiungimento della soglia. Eseguire la stimolazione in regime di supersoglia.

Con la corrente di stimolazione aumenta di circa il doppio rispetto alla soglia per l'osservazione delle EJC. Misurare la resistenza di tenuta dell'elettrodo macro-patch di registrazione ruotando l'interruttore di resistenza dell'elettrodo dell'amplificatore sulla posizione di test di tenuta. Osservare il valore della resistenza di tenuta in giga ohm che verrà visualizzato nella finestra corrente.

Le registrazioni delle macro focali consentono di monitorare l'attività sinaptica da bottoni sinaptici selezionati. Quando l'elettrodo è posizionato sopra un bottone sinaptico, i MEJC registrati hanno ampiezze significativamente superiori al livello di rumore e fasi di aumento brusche a un intervallo inferiore al millisecondo. Quando l'elettrodo di registrazione viene allontanato dal bottone sinaptico di diversi micron, le ampiezze dei MEJC del registratore diminuiscono quasi fino al livello di rumore.

Le EJC registrate si distinguono a malapena dal rumore e hanno fasi di risalita prolungate. Le registrazioni focali consentono di rilevare con precisione i MEJC nel complesso e nel mutante gnome. Mentre le registrazioni intercellulari di questo mutante esibiscono eventi di rilascio che si sovrappongono e non possono essere rilevati in modo affidabile.

La regolazione degli angoli dell'elettrochip è fondamentale per il posizionamento dell'elettrodo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il controllo dell'imaging dei singoli eventi di rilascio, al fine di rispondere a ulteriori domande, come l'integrazione dell'attività delle singole zone attive.