Vivere la microscopia di fluorescenza delle cellule per osservare i processi essenziali durante la crescita delle cellule microbiche

L'obiettivo generale di questo approccio basato sulla microscopia è quello di osservare un processo centrale durante la crescita delle cellule batteriche. Questo metodo ci consente di affrontare importanti questioni in batteriologia, come ad esempio il modo in cui i processi essenziali vengono coordinati durante la crescita e la divisione delle cellule batteriche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che siamo in grado di utilizzare reagenti fluorescenti per visualizzare le superfici e le strutture delle cellule batteriche nelle cellule viventi.

In questo caso, utilizziamo questo metodo per fornire informazioni sui processi essenziali dell'Agrobacterium tumefaciens. Tuttavia, questo processo potrebbe essere adottato anche ad altri batteri per studiarne la crescita. Per iniziare, utilizzare un bastoncino di legno sterile o la punta di una pipetta per inoculare tre millilitri di ATGN Growth Medium, con una singola colonia di un ceppo wild-type o mutante di A.Tumifaciens.

Coltiva la coltura a 28 gradi Celsius e 225 giri/min durante la notte. Il giorno seguente, utilizzare uno spettrofotometro per misurare l'OD600. Quindi, diluire la coltura cellulare a un OD600 di circa 0,2 e continuare a far crescere le cellule fino a un OD600 di 0,6.

Erogare un millilitro di coltura esponenziale in tre provette per microfuge. E pellettare le celle in una centrifuga da tavolo a 7.000 x g per cinque minuti. Risospendere ogni pellet di cella in un millilitro di PBS, quindi aggiungere un microlitro di soluzione madre DMSO Orange o DAPI.

Mescolare delicatamente pipettando e incubare le cellule risospese al buio per cinque minuti. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 7.000 x g per cinque minuti e risospendere il pellet in un millilitro di PBS per rimuovere il reagente in eccesso. Quindi, lavare le celle altre due volte e risospendere il pellet in 50 microlitri di PBS o terreno.

Per l'imaging time-lapse simultaneo, combina dieci microlitri di cellule di ciascun trattamento in un nuovo tubo per microfuge. Per preparare i tamponi di agarosio per l'imaging cellulare, utilizzare un vetrino coprioggetto come guida e tagliare un quadrato di 22 x 22 millimetri di pellicola da laboratorio facendo scorrere un bisturi attorno ai bordi. Tagliare un quadrato dal centro della pellicola di laboratorio, lasciando un bordo di circa due o cinque millimetri che funga da guarnizione per il tampone di agarosio.

Quindi, scartare l'intaglio centrale. Posizionare la guarnizione della pellicola su un vetrino, pulire con un detergente senza ammoniaca e alcool. E usa un blocco termico impostato a 70 gradi Celsius o una fiamma per riscaldare la diapositiva fino a quando la pellicola non si è leggermente sciolta sul vetro.

Successivamente, preparare la soluzione di agarosio mescolando circa 0,075 grammi di agarosio e cinque millilitri di terreno in un piccolo pallone. Scaldare la soluzione in un forno a microonde con roteazione periodica per mescolare, fino a quando l'agarosio non si sarà sciolto e la soluzione sarà limpida. Mantieni la soluzione di agarosio a 55-70 gradi Celsius e usala per la costruzione di più cuscinetti di agarosio entro 48 ore.

Pipettare il terreno caldo di agarosio al centro della guarnizione. Quindi, posizionare un vetrino copricapo sulla guarnizione per distribuire uniformemente l'agarosio. Posizionare il vetrino su una superficie piana e fredda per solidificare per circa due minuti.

Ora, fai scorrere con cautela il vetrino coprioggetto dal tampone di agarosio, quindi lascia asciugare il tampone di agarosio all'aria per uno o due minuti a temperatura ambiente, fino a quando la superficie del tampone non appare asciutta. La corretta costruzione del tampone di agarosio è fondamentale per acquisire immagini di alta qualità. Non cercare di creare immagini su un pad difettoso.

Se il tampone di agarosio si secca, si increspa o si strappa, è meglio non essere pigri e creare invece un nuovo tampone. Quindi, usando un bisturi, rimuovi una piccola striscia di agarosio per creare una sacca d'aria di circa due per sette o dieci millimetri. Le cellule di Tumefacien tendono a crescere meglio vicino alla sacca d'aria.

Individuare da 0,8 a 1 microlitro di cellule sul tampone di agarosio. Quindi posizionare delicatamente un vetrino coprinte sulla parte superiore del tampone di agarosio per distribuire le cellule sulla superficie del tampone. Per l'imaging time-lapse a lungo termine, utilizzare Valap fuso per sigillare i bordi del vetrino coprioggetto.

Assicurarsi di sigillare lungo tutti i bordi e gli angoli del vetrino coprioggetto con Valap. In caso contrario, si può verificare una deriva durante l'imaging time-lapse del tampone di agarosio. Per eseguire la microscopia a epifluorescenza, posizionare l'olio da immersione sull'obiettivo desiderato e posizionare il vetrino rovesciato nel supporto del vetrino sul tavolino.

Utilizzare le manopole di messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule. Acquisisci immagini in fase, o DIC e fluorescenza, utilizzando il filtro di fluorescenza desiderato per le immagini a fluorescenza. Opzionalmente, acquisisci più posizioni x, y selezionando casualmente dieci campi di celle in prossimità della sacca d'aria dei cuscinetti di agarosio.

Impostare l'acquisizione della sequenza temporale per l'immagine in fase, o DIC, all'intervallo di tempo desiderato. Come mostrato qui, le cellule sono state acquisite direttamente dalla coltura dopo il lavaggio mediante centrifugazione e dopo aver incubato le cellule con lo 0,1% di DMSO, i risultati hanno mostrato che il DMSO da solo non influisce sulla morfologia cellulare. Sia il DNA marcato con Orange che DAPI all'interno di cellule vive di A.Tumefaciens.

Nelle cellule pre-divisionali tardive, si osservano due nucleoloidi distinti con colorazione Orange, mentre la marcatura del DNA appare più diffusa con colorazione DAPI. In questo esperimento time-lapse con una proporzione uguale di A.Tumefaciens wild-type non marcato, etichettato DAPI e marcato con arancione, tutte le cellule sono cresciute quando sono state visualizzate con la microscopia a contrasto di fase, indicando che nessuna delle due colorazioni ha compromesso la crescita cellulare. Le cellule sono cresciute anche sotto contrasto di fase nella microscopia a epifluorescenza utilizzando il filtro TRITC.

Quando vengono visualizzate con il filtro DAPI, tuttavia, le cellule smettono di crescere entro un'ora. Seguendo metodi simili, è possibile utilizzare anche altri reagenti fluorescenti per visualizzare la parete cellulare batterica o le membrane. Inoltre, molti di questi coloranti fluorescenti possono essere combinati per fornire un'immagine completa della superficie cellulare batterica.

La visualizzazione dei processi essenziali nei batteri vivi è entusiasmante, perché apre la possibilità di studiare questi processi in mutanti condizionali o batteri non modello. Questo ci permette di migliorare i nostri studi su diverse specie batteriche.