Metodi per analizzare gli impatti di uranio naturale il Osteoclastogenesis In Vitro

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare gli effetti dell'esposizione naturale all'uranio sulla vitalità, differenziazione e funzione degli osteoclasti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tossicità ambientale sull'impatto dell'esposizione all'uranio sulla fisiologia e sul metabolismo osseo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un nuovo interessante strumento per lo screening degli originatori di uranio.

Quando la coltura cellulare RAW 264.7 ha raggiunto l'85-90% di confluenza, utilizzare un raschietto cellulare per sollevare meccanicamente le cellule dal fondo del pallone di coltura cellulare e trasferire le cellule in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Pipettare la soluzione cellulare alcune volte per rompere i grumi e contare la sospensione a cellula singola risultante. Diluire le cellule a una concentrazione di 10 volte al quarto di cellule per millilitro in terreno essenziale minimo alfa modificato, integrato con L-glutammina e siero fetale bovino al 5% e aggiungere un millilitro di cellule per pozzetto a una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti per un'incubazione di sei ore a 37 gradi Celsius.

Un parametro importante per la riproducibilità del saggio di differenziazione e riassorbimento degli osteoclasti è la densità di semina cellulare. Prestare particolare attenzione al conteggio delle cellule, alla preparazione della sospensione cellulare e alla sua omogeneità prima di galvanizzare le cellule. Per preparare la soluzione salina per orinatoio, partendo da una soluzione acquosa di bicarbonato di sodio al 7,5% testata per colture cellulari sterili, preparare e raffreddare prima 100 millimolari di bicarbonato in acqua su ghiaccio e aggiungere un volume di soluzione di acetato per orinatoio da 100 millimolari, goccia a goccia, in nove volumi della soluzione di bicarbonato ghiacciato agitando delicatamente.

Lasciare che la soluzione si equilibri a temperatura ambiente. Dopo tre ore, diluire il volume appropriato di soluzione per orinatoio, goccia a goccia, in un mezzo di differenziazione contenente 50 nanogrammi per millilitro di RANKL fino a raggiungere la concentrazione di lavoro desiderata per l'orinatoio e lasciare altre tre ore di equilibrio a temperatura ambiente. Le lunghe fasi di incubazione dopo ogni diluizione del sale dell'orinatoio sono essenziali per la stabilizzazione dei complessi dell'orinatoio nelle soluzioni.

Al termine del secondo periodo di equilibratura, sostituire delicatamente il terreno in ciascun pozzetto con un millilitro di orinatoio trattato o di terreno di controllo, a seconda dei casi, e rimettere le cellule nell'incubatore. Gli osteoclasti multinucleati dovrebbero comparire tra il terzo e il quarto giorno di coltura. Per valutare le dimensioni e la morfologia degli osteoclasti appena differenziati, colorare le cellule con fosfatasi acida resistente ai tartrati, secondo le istruzioni del produttore e visualizzare l'intera superficie di ciascun pozzetto a una risoluzione sufficiente per distinguere i nuclei cellulari.

Quando tutti i pozzetti sono stati ripresi, aprire l'immagine di un pozzetto con il software ImageJ open source e verificare le unità di scala. Quindi seleziona la casella Globale nella finestra popup per applicare le nuove unità di scala a tutte le immagini successive. Nel menu Analizza, selezionare Imposta misurazioni e selezionare le caselle Area e Visualizza etichetta.

Deseleziona tutte le altre caselle. Nel menu Analizza, aprire Strumenti, quindi Gestione regione di interesse e selezionare lo strumento di selezione rettangolare nella finestra principale di ImageJ. Delineare una regione di interesse di circa 1.000 per 1.000 micrometri e fare clic sul pulsante Aggiungi per aggiungere la selezione al Gestore regione di interesse.

Quindi fare clic su Altro, Salva per salvare la regione. Per creare una copia di una delle cinque regioni da analizzare, selezionare la regione di interesse in Gestione regione di interesse e fare clic con il pulsante destro del mouse all'interno dell'area selezionata per duplicare la regione. Seleziona le caselle Mostra tutto ed Etichette e seleziona lo strumento di selezione del poligono per delineare manualmente uno degli osteoclasti nella regione duplicata di interesse.

Per aggiungere questa struttura alla Gestione regione di interesse, fare clic su Aggiungi nella finestra Gestione regione di interesse. Quando tutti gli osteoclasti sono stati aggiunti, selezionare tutti i contorni e fare clic su Misura per misurare le loro superfici. Quindi trasferisci le misurazioni che appaiono nella finestra dei risultati in un foglio di calcolo.

Per valutare la funzione degli osteoclasti trattati con orinatoio, un giorno prima di aggiungere il terreno di differenziazione, le cellule RAW vengono prelevate da una coltura cellulare confluente all'85-90% su una piastra per osteodosaggio a 24 pozzetti in terreno di crescita, come appena dimostrato. Il giorno successivo, sostituire delicatamente il surnatante con un orinatoio di differenziazione contenente terreno e lasciare che le cellule RAW si differenzino in osteoclasti, come appena dimostrato. Il quinto giorno di osteoclastogenesi, sostituire il terreno contenente orinatoio con una soluzione di candeggina al 10% per rimuovere le cellule dalla superficie mimetica ossea.

Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, lavare i pozzetti due volte con acqua deionizzata e lasciarli asciugare all'aria. Quindi, colorare i sali di calcio nelle aree non riassorbite di ciascun pozzetto con una soluzione di sale sodico rosso Alizarina S all'1%. Dopo 10-15 secondi, rimuovere la soluzione di alizarina e lavare delicatamente i pozzetti tre o quattro volte con acqua.

Per convertire un'immagine RGB dei pozzetti colorati con alizarina in un formato in scala di grigi a 8 bit, nel menu Immagine, selezionare Tipo e 8 bit. Quindi, utilizzando lo strumento di selezione ovale, delineare l'intera superficie del pozzetto da analizzare per il riassorbimento e salvare la regione di interesse, come appena dimostrato. Per facilitare la selezione della soglia, selezionare Modifica e Cancella esterno per cancellare tutte le feature al di fuori dell'area di interesse definita.

Duplica l'area di interesse come appena dimostrato e seleziona Regola soglia nel menu Immagine, regolando la barra di scorrimento per selezionare una soglia appropriata. Tutte le aree riassorbite devono essere al di sopra della soglia e apparire bianche, mentre tutte le aree non riassorbite devono essere al di sotto della soglia e apparire rosse. Per finalizzare la selezione della soglia, fare clic su Applica nella finestra Soglia e salvare l'immagine binaria finale nel formato appropriato di interesse.

Per definire le misure da effettuare all'interno della regione di interesse, nel menu Analizza, selezionare Imposta misure e selezionare le caselle Area, Frazione area e Limita alla soglia e deselezionare tutte le altre caselle. Quindi, per ottenere la frazione di area riassorbita direttamente all'interno della finestra dei risultati, invertire l'immagine binaria duplicata selezionando Inverti nel menu Modifica e facendo attenzione che la regione principale di interesse sia selezionata sull'immagine binaria finale e misurare la frazione di area riassorbita. I cambiamenti nel numero e nelle dimensioni degli osteoclasti appena differenziati in risposta all'uranio sono facilmente visibili nelle immagini composite di interi pozzi, così come nelle immagini ingrandite di regioni selezionate di interesse.

La dimensione degli osteoclasti cresciuti in diverse condizioni di coltura può essere analizzata, come appena dimostrato delineando tutti gli osteoclasti all'interno di ciascuna regione e misurando l'area di ciascuna cellula delineata. Per studiare l'impatto dell'uranio sull'attività di riassorbimento degli osteoclasti, le cellule RAW 264.7 sono piastrate e differenziate su piastre superficiali osteomimetiche. Al termine del test, gli osteoclasti vengono rimossi e le aree non riassorbite vengono colorate e visualizzate come dimostrato.

Le immagini vengono quindi convertite in scala di grigi a 8 bit e sogliate per facilitare il calcolo delle aree riassorbite. Questa procedura può essere applicata anche allo studio dell'impatto di altri metalli pesanti sull'osteoclastogenesi.