4.15: Annesso V ed etichettatura dello ioduro di propidio

La marcatura delle cellule con annessina V e ioduro di propidio (PI) è una tecnica utilizzata per identificare la morte cellulare e distinguere tra le sue diverse vie: apoptosi, o morte cellulare programmata, e necrosi. Le cellule subiscono cambiamenti morfologici distinti a seconda del percorso. Identificando le condizioni specifiche che portano una cellula a subire l'apoptosi o la necrosi, gli scienziati ottengono informazioni sulla fisiologia cellulare e sulla fisiopatologia della malattia. La marcatura dell'annessina V e del PI, seguita dalla citometria a flusso, si è affermata come uno dei metodi più efficienti per classificare il tipo di morte cellulare.

Oggi descriveremo come questo test aiuta nell'identificazione delle vie di morte cellulare, come eseguire questa tecnica e alcuni interessanti esperimenti di esempio che utilizzano questo metodo per rispondere a domande importanti nel campo della biologia cellulare.

Innanzitutto, diamo un'occhiata ai principi alla base dell'annessina V e della colorazione PI.

Come accennato in precedenza, le cellule apoptotiche mostrano caratteristiche morfologiche distintive. Questi includono il restringimento cellulare, il blebbing della membrana, la frammentazione nucleare e la comparsa di corpi apoptotici. Inoltre, in seguito all'induzione dell'apoptosi, cioè nella fase iniziale dell'apoptosi, compaiono alcuni cambiamenti caratteristici sulla membrana. Una membrana cellulare normale ha tutti i residui di fosfatidilserina o PS sul lembo interno. Tuttavia, nelle cellule apoptotiche precoci alcuni di questi residui di PS vengono traslocati sulla superficie esterna, ma come?

Per capirlo, facciamo un passo indietro. Durante l'apoptosi, è noto che vengono attivate le caspasi citosoliche. Questi enzimi a loro volta attivano un enzima legato alla membrana chiamato scramblase. Scramblase ?scrambles? la membrana cellulare traslocando i residui di PS dal lato citoplasmatico alla superficie esterna. Al contrario, durante la necrosi i residui di PS rimangono dove sono, ma la membrana stessa si rompe. L'annessina V e la marcatura PI sfruttano queste differenze nelle alterazioni di membrana dei due tipi di morte cellulare.

L'annessina V coniugata con un colorante fluorescente, come l'isotiocianato di fluoresceina, comunemente noto come FITC, è un ligando naturale impermeabile alla membrana per il PS, e quindi identifica facilmente le cellule apoptotiche precoci legandosi al PS esternalizzato. Tuttavia, in seguito alla rottura della membrana, che si verifica durante la necrosi e anche durante le fasi successive dell'apoptosi, l'annessina può anche legarsi al PS sulla faccia interna e produrre falsi positivi.

Per evitare ciò, gli scienziati usano PI. Questa molecola di colorante legante il DNA è di nuovo impermeabile alla membrana e può entrare in una cellula solo quando la membrana è rotta. Pertanto, se una cellula è colorata solo con annessina è apoptotica precoce, mentre una cellula che è sia PI che colorata con annessina potrebbe essere necrotica o apoptotica tardiva.

Ora che hai appreso i principi di base alla base di questo test, esaminiamo la procedura di colorazione e analisi della morte cellulare.

In primo luogo, le cellule vengono raccolte e centrifugate a bassa velocità per prevenire qualsiasi interruzione morfologica e risospese in tampone di lavaggio fisiologico come la soluzione salina tamponata con fosfato, nota anche come PBS. Dopo un'altra fase di centrifugazione, le cellule vengono risospese in un tampone legante l'annessina V contenente calcio, necessario per il legame dell'annessina al PS. L'annessina V coniugata con FITC viene quindi aggiunta alla soluzione, che viene incubata a temperatura ambiente al buio per consentire l'associazione tra annessina e PS. Nella fase successiva, il PI viene aggiunto direttamente alla soluzione cellulare di colorazione dell'annessina e incubato al buio. Dopo l'incubazione, le cellule vengono lavate in PBS mediante centrifugazione, risospese in tampone di lavaggio e mantenute in ghiaccio. Ora sono pronti per l'analisi.

L'attività di fluorescenza delle cellule viene analizzata mediante citometria a flusso, una tecnica basata su laser che acquisisce dati di fluorescenza da singole cellule sospese in un flusso di fluido. Dopo la calibrazione della fluorescenza utilizzando cellule colorate separatamente con ciascun colorante, vengono acquisiti i dati dalle celle a doppia colorazione. I segnali di fluorescenza provenienti dalla popolazione cellulare vengono utilizzati per creare un grafico in cui l'intensità FITC legata all'annessina viene tracciata sull'asse X logaritmico e PI sull'asse Y logaritmico. Le cellule che sono annessina-FITC positive e PI negative si raggrupperanno nella parte inferiore destra del grafico, rappresentando le cellule apoptotiche precoci, e le cellule doppiamente positive per l'annessina-FITC e PI si verificheranno in alto a destra, rappresentando le cellule apoptotiche o necrotiche tardive. Le cellule che rimangono non colorate o colorate in modo insignificante sia per l'annessina che per il PI sono cellule vive.

Dal momento che ora sai perché i biologi cellulari si affidano a questa tecnica per studiare la morte cellulare, perché non esaminiamo alcune delle sue applicazioni.

Utilizzando questa procedura, gli scienziati possono seguire quali proteine intracellulari sono coinvolte nell'apoptosi. In questo video, i ricercatori hanno analizzato l'effetto del cisplatino, un farmaco antitumorale, sulle cellule renali normali per vedere se induce l'apoptosi. Un gruppo di cellule è stato trasdotto per sovraesprimere una forma attiva dell'enzima proteina chinasi C, o PKC, e l'altro gruppo è stato trasdotto con una PKC negativa dominante in forma non funzionale. Le cellule che esprimono PKC e trattate con cisplatino hanno subito apoptosi nel tempo, ma le cellule che esprimono la PKC dominante negativa inattiva erano resistenti all'apoptosi, indicando che l'enzima è un attore chiave nella via dell'apoptosi indotta dal cisplatino.

I ricercatori usano queste colorazioni anche per testare il potenziale citotossico di specifiche cellule T. Le cellule T citotossiche possono riconoscere specifiche proteine di membrana sulla loro cellula bersaglio e indurne la morte dopo il legame con essa. Qui, i ricercatori hanno incubato cellule T antigene-specifiche con cellule tumorali bersaglio e annessina V, e quindi hanno osservato l'induzione dell'apoptosi delle cellule tumorali da parte del coinvolgimento delle cellule T. I dati della citometria a flusso hanno rivelato la percentuale di morte delle cellule bersaglio in presenza e assenza di cellule T citotossiche.

Infine, gli scienziati utilizzano questo metodo per valutare la vitalità cellulare dopo la consegna del gene. In questo caso, i ricercatori hanno voluto valutare la sopravvivenza cellulare dopo la nucleofezione, un metodo che utilizza una combinazione di sostanze chimiche e un campo elettrico applicato per creare pori transitori nelle membrane cellulari e nucleari, facilitando così la consegna genica. Utilizzando l'annessina V più un colorante chiamato 7-amminoattinomicina D o 7-AAD, che, in modo simile al PI si lega al DNA, hanno dimostrato che la nucleofeczione causa una bassa morte cellulare per apoptosi o necrosi.

Avete appena visto il video di JoVE sull'annessina V e la marcatura dei PI. In questo video, abbiamo brevemente discusso le caratteristiche distintive delle cellule apoptotiche e necrotiche, esaminato i principi alla base di questo metodo, osservato una procedura generalizzata per questa tecnica comunemente utilizzata e anticipato alcune applicazioni. Data l'importanza di comprendere come cellule diverse muoiono in condizioni diverse, l'annessina V e la marcatura PI rappresentano uno strumento importante per i biologi cellulari interessati a questo fenomeno. Come sempre, grazie per la visione!