Annesso V ed etichettatura dello ioduro di propidio

L’etichettatura delle cellule dell’annessina V e dello ioduro di propidio (PI) è una tecnica utilizzata per identificare la morte cellulare e distinguere tra le sue diverse vie: apoptosi, o morte cellulare programmata, e necrosi. Le cellule subiscono cambiamenti morfologici distinti a seconda del percorso. Identificando le condizioni specifiche che portano una cellula a subire apoptosi o necrosi, gli scienziati acquisiscono informazioni sulla fisiologia cellulare e sulla fisiopatologia della malattia. L’etichettatura dell’annessina V e PI, seguita dalla citometria a flusso, è stata stabilita come uno dei metodi più efficienti per classificare il tipo di morte cellulare.

Oggi descriveremo come questo test aiuta nell’identificazione dei percorsi di morte cellulare, come eseguire questa tecnica e alcuni entusiasmanti esperimenti di esempio che utilizzano questo metodo per rispondere a domande importanti nel campo della biologia cellulare.

Per prima cosa, diamo un’occhiata ai principi alla base della colorazione dell’annessina V e PI.

Come accennato in precedenza, le cellule apoptotiche presentano caratteristiche morfologiche distintive. Questi includono il restringimento cellulare, il blebbing della membrana, la frammentazione nucleare e la comparsa di corpi apoptotici. Inoltre, in seguito all’induzione dell’apoptosi, cioè nella fase apoptotica iniziale, alcuni cambiamenti caratteristici appaiono sulla membrana. Una normale membrana cellulare ha tutti i residui di fosfatidilserina o PS sul foglietto interno. Tuttavia, nelle prime cellule apoptotiche alcuni di questi residui di PS vengono traslocati sulla superficie esterna, ma come?

Per capirlo, facciamo un passo indietro. Durante l’apoptosi, è ben noto che vengono attivate le caspasi citosoliche. Questi enzimi a loro volta attivano un enzima legato alla membrana chiamato scramblasi. La scramblasi “strapazza” la membrana cellulare traslocando i residui di PS dal lato citoplasmatico alla superficie esterna. Al contrario, durante la necrosi i residui di PS rimangono dove sono, ma la membrana stessa si rompe. L’etichettatura dell’annessina V e dell’PI capitalizza queste differenze nelle alterazioni di membrana dei due tipi di morte cellulare.

L’annessina V coniugata con colorante fluorescente, come l’isotiocianato di fluoresceina, comunemente noto come FITC, è un ligando naturale impermeabile alla membrana per PS e quindi identifica facilmente le prime cellule apoptotiche legandosi alla PS esternalizzata. Tuttavia, a seguito della rottura della membrana, che si verifica durante la necrosi e anche durante le fasi successive dell’apoptosi, l’annessina può anche legarsi alla PS sulla faccia interna e produrre falsi positivi.

Per evitare questo, gli scienziati usano PI. Questa molecola di colorante che lega il DNA è di nuovo impermeabile alla membrana e può entrare in una cellula solo quando la membrana è rotta. Pertanto, se una cellula è solo macchiata di annessina, è apoptotica precoce, mentre una cellula che è sia PI che annessina colorata potrebbe essere necrotica o apoptotica tardiva.

Ora che hai imparato i principi di base alla base di questo test, passiamo attraverso la procedura di colorazione e analisi della morte cellulare.

In primo luogo, le cellule vengono raccolte e centrifugate a bassa velocità per prevenire qualsiasi interruzione morfologica e riconsocie in tamponi di lavaggio fisiologici come la soluzione salina tamponata con fosfato, nota anche come PBS. Dopo un’altra fase di centrifugazione, le cellule vengono risuscilate in un tampone legante l’annessina V contenente calcio, che è necessario per il legame dell’annessina alla PS. L’annessina V coniugata con FITC viene quindi aggiunta alla soluzione, che viene incubata a temperatura ambiente al buio per consentire l’associazione di annessina e PS. Nella fase successiva, PI viene aggiunto direttamente alla soluzione cellulare di colorazione dell’annessina e incubato al buio. Dopo l’incubazione, le cellule vengono lavate in PBS mediante centrifugazione, risuscilate nel tampone di lavaggio e mantenute sul ghiaccio. Ora sono pronti per l’analisi.

L’attività di fluorescenza delle cellule viene analizzata mediante citometria a flusso, una tecnica basata su laser che acquisisce i dati di fluorescenza da singole cellule sospese in un flusso di fluido. Dopo la calibrazione della fluorescenza utilizzando cellule colorate separatamente con ciascun colorante, vengono acquisiti i dati delle cellule a doppia colorazione. I segnali di fluorescenza provenienti dalla popolazione cellulare vengono utilizzati per creare un grafico in cui l’intensità FITC legata all’annessina viene tracciata sull’asse X logaritmico e PI sull’asse Y logaritmico. Le cellule che sono annexin-FITC positive e PI negative si raggruppano sul lato inferiore destro della trama, rappresentando le prime cellule apoptotiche, e le cellule doppie positive per annexin-FITC e PI si verificheranno in alto a destra, rappresentando le cellule apoptotiche o necrotiche tardive. Le cellule che rimangono non macchiate o macchiate in modo insignificante sia per l’annessina che per la PI sono cellule vive.

Dal momento che ora sai perché i biologi cellulari si affidano a questa tecnica per studiare la morte cellulare, perché non esaminiamo alcune delle sue applicazioni.

Usando questa procedura, gli scienziati possono seguire quali proteine intracellulari sono coinvolte nell’apoptosi. In questo video, i ricercatori hanno analizzato l’effetto del cisplatino, un farmaco anti-cancro, sulle normali cellule renali per vedere se induce l’apoptosi. Un insieme di cellule è stato trasdotto per sovraesprimere una forma attiva dell’enzima proteina chinasi C, o PKC, e l’altro insieme è stato trasdotto con una forma non funzionale, PKC negativa dominante. Le cellule che esprimono PKC e trattate con cisplatino hanno subito apoptosi nel tempo, ma le cellule che esprimono la PKC negativa dominante inattiva erano resistenti all’apoptosi, indicando che l’enzima è un attore chiave nella via dell’apoptosi indotta dal cisplatino.

I ricercatori usano anche queste macchie per testare il potenziale citotossico di specifiche cellule T. Le cellule T citotossiche possono riconoscere specifiche proteine di membrana sulla sua cellula bersaglio e indurne la morte dopo il legame ad essa. Qui, i ricercatori hanno incubato cellule T antigene-specifiche con cellule tumorali bersaglio e annessina V, e poi hanno osservato l’induzione dell’apoptosi delle cellule tumorali da parte dell’impegno delle cellule T. I dati della citometria a flusso hanno rivelato la percentuale di morte delle cellule bersaglio in presenza e assenza di cellule T citotossiche.

Infine, gli scienziati utilizzano questo metodo per valutare la vitalità cellulare dopo la consegna del gene. In questo caso, i ricercatori hanno voluto valutare la sopravvivenza cellulare dopo la nucleofezione, un metodo che utilizza una combinazione di sostanze chimiche e un campo elettrico applicato per creare pori transitori nelle membrane cellulari e nucleari, facilitando così la consegna dei geni. Usando l’annessina V più un colorante chiamato 7-aminoactinomicina D o 7-AAD, che, simile al PI si lega al DNA, hanno dimostrato che la nucleofezione ha causato una bassa morte cellulare per apoptosi o necrosi.

Hai appena visto il video di JoVE sull’etichettatura annexin V e PI. In questo video, abbiamo brevemente discusso le caratteristiche distintive delle cellule apoptotiche e necrotiche, esaminato i principi alla base di questo metodo, guardato una procedura generalizzata per questa tecnica comunemente usata e presentato in anteprima alcune applicazioni. Data l’importanza di capire come cellule diverse muoiono in condizioni diverse, l’etichettatura dell’annessina V e PI funge da strumento importante per i biologi cellulari interessati a questo fenomeno. Come sempre, grazie per aver guardato!