Name: Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Impara a generare anticorpi monoclonali umani da linfociti B circolanti nel sangue. Questo metodo consente di isolare rare cellule B antigene-specifiche per applicazioni terapeutiche come l'immunoterapia.

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Ringraziamo la struttura Cytometry "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) per assistenza tecnica. Ringraziamo anche tutto il personale di produzione di proteine ricombinanti (P2R) e di piattaforme di impatto (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) per il loro supporto tecnico. Ringraziamo Emmanuel Scotet e Richard Breathnach per commenti costruttivi sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto IHU-Cesti finanziato dal programma di governo francese «Investissements d'Avenir», gestito da Francese Nazionale Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e Région Pays de la Loire. Quest'opera è stata realizzata nell'ambito del programma LabEX IGO supportato dall'agenzia di ricerca nazionale tramite l'investimento del futuro programma ANR-11-LABX-0016-01.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo proposto è un metodo potente per la generazione di anticorpi monoclonali umani direttamente dalle cellule di B di Ag-specifici circolanti nel sangue. Essa combina tre importanti aspetti: (i) l'uso di un arricchimento magnetico tetramero-collegato, che permette un isolamento ex vivo di cellule B Ag-associazione anche rare; (ii) una strategia di gating che utilizza tre tetrameri di Ag (due più rilevanti e irrilevanti uno) etichettati con tre diversi fluorocromi per isolare, mediante citometria a flus...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56508/generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood</a>.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

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Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Il metodo qui descritto consente la produzione rapida e versatile di pienamente umana gli anticorpi monoclonali (mAbs) contro un antigene desiderato (Ag). mAbs sono strumenti essenziali per molte applicazioni di ricerca fondamentale in vitro e in vivo: flusso cytometry, istologia, esperimenti di western blotting e blocchi per esempio. Inoltre, mAbs vengono utilizzati più in medicina per curare le malattie autoimmuni, il cancro e per controllare il rigetto di trapianto1. Ad esempio, mAb anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recentemente sono stati usati come inibitori di checkpoint immuni in cancro trattamenti2.
Il primo mAbs sono state prodotte da immunoglobulina (Ig)-secernendo ibridomi ottenuti dalle cellule spleniche di topi immunizzati o ratti. Tuttavia, la forte risposta immunitaria contro anticorpi monoclonali murini o ratto ostacola il loro uso terapeutico negli esseri umani, a causa della loro rapida clearance e il probabile induzione di reazioni di ipersensibilità3. Per affrontare questo problema, sequenze di proteine animali di mAbs sono stati parzialmente sostituiti da quelli umani per generare i cosiddetti anticorpi chimerici topo-umani o umanizzati. Tuttavia, questa strategia diminuisce solo parzialmente immunogenicità, aumentando sostanzialmente sia il costo e il tempo-scala di produzione. Una soluzione migliore è quello di generare anticorpi monoclonali umani direttamente da linfociti B umani e sono disponibili diverse strategie per questo. Uno di loro è l'uso del display dei fagi o lievito. Questo comporta la visualizzazione di domini variabili da una libreria combinatoria di Ig umana casuale pesanti e catene leggere su fagi o lieviti e realizzazione di un punto di selezione usando l'antigene specifico di interesse. Un grande svantaggio di questa strategia è che le catene pesanti e chiare sono casualmente associate, portando ad un aumento molto grande nella diversità degli anticorpi generati. Gli anticorpi ottenuti difficilmente corrispondono a quelli che deriverebbero da una risposta immunitaria naturale contro un particolare Ag. Inoltre, modificazioni post-traduzionali e ripiegamento di proteine umane non sono sistematicamente riproducibili nei procarioti o anche nei lieviti. Un secondo metodo di produzione di mAb umana è l'immortalizzazione dei linfociti B umani naturali, dall'infezione del virus Epstein - Barr o espressione dei fattori anti-apoptotico BCL-6 e BCL-XL4. Tuttavia, questo metodo è applicabile solo alle cellule di B di memoria ed è inefficiente, che richiede la selezione delle cellule di B immortalizzate mAb-producendo numerose per identificare i cloni di mAb pochi (se presente) con la specificità antigenica desiderata. Il metodo è così costoso e che richiede tempo.
Recentemente è stato descritto un nuovo protocollo per la produzione di mAbs umana da isolato singolo B cellule5. Essa si basa su un ottimizzato unicellulare Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) per l'amplificazione di entrambi i pesanti - e della luce-catena codifica segmenti da una singola cellula B ordinata. Questo è seguito dalla clonazione e l'espressione di questi segmenti in un sistema di espressione eucariotico, permettendo così la ricostruzione di un mAb pienamente umana. Questo protocollo è stato usato con successo a partire da cellule B da donatori vaccinati. Le cellule sono state raccolte diverse settimane dopo la vaccinazione per ottenere frequenze più alte delle cellule di B dirette contro l'Ag desiderato e quindi limitare il tempo necessario per lo screening di6. Altri mAbs pienamente umana sono state prodotte anche da pazienti infetti da HIV+ (Virus dell'immunodeficienza umana)7 e melanoma pazienti8. Nonostante questi progressi, non c'è ancora nessuna procedura disponibile che permette l'isolamento di cellule B Ag-specifici indipendenti del loro fenotipo memoria o la frequenza.
La procedura descritta qui conduce all'isolamento efficiente ex vivo di cellule B circolanti umane basato sulla loro specificità BCR, seguita dalla produzione di pienamente umano mAbs antigene-specifiche nell'alto rendimento e con un tempo di proiezione bassa. Il metodo non è limitato a cellule B memoria o cellule B disecrezione indotte dopo una risposta immunitaria, ma può essere applicato anche al repertorio delle cellule di B ingenui umano. Che funziona anche a partire da cellule B Ag-specifici presenti a frequenze molto basse è una buona indicazione della relativa efficienza. Il principio del metodo è come segue: le cellule mononucleari di sangue periferico (PBMC) sono macchiati con due tetrameri che presentano l'antigene di interesse, ognuno etichettato con un fluorocromo diverso (ad es., ficoeritrina (PE) e Allophycocyanin (APC)), e un terzo tetramero presentando un antigene strettamente correlato coniugato con un fluorocromo terzo (ad es., Brillant Violet 421 (BV421)). Per arricchire per le cellule antigene-legante, le cellule sono poi incubate con perline rivestite con anti-PE e Abs anti-APC e ordinati in colonne di separazione delle cellule. La frazione di cellule APC PE+ + è selezionata, macchiato con una varietà di anticorpi specifici per diversi tipi di cellule PBMC permettere l'identificazione delle cellule di B e sottoposto al flusso cytometry ordinamento delle cellule. Cellule di B che sono PE+ e APC+, ma brillante viola-, sono isolate. Questo passaggio Counter-seleziona le celle che non sono le cellule B o non legarsi all'antigene tetramerized, ma associa al PE o APC (queste cellule saranno PE+ APC– o PE– APC+) o la parte non-antigene dei tetrameri utilizzato (questi le cellule saranno BV421+). Le cellule B non altamente specifiche per l'epitopo di interesse Counter-vengono selezionate anche in questa fase (queste cellule saranno anche BV421+). Pertanto, questo metodo può purificare altamente specifici linfociti B che esprimono recettori di cellule B (BCR) in grado di discriminare tra due antigeni molto strettamente correlati. Cellule B specifiche singole sono raccolti in provette e loro PCR-amplificato Ig cDNA (acidi desossiribonucleico complementari) clonato ed espresso da una linea cellulare umana come secrete IgG anticorpi monoclonali.
Come un proof of concept, questo studio descrive la generazione efficiente di mAbs umano, che riconosce un peptide ha presentato da una classe di complesso maggiore di istocompatibilità (MHC-I) molecola e in grado di discriminare tra questo peptide e altri peptidi caricati sullo stesso MHC-I allele. Anche se il livello di complessità di questa Ag è importante, questo metodo (i) permette il recupero di ad alto rendimento di Marazzi Ag-specifici; (ii) la produzione di anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra due strutturalmente chiudere Ags. Questo approccio può essere esteso ai pazienti vaccinati o infetti senza alcuna modifica del protocollo e ha anche già stato implementato con successo in un ratto umanizzata sistema9. Quindi, questo studio descrive un approccio versatile ed efficiente per generare mAbs pienamente umano che può essere utilizzato nella ricerca di base e l'immunoterapia.

<table><tbody><tr><td>HEK 293A linea cellulare</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco di life technologies</td><td>21969-035</td><td>(+) 4,5g/L D-Glucosio 0,11g/L Piruvato di sodio (-) L-Glutmine</td></tr><tr><td>RPMI medium1640 (1X)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Fosfato Soluzione Salina Tamponata (10X) pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Acido etilendiamminotetraacetico) 0,5M pH=8</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - separazione dei linfociti medio</td><td>EuroBio</td><td>CMSMSL01-01</td><td>densità 1,0777+/-0,001</td></tr><tr><td>streptavidina R-ficoeritrina coniugato</td><td>Invitrogen di Life Technologies</td><td>S21388</td><td>grado premiun 1mg/ml contiene 5mM di sodio azide</td></tr><tr><td>streptavidina, alloficocianina coniugato</td><td>Invitrogen di thermoFisher scientific</td><td>S32362</td><td>1mg/ml 2mM azide di prima qualità</td></tr><tr><td>Brilliant violet 421 streptavidina</td><td>Biolegend</td><td>405225</td><td>conc : 0,5mg/ml</td></tr><tr><td>Microsfere magnetiche coniugate anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere magnetiche coniugate anti-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACs o separatore QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302/130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Colonne LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizon</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>Diluizione usata 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>Diluizione usata 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>Diluizione usata 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>Diluizione usata 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Diluizione usata 1:1000</td></tr><tr><td>FACS ARIA III Cell Sorter Citometro</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette PCR a 8 strisce</td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>Rack per 96 microprovette</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Inibitore della ribonucleasi (ricombinante)</td><td>Invitrogen di thermoFisher scientific</td><td>10777-019</td><td>qtà:5000U (40U/ul)</td></tr><tr><td>Acqua distillata Senza Dnase/Rnasi</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod(T)18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>Esameri casuali</td><td>Invitrogen di thermoFisher scientific</td><td>N8080127</td><td>qtà: 50uM, 5nmoles</td></tr><tr><td>Superscript III Trascrittasi inversa</td><td>Invitrogen di thermoFisher scientific</td><td>18080-044</td><td>qtà : 10000U (200U/ul)</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polimerasi</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, grado di biologia molecolare</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4*100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>Eurofins</td><td>CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni -Primer inversi per Ig umane - Screening PCR di batteri</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>Eurofins</td><td>GGGAATTCTCACA GGAGACGA</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni -Primer inversi per Ig umane</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_5_7</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTCAGCTGGTGCAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti</td></tr><tr><td>5AgeIVH3_23</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti</td></tr><tr><td>5AgeIVH4_34</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer diretti</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer in avanti</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer in avanti</td></tr><tr><td>5AgeIVH3__9_30_33</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer 5AgeIVH6_1</td></tr><tr><td></td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer diretti</td></tr><tr><td>3SalIJH1_2_4_5</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGTGACCAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer inversi</td></tr><tr><td>3SalIJH3</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer inversi</td></tr><tr><td>3SalIJH6</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGTGGTGTG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer inversi</td></tr><tr><td>5' LVk1_2</td><td>Eurofins</td><td>ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni - Primer diretti</td></tr><tr><td>5'LVk3</td><td>Eurofins</td><td>CTCTTCCCTCTGC TACTCTGGCTCCCAG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni -Primer diretti</td></tr><tr><td>5'LVk4</td><td>Eurofins</td><td>ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni - Primer diretti</td></tr><tr><td>3'Ck543_566</td><td>Eurofins</td><td>GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni -Primer inversi - Screening PCR batterico</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1_9_1&ndash; 13</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1D_43_1_8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer in avanti</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2_28_2_30</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_11_3D_11</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC Secondo</td><td>ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer diretti</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_15_3D_15</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer diretti</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_20_3D_20</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti</td></tr><tr><td>5'AgeVk4_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk1_2_4</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGTC</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk3</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk5</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti</td></tr><tr><td>5'LVl1</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer esterni -Primer diretti</td></tr><tr><td>5'LVl2</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer esterni -Primer diretti</td></tr><tr><td>5'LVl3</td><td>Eurofins</td><td>GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer esterni -Forward primer</td></tr><tr><td>5'LVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer esterni -Primer diretti</td></tr><tr><td>5'LVl6</td><td>Eurofins</td><td>GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer esterni -Primer diretti</td></tr><tr><td>5'LVl7</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer esterni -Primer diretti</td></tr><tr><td>5LVl8</td><td>Eurofins</td><td>GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer esterni -Primer diretti</td></tr><tr><td>3'Cl</td><td>Eurofins</td><td>CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG</td><td>Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer esterni -Forward primer</td></tr><tr><td>5'AgeIVl1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer interni - Primer in avanti</td></tr><tr><td>5'AgeIVl2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer interni - primer in avanti</td></tr><tr><td>5'AgeIVl3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer interni - Primer in avanti</td></tr><tr><td>5'AgeIVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer interni - primer in avanti</td></tr><tr><td>5'AgeIVl6</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer interni - Primer in avanti</td></tr><tr><td>5'AgeIVl8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer interni - primer in avanti</td></tr><tr><td>3'XhoICl</td><td>Eurofins</td><td>CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG</td><td>Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere &lambda; - Primer interni -Primer inversi - Screening PCR</td></tr><tr><td>batterico Ab-vec-sense</td><td>Eurofins</td><td>GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC</td><td>Screening PCR batterico</td></tr><tr><td>QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade</td><td>MP Bio</td><td>AGAH0500</td><td></td></tr><tr><td>NucleoFast 96 PCR Plate</td><td>Macherey Nagel</td><td>743.100.100</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme Age I HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzima SalI HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzima Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzima BSIWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553L</td><td>10000U/ml</td></tr><tr><td>HCg1 (numero di accesso Genbank FJ475055)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCk (numero di accesso Genbank FJ475056</td><td></td><td></td><td></td></tr>)<tr><td>LCl (adesione Genbank numero FJ517647)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>Invitrogen di thermoFisher scientific</td><td>15224.017</td><td>100U (1U/ul)</td></tr><tr><td>2X YT medio</td><td>Sigma</td><td>Aldrich Y1003-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Luria Bertani) Brodo (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Plasmide DNA, RNA e per purificazione di proteine</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Jet PEI Reagente per trasfezione DNA</td><td>PolyPlus</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>Fondo piattoPiastra a 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti con fondo a V</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>055142</td><td></td></tr><tr><td>Nunc easy 175 cm2 Flaconi</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>12-562-000</td><td></td></tr><tr><td>ELISA/ELISPOT tampone di rivestimento</td><td>eBiosciences</td><td>00-0044-59</td><td></td></tr><tr><td>Nunc maxisorp fondo piatto 96 pozzetti Piastre ELISA</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>44-2404-21</td><td>alto legame proteico</td></tr><tr><td>Anti-IgG umano Ab coniugato alla perossidasi di rafano (HRP)</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>55788</td><td></td></tr><tr><td>Substrato TMB</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina</td><td>Sigma</td><td>S0677</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-HiTrap proteina A colonna HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0402-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Colonna KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18190026</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td> Sistema cromatografico <td>GE Healthcare</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>NGC Quest 10 Plus</td><td>BioRad</td><td>7880003</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari b antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono potenti strumenti utili per entrambi ricerca fondamentale e della biomedicina. Loro alta specificità è indispensabile quando l'anticorpo è necessario distinguere tra strutture altamente correlate (ad es., una proteina normale e una versione mutata della stessa). L'attuale modo di generare tali mAbs discriminativo coinvolge vasta selezione di più celle di produzione di Ab B, che è sia costoso e richiede tempo. Vi proponiamo qui un metodo rapido ed economico per la generazione di discriminante, mAbs pienamente umana, a partire da sangue umano fare circolare i linfociti B. L'originalità di questa strategia è dovuto la selezione delle celle di associazione B antigene specifico combinato con il Counter-selezione di tutte le altre celle, utilizzando prontamente disponibili Peripheral Blood mononucleari cellule (PBMC). Una volta specifici linfociti B sono isolate, sequenze di cDNA (complementare dell'acido deossiribonucleico) che codifica per il mAb corrispondente sono ottenute utilizzando tecnologia single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) e successivamente espresse in umani cellule. In meno di 1 mese, è possibile produrre milligrammi di mAbs umano altamente discriminante nei confronti di praticamente qualsiasi antigene desiderato naturalmente rilevato dal repertorio musicale delle cellule di B.

A partire da PBMC da donatori sani, questo project presenta la generazione di anticorpi monoclonali umani, che riconoscono il peptide Pp65495 (Pp65, da citomegalovirus umano) presentata dalla classe complesso maggiore di istocompatibilità I (MHC-I) molecola HLA - A * 0201 ( HLA-A2). Questi anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra questo complesso e complessi che rappresentano altri peptidi caricati su stesso MHC-ho molecola.
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Descriviamo un metodo per la produzione di anticorpi umani specifici per un antigene di interesse, a partire da rari linfociti B circolanti nel sangue umano. Generazione di questi anticorpi naturali è efficiente e rapido, e gli anticorpi ottenuti in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre anticorpi monoclonali completamente umani contro un antigene desiderato a partire dai linfociti B umani circolanti nel sangue. Questo protocollo consente la generazione di anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati. Per alcune applicazioni, come l'immunoterapia, il targeting preciso di un antigene può essere indispensabile.I vantaggi di questa tecnica sono che questa può essere eseguita a partire dal sangue di donatori sani o immunizzati e permette l'isolamento anche di cellule B leganti l'antigene anche rare. Sebbene questo metodo sia descritto a partire da campioni umani, può essere applicato anche ad animali che possono essere pre-immunizzati. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la procedura è davvero soggetta a una strategia di gating analitico multiplo piuttosto complessa dei linfociti B discriminati.La procedura sarà eseguita da Melinda. È un assistente ingegnere del nostro laboratorio. Prima pipetta 35 millilitri di sospensione cellulare diluita su 15 millilitri di gradiente di densità in una provetta conica da 50 millilitri.Quindi posizionare il tubo conico in un rotore a secchiello oscillante con i freni disattivati e centrifugare a 1290 volte la gravità per 25 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, all'interfaccia tra il mezzo di gradiente di densità e lo strato di plasma, aspirare con cura lo strato di cella mononucleata e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere la sospensione cellulare a una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 460 volte la gravità per cinque minuti.Quindi, risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato con siero bovino fetale al 2%. Aggiungere tetrameri coniugati ad una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro. Mescolare bene e poi incubare a temperatura ambiente per 30 minuti nella cappa a flusso laminare, al riparo dalla luce.Quindi aggiungere 10 millilitri di tampone di separazione cellulare ghiacciato alla sospensione cellulare. Centrifugare la sospensione della cella a 460 volte la gravità per cinque minuti. Al pellet cellulare ottenuto, aggiungere 500 microlitri di tampone di separazione cellulare ghiacciato e 50 microlitri di due varianti di microsfere magnetiche e incubare la sospensione cellulare per 20 minuti.Quindi, risospendere il pellet della cella nel tampone di separazione delle celle ghiacciate. Trasferire con cautela la sospensione cellulare sulla parte superiore di una colonna equilibrata e lasciarla scolare completamente. Quindi sciacquare la provetta con tre millilitri di tampone di separazione cellulare e trasferire il tampone nella colonna.Dopo aver risciacquato la colonna tre volte, rimuoverla dal magnete e posizionarla su un tubo di raccolta conico da 25 millilitri. Dopo aver aggiunto cinque millilitri di tampone di separazione ghiacciato sulla parte superiore della colonna, lavare rapidamente le celle dalla colonna con l'aiuto di uno stantuffo. Risospendere il pellet cellulare con un cocktail di anticorpi anti-umani e 7AAD in un volume totale di 100 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato con il 2% di siero fetale bovino.Quindi, incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, utilizzare un citometro selezionatore cellulare per ordinare specifiche cellule B a livello di singola cellula non superando 1.000 eventi al secondo. Quindi, raccogliere le singole cellule B selezionate in provette PCR a 8 strisce precedentemente riempite con 10 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato 1X e 10 unità di inibitore dell'RNAsi e posizionarle su un rack per 96 microprovette.Congelare rapidamente i tubi a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Riscaldare i campioni congelati in un bagno asciutto mantenuto a 70 gradi Celsius per cinque minuti per lisare le cellule. Quindi posizionare la striscia sul ghiaccio e iniziare a costituire il master-mix di trascrizione inversa.Una volta preparato il master-mix di trascrizione inversa, il programma istruisce il termociclatore. Al termine della trascrizione inversa, eseguire PCR annidate per amplificare i geni delle immunoglobuline. Identificare i cloni positivi visualizzando su un gel di agarosio all'1,5% la migrazione di un prodotto PCR a 500 coppie di basi per segmenti codificanti e a catena pesante variabili e di un prodotto PCR a 350 coppie di basi per segmenti codificanti a catena leggera variabile.Aggiungere un microlitro del prodotto di clonazione a 45 microlitri di cellule elettrocompetenti TOP10 di E.coli. Elettroporato. Quindi aggiungere rapidamente 500 microlitri di terreno 2X YT alle cellule e incubare a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Distribuire i batteri trasformati su una piastra di ampicillina 2X YT.Quindi, incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius. Quindi, impostare una premiscela di reazione e aggiungerne 25 microlitri in ogni provetta PCR da 8 strisce conservata sul ghiaccio. Quindi, usa uno stuzzicadenti sterile per raccogliere le colonie e striare le colonie sulla piastra di ampicillina 2X YT.Quindi, immergere gli stuzzicadenti nella provetta di reazione PCR. Identificare i cloni positivi visualizzando su un gel di agarosio all'1,5% la migrazione di un prodotto PCR a 850 coppie di basi per il vettore della catena pesante e di un prodotto PCR a 600 coppie di basi per il vettore della catena leggera. In due millilitri di terreno LB, inoculare quattro colonie positive.Incubare l'inoculo a 37 gradi Celsius durante la notte a 200 giri al minuto agitando. Semina 15.000 cellule renali embrionali umane in 200 microlitri di Dulbecco's Modified Eagle Medium integrato con il 10% di siero fetale bovino in ogni pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti un giorno prima della trasfezione. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per una notte al 5% di anidride carbonica.Cotrasfettare le cellule utilizzando un reagente di trasfezione derivato dalla polietilenimmina lineare. Diluire 0,5 microlitri di reagente di trasfezione del DNA con 10 microlitri di 150 millimolari di cloruro di sodio. Successivamente, diluire 0,125 microgrammi di ciascun vettore che esprime catene pesanti e leggere variabili in 10 microlitri di cloruro di sodio da 150 millimolari.Agitare tutte le diluizioni per 10 secondi ciascuna. Quindi, mescolare il reagente di trasfezione del DNA precedentemente diluito con 10 microlitri di soluzione di DNA. Agitare rapidamente la miscela di trasfezione del DNA per 15 secondi e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Aggiungere la miscela di trasfezione del DNA goccia a goccia sulle cellule e poi agitare delicatamente la piastra. Sostituire il terreno 16 ore dopo la trasfezione e coltivare le cellule per cinque giorni in terreno privo di siero a 37 gradi Celsius. Quindi, utilizzare una pipetta multicanale per aspirare il surnatante e trasferirlo nella piastra a 96 pozzetti con fondo a V.Rivestire ogni pozzetto in una piastra ELISA a 96 pozzetti con l'antigene pertinente a quattro gradi Celsius per una notte in 100 microlitri di tampone di rivestimento ELISA ricostituito a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di surnatante cellulare trasfettato ai pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti e incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo anti-immunoglobulina G umana coniugato all'enzima perossidasi di rafano a una concentrazione di microgrammo per millilitro e incubare il pozzetto a temperatura ambiente per un'ora.Infine, aggiungere 50 microlitri di substrato cromogenico al pozzetto e incubare per altri 20 minuti. Al termine dell'incubazione, leggere la densità ottica a 450 nanometri su uno spettrofotometro. Per isolare le cellule B specifiche è stata utilizzata una strategia di gating che discriminava le cellule B che esprimevano recettori contro il complesso HLA-A2/Pp65.Inizialmente, le cellule erano CD19 positive, CD3 negative gated. Infine, le cellule sono state colorate sia con HLA-A2/Pp65PE che con HLA-A2/Pp65APC, ma non con i tetrameri HLA-A2/MelABV421, sono stati gated per ottenere le cellule B altamente specifiche. Utilizzando questa strategia di gating, è possibile isolare cellule B selettive, in grado di differenziare tra HLA-A2/Pp65 e altri complessi peptidici HLA-A2 correlati.Successivamente, per studiare la presenza di anticorpi PC1.02 contro il tetramero HLA-A2/Pp65 è stato eseguito un test ELISA. Nel grafico a barre ottenuto, l'asse y corrisponde alle letture di densità ottimali e l'asse x corrisponde ai peptidi HLA-A2. Dal test, mostra che un anticorpo monoclonale si lega con il tetramero HLA-A2/Pp65 in modo dipendente dal peptide e dal complesso maggiore di istocompatibilità.Successivamente, la residenza della plasmina di superficie è stata utilizzata per studiare l'affinità di legame dell'anticorpo PC1.02. Quindi, sono stati ottenuti dati tabulari per analizzare le cellule B specifiche HLA-A2/Pp65. È stato dimostrato l'impatto della strategia di esclusione delle cellule B non specifiche, le rese dell'amplificazione genica delle immunoglobuline e la produzione di anticorpi monoclonali da cellule B specifiche HLA-A2/Pp65.Una volta padroneggiata, la tecnica che va dall'isolamento di cellule B specifiche per antigeni dal sangue umano alla produzione di anticorpi monoclonali può essere eseguita in appena un mese. Quando si esegue questa procedura, ricordarsi di passare direttamente dallo smistamento delle cellule B alla RT-PCR senza pause.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra un metodo di generazione di anticorpi da cellule di mammifero introducendo vettori plasmidici con geni a catena pesante e leggera. Questi vettori interagiscono con la polietilenimmina ed entrano nelle cellule formando poliplessi; Successivamente, vengono tradotte in singole proteine e assemblate in anticorpi completi, che vengono secreti nel mezzo extracellulare.

Generazione di anticorpi monoclonali ricombinanti da colture cellulari di mammifero

Il video mostra una tecnica per generare anticorpi monoclonali da cellule B antigene-specifiche. I vettori di espressione eucariotici che codificano per le catene pesanti e leggere di anticorpi, clonati da cellule B isolate antigene-specifiche, vengono introdotti nelle cellule di mammifero utilizzando poliplex. Una volta all'interno delle cellule, questi vettori subiscono la traduzione e i peptidi a catena pesante e leggera risultanti si assemblano in anticorpi, che vengono successivamente...

Una tecnica per generare anticorpi monoclonali da cellule B antigene-specifiche

Questo articolo descrive un metodo per la generazione e la propagazione di cloni di cellule T umane che rispondono specificamente a un alloantigene definito. Questo protocollo può essere adattato per la clonazione di cellule T umane specifiche per una varietà di ligandi peptidici-MHC.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

La sintesi di anticorpi monoclonali umani è il primo passo negli studi volti a svelare i meccanismi fisiopatologici delle risposte immunitarie mediate da auto-anticorpi. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare anticorpi monoclonali ricombinanti di immunoglobuline G (IgG) umane da cellule B selezionate per sangue, tra cui l'isolamento delle cellule B, il clonaggio di anticorpi e la sintesi in vitro.

Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B

Il sangue periferico umano è comunemente usato per la valutazione della risposta immunitaria umorale. Qui vengono descritti i metodi per isolare le cellule B umane dal sangue periferico, differenziare le cellule B umane in cellule B secernenti anticorpi (ASC) in coltura ed enumerare le IgM- e IgG-ASC totali tramite un test ELISpot.

L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

Viene presentato un protocollo ottimizzato per la generazione di anticorpi monoclonali basati sulla tecnologia degli ibridomi. I topi sono stati immunizzati con un immunoconiugato. Le cellule della milza sono state fuse mediante PEG e un impulso elettrico con cellule di mieloma immortale. Le cellule di ibridoma produttrici di anticorpi sono state selezionate mediante HAT e screening ELISA antigene-specifico.

Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Un metodo semplice ma efficace che si avvale di nanoparticelle magnetiche per rilevare e arricchire le cellule B antigene-reattiva per l'analisi funzionale e fenotipica è descritto.

Rilevamento e l&#39;arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l&#39;analisi del fenotipo e funzione

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione e la valutazione degli anticorpi monoclonali contro prodotti naturali per l'utilizzo in vari test immunologici. Questa procedura comprende l'immunizzazione, la fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto per clone positivo di screening e preparazione di ibridoma monoclonale. A vostra disposizione anche le specifiche per la caratterizzazione dell'anticorpo usando MALDI-TOF-MS e le analisi di ELISA.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

Il metodo BSelex per identificare e recuperare singoli anticorpi specifici dell'antigene dalle cellule mononucleari del sangue periferico umano combina citometria di flusso con PCR a cella singola e clonazione.

Metodo di screening a singola cellula per la selezione e il recupero di anticorpi con specifiche desiderate da popolazioni di cellule di memoria umana b arricchite

Descriviamo qui una semplice analisi dell'eterogeneità del compartimento delle cellule B immunitarie murine nel peritoneo, nella milza e nei tessuti del midollo osseo mediante citometria a flusso. Il protocollo può essere adattato ed esteso ad altri tessuti di topo.

Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine

Impara a generare anticorpi monoclonali umani da linfociti B circolanti nel sangue. Questo metodo consente di isolare rare cellule B antigene-specifiche per applicazioni terapeutiche come l'immunoterapia.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

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