Name: Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per lanalisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Impara a isolare le ghiandole mammarie intatte di topo per analizzare l'espressione delle proteine della matrice extracellulare e l'architettura duttale. Questo metodo supporta la ricerca sullo sviluppo e sui tumori.

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Gli autori desidera ringraziare aprile Wiles e Dr. Roger Broderson per assistenza con l'autopsia degli animali e l'isolamento della ghiandola, rispettivamente. Finanziamenti per quest'opera è stato sostenuto dai centri di Philadelphia College of Osteopathic Medicine per malattie croniche di invecchiamento.

procedure che coinvolgono animali soggetti in questo protocollo sono stata esaminate e approvate dal comitato di uso del Philadelphia College di medicina osteopatica e istituzionali Animal Care e tutte le tecniche sono state condotte sotto rigoroso linee guida etiche.
 1. esempio approvvigionamento e trattamento <ol><li>selezionare appropriato soggetto animale e posto in una camera di CO 2. Per questo esperimento, utilizzare 8-10 settimane vecchio donna nullipara B6. CG-Cav1tmMIs/J e C57BI/6J.</li>
	<li>Disabilita il flusso del gas a 30-40%. Una volta che l'animale è visibilmente incosciente dopo circa 2 min, aprire la valvola del gas a piena pressione per un minimo di 5 ulteriori 
	Nota: Confermare la morte degli animali osservando i segni visibili di respirazione (es. movimento del torace) per un periodo di 10 min dopo cessazione della CO 2 consegna. Se l'animale è ancora vivo, può essere inserito nel vano di CO 2. Dislocazione cervicale può anche essere utilizzata anche se non è raccomandato in quanto sangue può accumularsi intorno alle ghiandole mammarie interferire con i risultati e dissezione.</li>
	<li>a seguito di sacrificio, perno carcassa in posizione supina e saturare con etanolo al 70%.</li>
	<li>Pizzicare la pelle appena sopra il pube usando il forcipe e nick con piccole forbici chirurgiche. Ruotando le forbici, tagliare la pelle lungo la linea mediana ventrale spostamento caudale alla cranica.</li>
	<li>Con grandi forbici o una pinza emostatica, senza mezzi termini sezionare la fascia sottocutanea bilateralmente, prestando attenzione a non per perforare il peritoneo. Tagliare lungo i margini orizzontali ad entrambe le estremità distale dell'incisione.</li>
	<li>Pin pelle lembi aprire e spruzzare di nuovo con etanolo al 70%. 
	Nota: Sebbene migliore distinzione visiva tra la ghiandola e il tessuto sottocutaneo circostante è consentito l'uso di etanolo al 70%, prestare attenzione per evitare la disidratazione del tessuto a seguito di utilizzo di questa soluzione. Per evitare l'essiccazione, è necessario rimuovere la ghiandola in un lasso di tempo non deve superare i 4 min. Come alternativa all'etanolo al 70%, lo sperimentatore può anche sostituire un buffer isolato generale, ad esempio di PBS 1X, per evitare il disseccamento del tessuto.</li>
	<li>Individuazione ghiandole mammarie di interesse, far scorrere una lama per bisturi #4 lungo la parte interna delle alette pelt, taglio la ghiandola mammaria ed adiposo cutaneo associato gratuito dal derma. 
	Nota: micro chirurgici Occhialini 3.5 x può essere di aiuto in più facile visualizzazione delle ghiandole.</li>
	<li>Immergere immediatamente appena isolata ghiandola nella provetta contenente il volume di soluzione 10:1-tessuto di 10% formalina neutra tamponata per 24-48 h. 
	Nota: A seconda dell'intenzione di studio, molti fissativi alternativi possono essere utilizzati come paraformaldeide, etanolo per studi di genomici e commercialmente disponibile RNA preservando buffer.</li>
	<li>Seguire protocolli istituzionali per inclusione in paraffina, invio di campioni a un fornitore per l'elaborazione, l'incorporamento e affettare/scivolo montaggio. Sezione di tessuti a 5 µm. 
	Nota: A causa di eccesso adiposa ghiandola circostante, provare a rimuovere 100-200 µm del tessuto prima di sezionamento e macchiatura.</li>
</ol> 2. Colorazione del tessuto <ol><li>Immunohistochemistry <ol><li>diapositive posto per essere colorato sul blocco termico impostato a 58 ˚ c per 1 h sciogliere la paraffina. 
		Attenzione: Paraffina, cera di fusione può essere eseguito fuori diapositiva. Monitorare attentamente o collocare tampone imbevuto sotto slide per catturare cera ballottaggio. 
		Nota: Questo passaggio non è essenziale e può essere ignorato. Se i risultati non sono come previsto, l'aggiunta di questo passo indietro può migliorare i risultati.</li>
		<li>Incubare diapositive in una diapositiva di vaso contenente 100% xilene per 30 min garantendo la completa immersione. Ripetere un' volta. 
		Nota: A questo punto, ispezione visiva deve essere eseguita per garantire che le sezioni di tessuto sono prive di tessuto adiposo e paraffina. Se il tessuto adiposo supplementare o cera è evidente, la diapositiva deve essere immersi nuovamente in xilene. Prestare attenzione per ridurre al minimo l'esposizione aggiunto a xilene come questo può causare il restringimento del tessuto.</li>
		<li>Tessuti di reidratare in un barattolo di diapositiva contenente etanolo al 100% per un minimo di 10 ripetono un' volta.</li>
		<li>Mossa diapositive a un barattolo di diapositiva contenente etanolo al 95% per un minimo di 10 ripetono un' volta.</li>
		<li>Spostare le diapositive a una diapositiva vaso contenente 75% di etanolo per 5 min</li>
		<li>Spostare le diapositive a un diapositiva barattolo contenente 50% di etanolo per 5 min.</li>
		<li>Bollire la soluzione di citrato di sodio di 10 mM (pH 6.0) in un piatto caldo o un forno a microonde e versare nella vaschetta di Coplin. 
		Attenzione: Soluzione durante il riscaldamento di monitorare attentamente e prestare attenzione per evitare l'ebollizione sopra. Contenitore sarà molto calda. Utilizzare la protezione per evitare scottature.</li>
		<li>Lentamente posto diapositive in Coplin jar, garantendo la completa immersione e incubare a 100 ° C per 10 minuti recuperare gli epitopi. Rimuovere e asciugare accuratamente diapositive.</li>
		<li>Disegnare una barriera intorno sul tessuto con un pennarello idrofobo. Aggiungere sufficiente blocco degli enzimi endogeni (perossido di idrogeno e sodio azide, disponibile in commercio) per ricoprire il tessuto e incubare per 10 min.</li>
		<li>Diapositive di sommergere in 1 fosfato x tampone salino (PBS) per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere abbastanza siero di asino di 10% in PBS 1X per ricoprire il tessuto e incubare per 1 h a temperatura ambiente in una camera umidificata. 
		Nota: L'esperimento può essere sospeso qui memorizzando i vetrini nella camera umidificata a 4 ° C durante la notte. Mentre asino siero è stato trovato per produrre risultati ottimali di colorazione, lo sperimentatore può voler testare diversi sieri come albumina di siero bovino (BSA), siero di capra o di siero equino per determinare un risultato ottimale. Se usando BSA, lo sperimentatore deve preparare questo fresco prima dell'uso.</li>
		<li>Decantare in eccesso blocker da diapositive e aggiungere anticorpo primario correttamente diluito in 1% siero direttamente a diapositive assicurando che il tessuto sia coperto uniformemente nella soluzione. Incubare per 30 min a temperatura ambiente in una camera umidificata. 
		Nota: Questo passaggio può essere continuato per periodi di tempo più lunghi con camera umida conservata a 4 ° C. Assicurati di inserire diapositive di adeguato controllo negativo (ad esempio una diapositiva con nessun anticorpo primario, noto tessuto antigene-negativi, ecc.) in questa fase.</li>
		<li>Accuratamente lavare i vetrini da che scorre circa 1 mL di diH 2 O del tessuto ed incubare 1 cambio di 1X PBS per 5 min.</li>
		<li>Decantare l'eccesso di PBS e aggiungere abbastanza etichetta di perossidasi di rafano per ricoprire il tessuto ed incubare per 30 min in una camera umidificata. 
		Nota: In questa fase, l'investigatore può voler procedere alla colorazione utilizzando anticorpi secondari coniugati fluorescente fluorescente. Se questo è desiderato, i prossimi passi descritti dovrebbero essere modificati di conseguenza.</li>
		<li>Accuratamente lavare i vetrini da che scorre circa 1 mL di diH 2 O del tessuto ed incubare 1 cambio di 1X PBS per 5 min.</li>
		<li>Fare diaminobenzidina (DAB) plus soluzione cromogena secondo il rapporto consigliato del produttore e mescolare Vortex. 
		Nota: Molti kit già pronti sono disponibili in commercio oltre a quello utilizzato in questo protocollo.</li>
		<li>Eccesso di decantare buffer da diapositive e aggiungere 2-3 gocce (10-50 µ l) di cromogeno macchia direttamente ai tessuti e Incubare per 5 minuti in camera umida. Lavare accuratamente le diapositive da che scorre circa 1 mL diH 2 O del tessuto. 
		Attenzione: Il cromogeno DAB è altamente tossico. Evitare il contatto diretto della macchia con pelle e raccogliere il flusso fuori in rifiuti pericolosi.</li>
	</ol></li> <li>Ematossilina ed eosina (H &#38; E) <ol><li>dopo il risciacquo finale dopo incubazione di cromogeno, immergere diapositive in ematossilina di Harris per diapositive di risciacquo 2-2.5 min delicatamente sotto l'acqua corrente per un minimo di 1-2 
		Nota: fare attenzione a evitare il getto diretto di acqua sui tessuti.</li>
		<li>Submerge diapositive per 2-3 e in soluzione di differenziazione (0,25 mL di acido cloridrico in 100 mL di etanolo al 70%). Sciacquare i vetrini delicatamente sotto l'acqua corrente per circa 1-2 min</li>
		<li>Immergere diapositive in agente blu (4,5 mg di carbonato di calcio in 100 mL acqua di rubinetto, pH regolato a 9,4) per 60 s. diapositive di risciacquo in etanolo al 95% per 30 s.</li>
		<li>Diapositive di sommergere in alcolica eosina Y per 2-3 min.</li>
		<li>Disidratare tessuto in 2 cambi di etanolo al 95% per 1 min ogni.</li>
		<li>Tessuto di disidratare in 1 cambiare di etanolo al 100% per 1 min.</li>
		<li>Asciugare accuratamente le diapositive con un panno privo di lanugine. Applicare 1 goccia (circa 100-200 µ l) di sintetico, non acquoso, media per far scorrere e coprire con vetrino coprioggetto di montaggio a base di resine. 
		Nota: Se è stato scelto un diverso metodo di colorazione, un supporto di montaggio può essere richiesto. Per esempio, se il ricercatore ha scelto un anticorpo secondario coniugato fluorescente, un montaggio acquoso sarebbe più ideale.</li>
		<li>Vetrini impostare una notte a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Percentuale rosso (PSR) colorazione <ol><li>scegliere diapositive da essere macchiato e seguire il protocollo di esame immuno-istochimico tramite il passaggio 6 (ammollo 50% etanolo).</li>
		<li>Diapositive di immergere nel PSR macchia per 1 h.</li>
		<li>Immergere i vetrini in 0,5% di acido acetico per 1-2 s, due volte a differenziare macchia.</li>
		<li>Disidratare tessuti in 2 cambi di etanolo al 95% per 1 min ogni.</li>
		<li>Tessuti di disidratare in 1 cambiare di etanolo al 100% per 1 min.</li>
		<li>Cancellare diapositive immergendo brevemente in xilene 100% per circa 3-4 s.</li>
		<li>Asciugare accuratamente le diapositive con un panno privo di lanugine. Applicare 1 goccia (circa 100-200 µ l) di sintetico, non acquoso, media per far scorrere e coprire con vetrino coprioggetto di montaggio a base di resine.</li>
	</ol></li></ol> 3. Analisi di esempio <ol><li>Ductal analisi <ol><li>selezionare vetrini colorati per α-SMA. Utilizzando un microscopio ottico dotato di un obiettivo telecamera montata, raccogliere immagini rappresentative a 20 ingrandimenti.</li>
		<li>Using ImageJ (NIH), distinguere e contare condotti in ogni immagine. Questi possono essere enumerati manualmente o uno può assegnare un punteggio numerico a condotti singoli. Per assegnare un punteggio numerico, aprire ImageJ e selezionare plug-in. Successivamente selezionare Analyze e scegliere contatore di cellule dal menu a discesa. Fare clic su Inizializza quindi evidenziare tipo 1 per iniziare etichettatura condotti. Al termine, selezionare risultati per visualizzare il conteggio ductal. 
		Nota: fare attenzione a verificare che siano strutture ductal e non vascolare.</li>
		<li>In &#39; misura impostare &#39; opzioni, verifica &#39; perimetrale &#39; e &#39; zona &#34;.</li>
		<li>Con lo strumento poligono a mano libera, tracciare una linea intorno ogni condotto presso il vano myoepithelial (visibilità aiutata dalla macchia del α-SMA). Selezionare &#39; misura &#39; e registrare il perimetro e area.</li>
		<li>Nuovamente utilizzando lo strumento poligono a mano libera, disegnare una linea lungo il lato apicale dell'epitelio duttale all'interno del lume. Selezionare &#39; misura &#39; e registrare il perimetro e area.</li>
		<li>Sottrarre il perimetro del vano luminal dal perimetro del vano myoepithelial al fine di ottenere la circonferenza dell'epitelio duttale. Sottrarre l'area del vano luminal dall'area del vano myoepithelial per ottenere l'area dell'epitelio duttale.</li>
	</ol></li> <li>Analisi Immunohistochemistry <ol><li>caricare immagini di campo chiaro un software analitici, quali ImageJ o FIJI Suite. 
		Nota: Questo protocollo vengono delineati i passaggi per la macchiatura analisi usando ImageJ e il plugin Toolbox IHC.</li>
		<li>Aprire la Toolbox di IHC dal menu Plugin. Nella &#34; Seleziona modello &#34; casella combinata che si apre, selezionare macchia appropriato (cioè H-DAB, PSR, ecc.). Selezionare il &#34; colore &#34; opzione per isolare la macchia. Verrà aperta una finestra risultato. 
		Nota: Questo metodo è appropriato se una proteina di interesse è situata negli spazi extracellulari o citosolici, o è associata alla membrana plasmatica. Se la proteina di interesse è nucleare, selezionando &#34; Nuclei &#34; verrà richiesto il plugin per analizzare l'immagine per nuclei positivamente macchiati.</li>
		<li>Utilizzare il Color Chooser Slide per garantire il corretto isolamento della macchia senza sfondo inclusione o esclusione eccessiva macchia. 
		Nota: Se la modalità automatica è in grado di rilevare la macchia o non si traduca in immagini accettabili, disegnare un quadrato regione di interesse (ROI) sopra un identificati macchiato regione. Nella finestra di IHC casella degli strumenti, selezionare &#34; ferroviaria &#34; per dirigere il plugin alla destinazione appropriata.</li>
		<li>Convertire l'immagine a 16 bit. Vai alla immagine &#8594; tipo &#8594; 16bit.</li>
		<li>Soglia l'immagine. Vai alla immagine &#8594; regolare &#8594; Auto soglia.</li>
		<li>Impostare la scala di misurazione immagine tracciando una linea ROI direttamente sopra la barra della scala nell'immagine assegnando la lunghezza. Per impostare la barra della scala, vai su Analyze &#8594; Imposta scala. Immettere il numero di pixel per unità di lunghezza (per esempio 120 pixel per 50 µm) desiderata.</li>
		<li>Misurare l'area risultante e valore grigio medio. Vai alla Analyze &#8594; impostare misure e raccogliere la misurazione cliccando Analyze &#8594; misura.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nel libro, abbiamo descritto una tecnica per isolare le ghiandole mammarie del mouse intatto per le analisi istologiche a valle di espressione di ECM e morfologia duttale. Per quanto riguarda l'analisi della morfologia duttale, questa metodologia consente l'indagine rapida dell'architettura duttale basata al largo di sezioni istologiche macchiate. Altri metodi di analisi ductal si basano sulle iniezioni di coloranti per consentire la visualizzazione dell'albero duttale, metodi che possono essere tecnicamente impegnativo ...

Cancro al seno è caratterizzato da un notevole grado di fibrosi del tessuto1,2,3,4. Indicato come ECM, questa entità non cellulare è trovata in vari gradi in tutti i tessuti e principalmente è costituita da un complesso reticolo di collageni fibrillari e non fibrillare, elastina e glicoproteine oltre a varie molecole di segnalazione che sono sequestrato in questa matrice. Condizioni omeostatiche, la deposizione e la degradazione dell'ECM è strettamente controllato. 5 durante il tumorigenesis mammario, l'equilibrio della deposizione di ECM e degradazione viene interrotto. Come tale, i tumori del seno sono stati segnalati per esprimere proteine ECM abbondanti come il collagene, fibronectina e tenascin-C tra gli altri. 6 l'espressione anormale di queste proteine oltre ai modelli di maggiore di reticolazione della matrice è stato documentato per promuovere seno tumore progressione, metastasi e terapia resistenza1,3, 4,7,8,9.
Per valutare la composizione di ECM e morfologia duttale, isolamento delle ghiandole mammarie intatti è stato effettuato. Qui, abbiamo usato donna nullipari topi carenti per caveolin-1, una proteina integrale di membrana che è stata collegata a un aggressivo al seno tumore firma10,11,12e controllo donna nullipara B6 topi. Istologica di lavorazione e colorazione di questi tessuti consentito l'identificazione di parecchie proteine ECM insieme a caratterizzazione della morfologia duttale.
Nel complesso, l'isolamento delle ghiandole mammarie interi, intatti offre ai ricercatori l'opportunità di studiare i cambiamenti morfologici o cellulare di tutto il tessuto che si verificano in risposta a fattori esogeni o endogeni. Svantaggi della tecnica sono associati con analisi delle sezioni del tessuto di 2 dimensioni (2D) al contrario di una prospettiva 3D, che produrrebbe un'immagine più completa della complessa morfologia dell'albero duttale. Data la complessità delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM che si svolgono nella ghiandola mammaria, l'isolamento delle ghiandole interi, intatti è vantaggioso per analizzare in modo efficiente ductal morfologia ed espressione della proteina in varie regioni di mammario murino della ghiandola.

<table><tbody><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera per microscopio</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Olympus</td><td>cellSens Software</td><td></td></tr><tr><td></td> di ingresso <td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R Micro lenti chirurgiche</td><td>Rose Micro Solutions</td><td></td><td>Ingrandimento a preferenza del ricercatore</td></tr><tr><td>Mayo Forbici</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>Rack per colorazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colorazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>Barattoli Coplin</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>in vetro Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Dimensioni appropriate per il tessuto</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, alcolico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponata neutra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Xileni, grado reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>etanolo, 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>adatto per biologia molecolare</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>citrato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>permanente Mezzo di montaggio</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt's Mezzo di montaggio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo fibronectina</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Tenascin-C</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Smooth Muscle Actin Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Dual Link System HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento delle ghiandole mammarie mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

L'obiettivo di questa procedura era raccogliere le ghiandole mammarie addominale #4 da topi femmine nullipare al fine di valutare l'espressione di ECM e architettura duttale. Qui, una piccola tasca sotto la pelle è stata creata utilizzando forbici Mayo, permettendo la separazione delle ghiandole all'interno del tessuto sottocutaneo dal peritoneum sottostante. Visualizzazione delle ghiandole è stata aiutata dall'uso di 3.5 micro lenti di ingrandimento chirurgiche x-R. Il cuoio è stato invertito e frenate permettendo identificazione delle pastiglie grasse mammarie intatte. Ciascuna delle ghiandole addominali #4 senza mezzi termini è stato dissecato facendo scorrere la lama del bisturi lateralmente tra lo strato sottocutaneo e le ghiandole. Immediatamente dopo il raccolto, ghiandole sono state collocate in 10% formalina neutra tamponata per l'elaborazione successiva del tessuto. L'asportazione di intera ghiandola è vantaggioso perché principalmente Elimina il rischio di escludere importanti tutto il tessuto interazioni tra cellule epiteliali duttali e altre popolazioni cellulari microambientali che potrebbero essere perso in una biopsia parziale. Uno svantaggio della metodologia è l'uso delle sezioni di serie dai tessuti fissi che limita l'analisi dell'espressione di morfogenesi e proteica ductal per luoghi discreti all'interno della ghiandola. Come tale, cambiamenti nell'espressione della proteina e architettura duttale in 3 dimensioni (3D) non è facilmente ottenibile. Nel complesso, la tecnica è applicabile agli studi che richiedono tutto intatti murini ghiandole mammarie per le indagini a valle quali inerente allo sviluppo del cancro ductal di morfogenesi o al seno.

I topi femminili hanno 5 paia di ghiandole mammarie. In particolare, c'è una coppia di ghiandole cervicali (#1), due paia di ghiandole toraciche (#2 e #3), una coppia di ghiandole addominali (#4) e 1 paio di ghiandole inguinali (#5) (Figura 1A). Qui, abbiamo isolato le ghiandole #4 come sono facilmente identificabili. In alcune circostanze, sia #4 e #5 ghiandole sono state isolate insieme come distinzione tra i due era difficile. Per isolare ...

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento del mouse intero, intatto ghiandole mammarie per studiare l'espressione di matrice extracellulare (ECM) e morfologia duttale. Mouse #4 ghiandole addominali sono state estratte da topi femmine nullipare 8-10 settimane vecchio, fissato in formalina neutra tamponata, sezionato e macchiato usando immunohistochemistry per proteine ECM.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di prelievo dell'intera ghiandola mammaria è quello di facilitare l'analisi della presentazione istologica del tessuto mammario da una ghiandola intatta ex-vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei tumori, come ad esempio come il tessuto stromale viene rimodellato nei tumori o come l'espressione aberrante di geni o proteine altera l'architettura duttale mammaria. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai ricercatori di caratterizzare e quantificare l'espressione proteica e l'architettura duttale in intere ghiandole mammarie di topi sani e malati.A dimostrare questa tecnica sarà Chris Thompson, uno studente laureato nel mio laboratorio. Dopo aver sacrificato topi nullipare femmine di 8-10 settimane secondo il protocollo di testo, fissare la carcassa in posizione supina e utilizzare il 70% di etanolo per saturarla. Usa una pinza per pizzicare la pelle appena sopra il pube e intaccarla con piccole forbici chirurgiche.Quindi, ruotando le forbici, tagliare la pelle lungo la linea mediana ventrale, spostandola da caudale a craniale. Con forbici più grandi o un emostato, sezionare senza mezzi termini la fascia sottocutanea bilateralmente, facendo attenzione a non perforare il peritoneo. Tagliare lungo i margini orizzontali su entrambe le estremità distali dell'incisione.Quindi, appunta i lembi della pelle e spruzza il fazzoletto con PBS per mantenerlo umido. Quindi, individuando le ghiandole mammarie di interesse, far scorrere una lama di bisturi lungo l'interno dei lembi della pelle, liberando la ghiandola mammaria e l'adiposo sottocutaneo associato dal derma. Prima di separare la ghiandola addominale dall'inguinale, fare attenzione a identificare le ghiandole il più distintamente possibile.Immergere immediatamente la ghiandola appena isolata in una provetta conica contenente circa sei millilitri di una soluzione 10 a uno per il volume del tessuto 10% di formalina tamponata neutra e incubarla per 24-48 ore. Dopo aver sciolto la paraffina dai vetrini e reidratato le fette secondo il protocollo di testo, far bollire una soluzione di citrato di sodio da 10 millimolari su una piastra calda o in un forno a microonde e versare la soluzione in un barattolo di Coplin. Posizionare lentamente i vetrini nel barattolo Coplin, assicurandosi che siano completamente immersi, e incubare i vetrini a 100 gradi Celsius per 10 minuti per recuperare gli epitopi.Quindi, rimuovere e asciugare accuratamente i vetrini. Quindi, disegna una barriera attorno al tessuto con un marcatore idrofobico. Una volta asciugato, sciacquare i vetrini con PBS per uno o due secondi.Quindi, aggiungere una quantità sufficiente di bloccante enzimatico endogeno per coprire il tessuto e incubare i vetrini per 10 minuti. Immergere i vetrini in 1X PBS per 10 minuti. Quindi, aggiungere abbastanza 10% di siero d'asino e PBS per coprire il tessuto e incubare i campioni a temperatura ambiente in una camera umidificata per un'ora.Decantare il bloccante in eccesso dai vetrini e aggiungere l'anticorpo primario adeguatamente diluito nel siero all'1% direttamente sui vetrini, assicurandosi che il tessuto sia uniformemente coperto dalla soluzione. Incubare i vetrini a temperatura ambiente in una camera umidificata per 30 minuti. Lavare accuratamente i vetrini facendo scorrere circa un millilitro di acqua deionizzata sul tessuto, quindi incubare i vetrini in un unico cambio di 1X PBS per cinque minuti.Decantare il PBS in eccesso e aggiungere una quantità sufficiente di anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano, quindi incubare i campioni in una camera umidificata per 30 minuti. Lavare accuratamente i vetrini facendo scorrere circa un millilitro di acqua deionizzata sul tessuto e incubare il tessuto in un cambio di 1X PBS per cinque minuti come prima. Dopo aver preparato la soluzione cromogenica DAB plus, decantare il tampone in eccesso dai vetrini e aggiungere due o tre gocce di colorante cromogeno direttamente sul tessuto.Incubare i campioni in una camera umidificata per cinque minuti. Quindi, lavare accuratamente i vetrini facendo scorrere circa un millilitro di acqua deionizzata sul tessuto. Dopo un risciacquo finale dopo l'incubazione cromogenica, immergere i vetrini nell'ematossilina di Harris per due o due minuti e mezzo.Quindi, sciacquare delicatamente i vetrini sotto l'acqua del rubinetto per uno o due minuti. Immergere i vetrini in soluzione di differenziazione per due o tre secondi. Quindi, sciacquare delicatamente gli scivoli sotto l'acqua del rubinetto per circa uno o due minuti.Immergere i vetrini nell'agente blu per 60 secondi. Quindi, sciacquare i vetrini in etanolo al 95% per 30 secondi. Trasferire i vetrini nell'eosina alcolica Y per due o tre minuti prima di disidratare il tessuto in due cambi di etanolo al 95% per un minuto ciascuno.Quindi, infine, disidratare il tessuto una volta in etanolo al 100% per un minuto. Asciugare accuratamente i vetrini con un panno privo di lanugine. Quindi, applicare una goccia di mezzo di montaggio sintetico non acquoso a base di resina sul vetrino e applicare un vetrino coprioggetti.Per eseguire l'analisi duttale, selezionare i vetrini colorati per alfa SMA. Quindi, utilizzando un microscopio ottico dotato di un obiettivo montato sulla fotocamera, raccogli immagini rappresentative con un ingrandimento di 20X. Per contare i condotti in ogni immagine, contarli manualmente o aprire ImageJ e selezionare i plug-in.Quindi, seleziona Analizza e, dal menu a discesa, scegli il contatore di celle. Fare clic su inizializza, quindi evidenziare il tipo uno per iniziare a etichettare i condotti. Al termine, selezionare i risultati per visualizzare il conteggio duttale.Inizia disegnando una linea sulla barra di scala dell'immagine con lo strumento linea. Quindi, fare clic su Analizza e impostare la scala. Nella finestra successiva, digitare la distanza in distanza nota e le unità in unità di lunghezza.Quindi, fai clic su OK. Quindi, nelle opzioni di misurazione impostate, controllare l'area e il perimetro. Quindi, utilizzando lo strumento poligono a mano libera, tracciare una linea attorno a ciascun condotto in corrispondenza del compartimento mioepiteliale.Selezionare la misura e registrare il perimetro e l'area. Utilizzando nuovamente lo strumento poligono a mano libera, tracciare una linea lungo il lato apicale dell'epitelio duttale all'interno del lume. Quindi, selezionare la misura e registrare il perimetro e l'area.Sottrarre l'area del compartimento lumenale dall'area del compartimento mioepiteliale per ottenere l'area dell'epitelio duttale. Sottrarre il perimetro del compartimento lumenale dal perimetro del compartimento mioepiteliale per ottenere la circonferenza dell'epitelio duttale. Per eseguire l'analisi immunoistochimica, caricare immagini in campo chiaro su un software analitico, come ImageJ o Fiji Suite.Utilizzando il menu del plug-in in ImageJ, aprire la casella degli strumenti IHC. Nella casella combinata di selezione del modello che si apre, selezionare la macchia appropriata. Seleziona l'opzione di colore per isolare la macchia.Si aprirà una finestra dei risultati. Utilizzare la diapositiva di scelta del colore per garantire un corretto isolamento della macchia, senza l'inclusione dello sfondo o l'eccessiva esclusione della macchia. Vai al tipo di immagine, 16 bit, per convertire l'immagine in 16 bit.Quindi, soglia l'immagine andando all'immagine, regola la soglia. Infine, vai su analizza, imposta la misurazione per misurare l'area risultante e il valore medio di grigio e scegli analizza, misura, per raccogliere la misurazione. In queste sezioni fisse di numero quattro ghiandole mammarie, sono state analizzate l'espressione di collagene, fibronectina e tenascicina-C.Le frecce indicano la presenza di dotti in questi tessuti. Per quantificare le caratteristiche morfologiche dei dotti, è importante trattare le sezioni istologiche con cura, poiché una manipolazione impropria può causare danni ai tessuti e ai dotti non misurabili. Di seguito è riportato un esempio di tessuto danneggiato che non può essere utilizzato per l'analisi.In questo pannello viene mostrato un campione di tessuto intatto in cui i dotti sono misurabili e quantificabili. I dotti non sono caratterizzati solo dallo stroma circostante colorato di fibronectina, ma anche dalla densa popolazione di cellule epiteliali che rivestono il lume dei dotti. In questa sezione colorata con fibronectina, diversi dotti intatti contengono rami indicati da frecce.Ai fini di questa analisi, questi rami duttali non devono essere considerati come strutture duttali separate. Durante la valutazione e la misurazione dei condotti, è importante distinguere i dotti dalle strutture vascolari. Le strutture vascolari sono indicate da frecce rosse e le strutture duttali sono indicate da frecce nere.Le strutture vascolari possono essere identificate non solo dalla presenza di un monostrato endoteliale che riveste il lume, ma anche dalla presenza di strutture eosinofile anucleari indicative della presenza di globuli rossi all'interno del lume. Una volta padroneggiato, il prelievo dei tessuti può essere effettuato in circa 15 minuti per animale e le colorazioni della sezione possono essere completate in circa sette-otto ore, con immagini del vetrino scattate il giorno successivo se tutto viene eseguito correttamente. Durante il tentativo di eseguire queste procedure, è importante ricordare che i singoli obiettivi dell'esperimento potrebbero richiedere ottimizzazioni in passaggi specifici.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la generazione di seconda armonica o lo scattering Raman coerente anti-Stokes per rispondere a ulteriori domande riguardanti la composizione stromale o l'architettura dei tessuti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in molti campi, come la biologia dei tumori, per esplorare l'organizzazione dei tessuti e i modelli di espressione proteica in numerosi modelli animali di malattie e patologie umane. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare e isolare le ghiandole mammarie dei topi.È inoltre necessario comprendere le procedure di colorazione immunoistochimica delle sezioni di tessuto, compreso l'uso di controcolorazioni. Non dimenticare che lavorare con gli animali e i loro tessuti e sostanze chimiche come xileni e cromogeni DAB può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di queste procedure è necessario adottare sempre precauzioni come un'adeguata formazione sull'allevamento e l'uso di dispositivi di protezione individuale.

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Valutazione dello Sviluppo ghiandola mammaria e funzione in modelli murini

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

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Trasferimento di abilità di formazione del ghiandale mammario tra le cellule epiteliali basali del mammifero e le cellule luminescenti mammarie attraverso le vescicole / esosomi extracellulari

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Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per lanalisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola (Video) | JoVE Journal

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

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