Name: Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Impara a isolare fagosomi contenenti Salmonella typhimurium dai macrofagi utilizzando biotina e streptavidina. Questo metodo semplice e accessibile permette di studiare la maturazione dei fagosomi e le risposte immunitarie.

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Ricerca nel laboratorio di Robinson è sostenuta da finanziamenti da Colonia Cluster di eccellenza sulle risposte di Stress cellulare nelle malattie di Aging-Associated, Università di Colonia, Germania (CECAD; finanziato dal DFG nell'ambito dell'iniziativa di eccellenza della Repubblica federale tedesco e Dichiari i governi) e sovvenzioni dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria-Pesch Foundation dell'Università di Colonia, Germania.

tutti i passaggi che implicano l'uso di patogeni S. typhimurium deve essere eseguito in un BSL-2 o maggiore sicurezza biologica livello struttura. La cultura e la spalmatura di S. Typhimurium, come pure l'infezione dei macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) deve essere eseguita sotto cappa a flusso laminare per prevenire la contaminazione. L'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi può essere eseguita su qualsiasi banco di laboratorio BSL-2.
 l'estrazione del midollo osseo da topi per relativa differenziazione in macrofagi è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali sul benessere degli animali e approvato dall'Agenzia dello stato della Renania settentrionale-Vestfalia per la natura, Ambiente e tutela dei consumatori [Landesamt für Natur, Umwelt e Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; File no: 84-02.05.40.14.082 e 84-02.04.2015.A443] e l'Università di Colonia.
 1. Culturing S. typhimurium <ol><li>inoculare S. typhimurium (Ceppo SL1344) da una singola colonia batterica in 5 mL di brodo di infusione (BHI) cuore cervello utilizzando un ciclo batterico.</li>
	<li>Incubare la sospensione batterica in un incubatore a 37 ° C durante la notte con agitazione.</li>
	<li>Il giorno seguente, trasferire 1 mL di sospensione batterica in 19 mL di brodo BHI in una beuta e incubare a 37 ° C in un incubatore con agitazione.</li>
	<li>Monitorare l' S. typhimurium crescita misurando la densità ottica (OD) a 600 nm (OD 600) con uno spettrofotometro. Le misurazioni devono essere effettuate circa ogni 30 min.</li>
	<li>OD quando 600 raggiunge 1,0, rimuovere la sospensione batterica dall'incubatore e trasferimento in tubo da 50 mL. Centrifugare i batteri a 5.400 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere in 10 mL di soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS).</li>
	<li>Centrifugare a 5.400 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere i batteri in 4,9 mL di PBS sterile.</li>
</ol> 2. Rivestimento di S. typhimurium con biglie magnetiche NHS-biotina/streptavidina-coniugato biotina <ol><li>aggiungere 100 µ l di 10 mg/mL soluzione (NHS-biotina disciolto in dimetilsolfossido, DMSO) preparata, la sospensione batterica di collegamento preparato nel passaggio precedente. Ad esempio, diluire 5 mg di NHS-biotina in 0,5 mL di DMSO sterile. Mix correttamente pipettando su e giù più volte.</li>
	<li>Dividere il mix in cinque provette da 1,5 mL.</li>
	<li>Incubare per 2 ore a temperatura ambiente (TA) su un termoblocco con agitazione costante a 350 giri/min.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 15.000 x g per 10 min a RT e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere in 1 mL di PBS sterile, centrifuga a 15.000 x g per 10 min a RT e scartare il surnatante.</li>
	<li>Ripetere passo 2.5 due volte per rimuovere completamente la biotina in eccesso che collega soluzione.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Trasferire 100 µ l di soluzione di coniugato streptavidina biglie magnetiche di 10 mg/mL in una provetta da 1,5 mL e lasciarlo sul rack magnetico per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il solvente con una pipetta, prendere la soluzione di biglie magnetiche streptavidina-coniugato dal rack magnetico e risospendere le con 1 mL di sospensione batterica rivestito di biotina preparata al punto 2.7.</li>
	<li>Incubare per 1h a RT su un thermoblock con agitazione costante a 350 giri/min.</li>
	<li>Posto la soluzione su rack magnetico; aspettare 5 minuti e poi rimuovere con una pipetta i batteri che non aderiscono alla parete (tenerlo in una provetta etichettata come &#34; non rivestita batteri &#34;). La frazione che aderisce alla parete del tubo a contatto con il magnete è il batterio biotina/streptavidina-rivestito.</li>
	<li>Rimuovere il tubo contenente i batteri con etichettati dal rack magnetico e risospendere in 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Riposizionarlo sul rack magnetico, attendere 5 min e utilizzare una pipetta per rimuovere il PBS.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.13 e 2.14 altre due volte per rimuovere tutti i batteri che non sono rivestiti con i branelli magnetici streptavidina coniugata.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i batteri rivestito in 500 µ l di PBS sterile ed etichettare il tubo come &#34; rivestito di batteri &#34;.</li>
	<li>Contare le unità formanti colonia (UFC di entrambi) &#34; batteri non rivestiti &#34; e &#34; rivestito di batteri &#34; soluzioni di placcatura diluizioni seriali su piastre di agar BHI. Circa 2 x 10 8 cfu/mL di batteri rivestiti sono ottenuti da 20 mL di sospensione batterica iniziale con OD 600 di 1.0. Mantenere la sospensione batterica rivestito a 4 ° C per essere usati il giorno seguente per infettare i macrofagi.</li>
</ol> 3. Infezione di BDMDs <ol><li>lo stesso giorno quando i batteri sono rivestiti con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata, piastra completamente differenziato BMDMs 22 in piatti di 6 cm con una densità di 5 x 10 6 cellule per piatto.</li>
	<li>Il giorno successivo, centrifugare la sospensione batterica rivestito a 15.000 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere in medium di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione di 10 x 10 6 cfu/mL.</li>
	<li>Per infettare i macrofagi ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10, rimuovere il supporto dal BMDMs e aggiungere 5 mL di sospensione batterica rivestito preparato. MOI ottimale può essere valutata per ogni tipo di cellula o scopo sperimentale dell'isolato fagosomi.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 10 min per sincronizzare fagocitosi.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO 2 per 30 min ad avviare la fagocitosi. Altri tipi di cellule possono richiedere tempi diversi di incubazione per garantire l'internalizzazione dei batteri.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo contenente batteri dai piatti e lavare le cellule con RPMI tre volte a rimuovere i batteri non interiorizzato.</li>
	<li>Infine aggiungere 10 mL di RPMI contenente 10% FBS e gentamicina 50 µ g/mL per uccidere tutti i batteri non-phagocytized.</li>
	<li>Incubare il BMDMs infetti a 37 ° C con 5% CO 2 finché il tempo desiderato. Il punto di tempo desiderato deve essere determinato sperimentalmente secondo i batteri e tipo di cellulare utilizzato e lo scopo di analisi. Per lo studio degli eventi di fusione fagosoma-endosomi precoci in S. BMDMs typhimurium-infettati, è consigliabile un'incubazione di 30 min. Per l'analisi degli eventi successivi, fagosomi possono essere estratte dopo 2 o 4 ore di incubazione. Incubazione prolungata dei macrofagi con S. Typhimurium oltre 24 h provoca la morte dei macrofagi. Estesi, infezione intracellulare prima l'estrazione phagosome probabilmente potrebbe portare alla degradazione delle molecole di biotina. Tuttavia, non abbiamo osservato perdita di biotina sui batteri rivestito fino alle h. 24</li>
</ol> 4. Isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi buffer di isolamento <ol><li>preparare il volume del fagosoma richiesto un (50 mM tubi, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) aggiungendo ditiotreitolo (DTT) a una concentrazione finale di 1 mM, citocalasina B ad un finale concentrazione di 10 µM e proteasi e fosfatasi inibitori come consigliato dal produttore. 
	Nota: DTT e Cytochalasin B devono essere aggiunti per il tampone di isolamento phagosome A sempre immediatamente prima dell'uso. Cytochalasin B sconvolge il citoscheletro, facilitando la rottura della membrana cellulare.</li>
	<li>Al momento desiderato punto, rimuovere il mezzo da cellule infette e lavare con PBS sterile riscaldato a RT.</li>
	<li>Aggiungere 750 µ l di phagosomisolamento e tampone A ogni piatto e incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Quando si utilizzano numeri differenti delle cellule, il volume di tampone di isolamento A dovrebbe essere regolato proporzionalmente.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di tampone di phagosome isolamento B (tubi di 50 mM, pH.7, MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM mannitolo e saccarosio 68 mM). Roccia la piastra per assicurare che il buffer raggiunge la superficie del piatto. Quando si utilizzano numeri differenti delle cellule, il volume di tampone di isolamento B deve essere regolato proporzionalmente.</li>
	<li>Rimuovere le cellule dal piatto raschiando delicatamente utilizzando un poliziotto di gomma e trasferirli in una provetta da 1,5 mL pre-refrigerati.</li>
	<li>Passare la sospensione cellulare attraverso un ago 26G utilizzando una siringa da 1 mL almeno 15 volte (uno aspirazione più una espulsione della sospensione la conta delle cellule come una volta). Questo è sufficiente per rilasciare il contenuto citosolico di BMDMs. Il numero di passaggi attraverso l'ago deve essere ottimizzato per ogni tipo di cellula.</li>
	<li>Posizionare la sospensione cellulare sul rack magnetico e attendere 5 min. Le particelle attaccate al magnete sono fagosomi contenenti rivestito - S. Typhimurium. La sospensione contiene il resto dei componenti cellulari.</li>
	<li>Trasferire la sospensione in una provetta da 1,5 mL etichettata come &#34; citosol &#34;.</li>
	<li>Rimuovere il tubo con i fagosomi isolati dal rack magnetico e li risospendere in 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Posizionare la sospensione phagosome al ripiano magnetico, attendere 5 minuti e rimuovere il PBS.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 4.9 e 4.10 per lavare l' isolato S. typhimurium-contenente fagosomi.</li>
	<li>, Infine, rimuovere il PBS e risospendere i fagosomi nel buffer richiesto; ad esempio, in un tampone del saggio (RIPA) radioimmunoprecipitation per l'analisi della proteina. Circa il 50-200 µ g di proteina è ottenuta per campione seguendo questo protocollo, a seconda della quantità iniziale di cellule e il MOI di infezione.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un nuovo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi rivestendo i batteri con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata è descritto qui. Dopo la rottura della membrana cellulare delicata, fagosomi contenenti batteri possono essere facilmente estratte mediante un rack magnetico. Indichiamo che l'etichettatura dei batteri conserva la capacità dell'agente patogeno per indurre l'infiammazione e non altera la proprietà fagocitaria della cellula ospite. D'importanza, fagosomi ottenu...

I macrofagi sono in circolazione le cellule fagocitiche specializzate che rilevare, inghiottono e degradano qualsiasi particella estranea presente nei tessuti periferici, che vanno da cellule apoptotiche a microrganismi come i batteri d'invasione. Al momento della rilevazione di recettore superficiale di marcatori specifici patogeni comunemente presenti sulla superficie dei microrganismi (noto come pattern molecolari associati o PAMPs), macrofagi avviare una riorganizzazione complessa della membrana cellulare in ordine per circondare e phagocytize l' agente patogeno1.
L'agente patogeno tratta quindi è contenuto dal macrofago in una vescicola intracellulare conosciuto come fagosoma. Attraverso una serie di fusione e fissione eventi con altre vescicole come gli endosomi ed i lisosomi, contenenti patogeno phagosome acquisisce una serie di proteine necessarie per l'eliminazione del contenuto phagosomal. Pertanto, la composizione enzimatica di phagosome è altamente variabile nel corso di questo processo, noto come phagosome maturazione2.
Poco dopo la fagocitosi, il multimerici complessi vacuolar ATPasi (v-ATPasi) sono incorporato nella membrana del fagosoma da fusione con gli endosomi3. Questo complesso utilizza ATP ai protoni pompa dal cytosol al lumen del fagosoma4. L'acidificazione di phagosome è essenziale per gli eventi di fusione con altre vescicole5 e per l'attivazione di un gran numero di enzimi degradativi dipendente dal pH6. Un altro complesso enzimatico multimerici che è rapidamente assemblato sulla membrana phagosome è il complesso di NADPH-ossidasi (NOX). Complesso di NOX si ossida NADPH per la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) che sono secreti nel lume del fagosoma e che contribuiscono significativamente all'uccisione dei microrganismi tratta7.
Durante le fasi iniziali di maturazione, fagosomi presentano gli indicatori in genere quali Rab5 e Rab7 di endosomi precoci e tardivi, rispettivamente con la subunità di0 V dell' v-ATPasi8. Fusione di fagosomi con i lisosomi e late endosomes risultati nell'esposizione dell'agente patogeno phagocytized a una vasta gamma di enzimi idrolitici come β-galattosidasi9, lipasi e proteasi catepsina. L'acidificazione del lume è inoltre necessario per l'attivazione di questi enzimi. Ad esempio, la scissione della catepsina D per produrre la forma breve attiva è dipendente dal pH10. Questi enzimi degradano l'agente patogeno e mediano la produzione dei peptidi corti patogeno-derivati che sono presentati da macrofagi di istocompatibilità (MHC) classe II molecole complesse alle cellule di T di innescare una risposta immunitaria adattativa11.
Quindi, la maturazione del fagosoma è cruciale per la risposta immunitaria innata e collega le braccia innate e adattativa del sistema immunitario. Non è una sorpresa che gli agenti patogeni hanno evoluto strategie per superare l'eliminazione dai macrofagi attraverso il processo di maturazione del fagosoma sopra descritte. Ad esempio, i batteri intracellulari tubercolosi del micobatterio e Legionella pneumophila impediscono la maturazione del fagosoma d'inibizione dell'Assemblea del v-atpasi e lume conseguente acidificazione12,13 . Altri batteri, come Listeria monocytogenes o Shigella flexneri inducono la formazione di pori nella membrana del fagosoma per scappare verso il citosol14,15. D'altra parte, Salmonella enterica sierotipo typhimurium (S. typhimurium) è in grado di modificare le proprietà di phagosome all'interno del vacuolo per trasformarla in un luogo adatto per sua replica16. Questa capacità rende S. typhimurium un modello molto interessante per studiare interferenza patogeno-mediata di maturazione del fagosoma.
S. typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l'invasione della lamina propria, S. Typhimurium batteri sono rapidamente rilevati phagocytized da macrofagi e contenuti all'interno di fagosomi17. Alcuni rapporti hanno descritto in precedenza che S. typhimurium-fagosomi contenenti presentano responsabili per sia gli endosomi ed i lisosomi18, e altri studi hanno trovato fusione fagosoma-lisosoma ha impedito al S. Typhimurium infezione19.
Inizialmente, maturazione di phagosome su S. l'infezione typhimurium è stato studiato da microscopia di immunofluorescenza. Lo sviluppo di tecniche per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi attivato uno studio più accurato del contenuto phagosome in termini di indicatori endosoma e lisosoma. Ad oggi, il metodo principale utilizzato per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi è il frazionamento subcellulare il saccarosio passo gradienti18,20. Tuttavia, questo metodo richiede più passaggi di centrifugazione che possono causare danni meccanici alla fagosomi, possono influenzare la stabilità dei componenti phagosomal (proteine e lipidi) e richiede molto tempo. Inoltre, si richiede l'utilizzo di un'ultracentrifuga: un pezzo di attrezzature specializzate che non sono accessibile per ogni laboratorio.
Recentemente, un nuovo approccio è stato applicato per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi, in cui gli agenti patogeni batterici sono etichettati con biotinilati lipopetide (Lipobiotin) e successivamente estratte utilizzando streptavidina coniugata biglie magnetiche21 . Proponiamo un metodo alternativo e complementare di etichettatura batteriche superficiali contenenti macromolecole con NHS-biotina seguita da streptavidina coniugata biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con questo metodo sono altamente arricchiti in indicatori endosoma e lisosoma e possono essere utilizzati per un'ampia gamma di dosaggi, di analisi della proteina di omics analisi. Inoltre, non richiede attrezzature specializzate come ultracentrifughe. Inoltre, eliminando le fasi di centrifugazione, sia il danno meccanico al fagosomi e la quantità di tempo impiegata notevolmente sono ridotti. Questo metodo può essere facilmente adattato per l'isolamento di fagosomi contenenti altri batteri, come i batteri Gram-positivi Staphylococcus aureus, anche incluso in questo manoscritto. In sintesi, questo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è un semplice, conveniente, e meno tempo rispetto all'isolamento classica di saccarosio gradiente-ultracentrifugazione, rendering altamente arricchito fagosomi contenenti batteri.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>TUBI</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL o DynaMag Magnete</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spettrofotometro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Ansa batterica (10&micro; l)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Sierotipo di Salmonella enterica Typhimurium SL1344</td><td>Istituto Leibniz DSMZ-Collezione tedesca di microrganismi e colture</td><td></td><td></td>cellulari</tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptavidina Invitrogen</td><td></td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-beta-actina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-mCherry</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Rab5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Rab7</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPasi (V0) anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>Biotechnology sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-v-ATPasi (V1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-catepsina D</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Tomm20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-calnexina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l'invasione della lamina propria, S. typhimurium batteri sono rapidamente rilevati e phagocytized da macrofagi e contenuti in vescicole conosciute come fagosomi al fine di essere degradato. Isolamento di S. typhimurium-fagosomi contenenti sono stati ampiamente usati per studiare come S. typhimurium infezione altera il processo di maturazione del fagosoma per impedire la degradazione batterica. Classicamente, l'isolamento di batteri contenenti fagosomi è stata eseguita da centrifugazione in gradiente di saccarosio. Tuttavia, questo processo richiede tempo e richiede attrezzature specializzate e un certo grado di destrezza. Qui descritto è un metodo semplice e rapido per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina-streptavidina-coniugato biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con tale metodo possono essere sospeso in qualsiasi buffer di scelta, consentendo l'utilizzazione dell'isolato fagosomi per una vasta gamma di saggi, quali l'analisi della proteina, metabolita e dei lipidi. In sintesi, questo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è specifico, efficiente, rapida, richiede attrezzature minime ed è più versatile rispetto al classico metodo di isolamento di ultracentrifugazione gradiente di saccarosio.

Isolamento di batteri contenenti fagosomi dal presente protocollo richiede il biotinylation dei batteri come un primo passo. Quindi abbiamo valutato l'efficacia di S. typhimurium biotinylation dall'analisi di microscopia confocal di BMDMs infettato biotinilati mCherry -S. typhimurium etichettato con Cy5-streptavidina. Brevemente, BMDMs sono stati infettati come descritto in questo protocollo con mCherry -S. typhimurium precedentemente ...

Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i batteri intatti e arricchiti contenenti fagosomi. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come i cambiamenti nella maturazione dei fagosomi e nell'elaborazione dell'antigene quando i microrganismi patogeni invadono le cellule ospiti. Il vantaggio principale della tecnica è che produce batteri di alta qualità contenenti fagosomi utilizzando semplici passaggi e senza la necessità di attrezzature specializzate.Gli individui nuovi al metodo lo troverebbero tecnicamente accessibile rispetto alle non metodologie. Abbiamo avuto l'idea di sviluppare questo metodo quando stavamo studiando i meccanismi con cui i patogeni intracellulari dirottano i fagosomi a loro vantaggio. A dimostrare questa procedura sarà Saray Gutierrez, un post-doc del mio laboratorio.Per avviare la coltura di Salmonella Typhimurium, utilizzare un ciclo di batteri per inoculare una singola colonia batterica in 5 millilitri di brodo per infusione di cuore cerebrale. Quindi incubare la sospensione in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per una notte agitandola. Trasferire un millilitro di questa sospensione batterica in 19 millilitri di brodo BHI in un pallone conico il giorno successivo.Incubare nuovamente in un'incubatrice a 37 gradi Celsius agitando. Quando l'OD600 raggiunge l'uno, rimuovere il pallone dall'incubatore e trasferire la coltura in una provetta da 50 millilitri. Quindi centrifugare la provetta a 5400 x G a 4 gradi Celsius per 15 minuti.Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet batterico in 10 millilitri di PBS sterile. Dopo aver ripetuto una volta la centrifugazione, risospendere il pellet in 4,9 millilitri di PBS. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione di legante della biotina appena preparata alla sospensione batterica.Dopo aver diviso questa sospensione in cinque tubi da 1,5 millilitri, incubare in un blocco termico a temperatura ambiente con agitazione costante a 350 giri/min per due ore. Dopo aver centrifugato le provette a 15.000 x G a temperatura ambiente per dieci minuti, scartare il surnatante. Dopo altre due fasi di centrifugazione e la completa rimozione della soluzione di legame della biotina, risospendere questo batterio codificato con biotina in un millilitro di PBS sterile in una singola provetta da 1,5 millilitri.Trasferire 100 microlitri di soluzione di perle magnetiche coniugate con streptavidina in una provetta fresca da 1,5 millilitri e metterla in una rastrelliera magnetica per cinque minuti. Dopo aver rimosso il solvente dal tubo, rimuovere il tubo dal rack magnetico. Quindi risospendere le perle rimaste nel tubo con un millilitro di sospensione batterica codificata con biotina.Incubare la provetta su un blocco termico a temperatura ambiente per un'ora agitando a 350 giri/min. Quindi, posizionare la provetta sulla rastrelliera magnetica per cinque minuti. Utilizzare una pipetta per rimuovere i batteri che non hanno aderito alla parete e trasferirli in una nuova provetta etichettata come batteri non codificati.Il tubo con perle magnetiche aderenti alla parete contiene batteri codificati con Biotina Streptavidina. Rimuovere la provetta con i batteri codificati con biotina e streptavidina dal rack magnetico e risospendere in un millilitro di PBS sterile. Dopo che la provetta è rimasta sulla rastrelliera magnetica per cinque minuti, rimuovere il PBS.Infine, risospendere i batteri codificati con biotina e streptavidina lavati in 500 microlitri di PBS sterile ed etichettare la provetta come batteri codificati. Il giorno prima dell'infezione, la piastra ha differenziato completamente i BMDM in un piatto di sei centimetri in RPMI integrati con il dieci percento di FBS. Il giorno successivo, centrifugare la sospensione batterica codificata a 15.000 x G a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet batterico in terreno RPMI integrato con il dieci percento di FBS. Rimuovere il terreno dai BMDM e aggiungere cinque millilitri di sospensione batterica codificata nel terreno RPMI per infettare le cellule. Per sincronizzare la fagocitosi, incubare a temperatura ambiente per dieci minuti.Quindi, per iniziare la fagocitosi, incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore al cinque percento di anidride carbonica per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno dalle stoviglie e lavare le cellule tre volte all'RPMI per rimuovere i batteri non internalizzati. Per uccidere tutti i batteri non fagocitati a dieci millilitri di RPMI contenente il dieci percento di FBS in 50 microgrammi per millilitro di gentamicina.Infine, incubare i BMDM infetti a 37 gradi Celsius in un incubatore al cinque percento di anidride carbonica fino al punto temporale desiderato. Innanzitutto, preparare il volume del tampone di isolamento del fagosoma A necessario aggiungendo DTT e citocalasina B appena prima dell'uso e inibitori della proteasi e della fosfatasi come raccomandato dal produttore. Rimuovere il terreno dalle cellule infette al momento desiderato e lavare le cellule con PBS sterile preriscaldato a temperatura ambiente.Quindi aggiungere 750 microlitri di tampone di isolamento fagosoma A al piatto e incubare su ghiaccio per 20 minuti. Ricordati di far oscillare il piatto di tanto in tanto. Quindi, aggiungi 250 microlitri di tampone di isolamento fagosoma B e poi agita le piastre per assicurarti che il tampone copra completamente la superficie.Raschiare delicatamente le cellule usando un poliziotto di gomma per rimuovere le cellule dal piatto e trasferirle in una provetta pre-raffreddata da 1,5 millilitri. Quindi utilizzare una siringa da un millilitro per far passare la sospensione cellulare attraverso un ago calibro 26 almeno 15 volte. Quindi, posizionare la sospensione della cella sul rack magnetico per cinque minuti.Le particelle attaccate alle perle magnetiche sono fagosomi contenenti S.Typhimurium codificato. Trasferire quindi la sospensione, che contiene il resto dei componenti cellulari, in una nuova provetta da 1,5 millilitri etichettata come Cytosol. Rimuovere la provetta contenente i fagosomi isolati dal rack e risospenderla in un millilitro di PBS sterile.Riposizionare la provetta sulla rastrelliera magnetica per cinque minuti, quindi rimuovere il PBS. Dopo aver ripetuto questo lavaggio con PBS una volta, rimuovere il PBS e, infine, risospendere S.Typhimurium contenente fagosomi nel tampone richiesto. Per valutare l'efficacia della biotinilazione di S.Typhimurium mediante microscopia confocale, i BMDM sono stati infettati con mCherry S.Typhimurium marcato con biotina.Dopo la fissazione e l'incubazione con Cy5-streptavidina, il successo della biotinilazione è stato confermato dal segnale fluorescente Cy5-streptavidina. Questo segnale è stato osservato esclusivamente nel mCherry biotinilato S.Typhimurium, mentre non c'era alcun segnale nel mCherry S.Typhimurium non biotinilato. L'analisi immunobloccante di fagosomi isolati ha mostrato un arricchimento significativo di mCherry che esprime S.Typhimurium nei fagosomi rispetto alla frazione citosolica.L'analisi immunobloccante utilizzando marcatori endosomici e lisosomiali in fagosomi isolati ha mostrato un arricchimento dei marcatori testati nei fagosomi isolati quattro ore dopo l'infezione rispetto a 30 minuti dopo l'infezione. Quando questo protocollo è stato applicato a Staphylococcus aureus, è stata dimostrata una biotinilazione efficace di S.aureus che esprime GFP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora e mezza a seconda del tempo di incubazione scelto per l'infezione dallo sperimentatore.Per garantire il successo dell'isolamento dei batteri contenenti fagosomi, assicurarsi che i tamponi contengano le concentrazioni indicate e che le piastre siano agitate per garantire la copertura omogenea delle cellule. Inoltre, sii delicato quando raschia le cellule e quando passi la sospensione cellulare attraverso l'ago. Seguendo questa procedura, altre tecniche come la proteomica o la metabolomica possono essere eseguite con fagosomi isolati per studiare l'alterazione causata da agenti patogeni sotto fattori patogeni coinvolti.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Preparazione della coltura di Salmonella typhimurium

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Isolation of Phagosomes Containing Magnetic Bead-Tagged Bacteria from Infected Macrophages

Source: Fernández-Fernández, R., et. al. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the use of exogenous LPS (Lipopolysaccharide) as a receptor mimic to inactivate lytic bacteriophages in Salmonella cultures. Through sequential incubation, centrifugation, and washing, phages are eliminated, resulting in a viable, phage-free bacterial suspension for downstream applications.

Inactivation of Bacteriophages Using Exogenous Lipopolysaccharide to Generate Phage-Free Salmonella Cultures

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Un test per quantificare la salmonella citosolica e vacuolare nei macrofagi primari infetti

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Visualizzazione basata su microscopia TIRF della formazione e della chiusura dei fagosomi

Un test high-throughput per fenotipo Salmonella in vitro o di altra associazione batterica, l'invasione, e la replica in fagociti con capacità high-throughput è stato sviluppato. Il metodo è stato impiegato per valutare Salmonella gene knockout ceppi mutanti per il loro coinvolgimento in interazioni ospite-patogeno.

High-throughput Assay per Fenotipo Salmonella enterica Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi

Descriviamo qui un semplice protocollo per isolare i macrofagi peritoneali murini. Questa procedura è seguita dall'estrazione dell'RNA per effettuare l'analisi dell'espressione genica dopo la stimolazione dei recettori Toll-like.

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

Descriviamo la quantificazione di Salmonella typhimurium citosolica e vacuolare nei macrofagi derivati dal midollo osseo utilizzando la permeabilizzazione differenziale della digitonina.

Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em&gt; Salmonella</em&gt; In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

Qui, presentiamo un protocollo per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del mouse usando una maggiore fluorescenza verde Escherichia coliche esprimono proteine.

Utilizzando Enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine Escherichia Coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del Mouse

I batteriofagi, onnipresenti e diversificati sulla Terra, infettano e si replicano all'interno degli ospiti batterici, svolgendo un ruolo cruciale negli ecosistemi microbici. Nonostante la loro importanza, la loro presenza può interrompere i processi industriali. Abbiamo sviluppato un metodo che utilizza lipopolisaccaridi batterici per eliminare i batteriofagi dalle colture di Salmonella .

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Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

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