Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i batteri intatti e arricchiti contenenti fagosomi. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come i cambiamenti nella maturazione dei fagosomi e nell'elaborazione dell'antigene quando i microrganismi patogeni invadono le cellule ospiti. Il vantaggio principale della tecnica è che produce batteri di alta qualità contenenti fagosomi utilizzando semplici passaggi e senza la necessità di attrezzature specializzate.

Gli individui nuovi al metodo lo troverebbero tecnicamente accessibile rispetto alle non metodologie. Abbiamo avuto l'idea di sviluppare questo metodo quando stavamo studiando i meccanismi con cui i patogeni intracellulari dirottano i fagosomi a loro vantaggio. A dimostrare questa procedura sarà Saray Gutierrez, un post-doc del mio laboratorio.

Per avviare la coltura di Salmonella Typhimurium, utilizzare un ciclo di batteri per inoculare una singola colonia batterica in 5 millilitri di brodo per infusione di cuore cerebrale. Quindi incubare la sospensione in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per una notte agitandola. Trasferire un millilitro di questa sospensione batterica in 19 millilitri di brodo BHI in un pallone conico il giorno successivo.

Incubare nuovamente in un'incubatrice a 37 gradi Celsius agitando. Quando l'OD600 raggiunge l'uno, rimuovere il pallone dall'incubatore e trasferire la coltura in una provetta da 50 millilitri. Quindi centrifugare la provetta a 5400 x G a 4 gradi Celsius per 15 minuti.

Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet batterico in 10 millilitri di PBS sterile. Dopo aver ripetuto una volta la centrifugazione, risospendere il pellet in 4,9 millilitri di PBS. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione di legante della biotina appena preparata alla sospensione batterica.

Dopo aver diviso questa sospensione in cinque tubi da 1,5 millilitri, incubare in un blocco termico a temperatura ambiente con agitazione costante a 350 giri/min per due ore. Dopo aver centrifugato le provette a 15.000 x G a temperatura ambiente per dieci minuti, scartare il surnatante. Dopo altre due fasi di centrifugazione e la completa rimozione della soluzione di legame della biotina, risospendere questo batterio codificato con biotina in un millilitro di PBS sterile in una singola provetta da 1,5 millilitri.

Trasferire 100 microlitri di soluzione di perle magnetiche coniugate con streptavidina in una provetta fresca da 1,5 millilitri e metterla in una rastrelliera magnetica per cinque minuti. Dopo aver rimosso il solvente dal tubo, rimuovere il tubo dal rack magnetico. Quindi risospendere le perle rimaste nel tubo con un millilitro di sospensione batterica codificata con biotina.

Incubare la provetta su un blocco termico a temperatura ambiente per un'ora agitando a 350 giri/min. Quindi, posizionare la provetta sulla rastrelliera magnetica per cinque minuti. Utilizzare una pipetta per rimuovere i batteri che non hanno aderito alla parete e trasferirli in una nuova provetta etichettata come batteri non codificati.

Il tubo con perle magnetiche aderenti alla parete contiene batteri codificati con Biotina Streptavidina. Rimuovere la provetta con i batteri codificati con biotina e streptavidina dal rack magnetico e risospendere in un millilitro di PBS sterile. Dopo che la provetta è rimasta sulla rastrelliera magnetica per cinque minuti, rimuovere il PBS.

Infine, risospendere i batteri codificati con biotina e streptavidina lavati in 500 microlitri di PBS sterile ed etichettare la provetta come batteri codificati. Il giorno prima dell'infezione, la piastra ha differenziato completamente i BMDM in un piatto di sei centimetri in RPMI integrati con il dieci percento di FBS. Il giorno successivo, centrifugare la sospensione batterica codificata a 15.000 x G a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet batterico in terreno RPMI integrato con il dieci percento di FBS. Rimuovere il terreno dai BMDM e aggiungere cinque millilitri di sospensione batterica codificata nel terreno RPMI per infettare le cellule. Per sincronizzare la fagocitosi, incubare a temperatura ambiente per dieci minuti.

Quindi, per iniziare la fagocitosi, incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore al cinque percento di anidride carbonica per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno dalle stoviglie e lavare le cellule tre volte all'RPMI per rimuovere i batteri non internalizzati. Per uccidere tutti i batteri non fagocitati a dieci millilitri di RPMI contenente il dieci percento di FBS in 50 microgrammi per millilitro di gentamicina.

Infine, incubare i BMDM infetti a 37 gradi Celsius in un incubatore al cinque percento di anidride carbonica fino al punto temporale desiderato. Innanzitutto, preparare il volume del tampone di isolamento del fagosoma A necessario aggiungendo DTT e citocalasina B appena prima dell'uso e inibitori della proteasi e della fosfatasi come raccomandato dal produttore. Rimuovere il terreno dalle cellule infette al momento desiderato e lavare le cellule con PBS sterile preriscaldato a temperatura ambiente.

Quindi aggiungere 750 microlitri di tampone di isolamento fagosoma A al piatto e incubare su ghiaccio per 20 minuti. Ricordati di far oscillare il piatto di tanto in tanto. Quindi, aggiungi 250 microlitri di tampone di isolamento fagosoma B e poi agita le piastre per assicurarti che il tampone copra completamente la superficie.

Raschiare delicatamente le cellule usando un poliziotto di gomma per rimuovere le cellule dal piatto e trasferirle in una provetta pre-raffreddata da 1,5 millilitri. Quindi utilizzare una siringa da un millilitro per far passare la sospensione cellulare attraverso un ago calibro 26 almeno 15 volte. Quindi, posizionare la sospensione della cella sul rack magnetico per cinque minuti.

Le particelle attaccate alle perle magnetiche sono fagosomi contenenti S.Typhimurium codificato. Trasferire quindi la sospensione, che contiene il resto dei componenti cellulari, in una nuova provetta da 1,5 millilitri etichettata come Cytosol. Rimuovere la provetta contenente i fagosomi isolati dal rack e risospenderla in un millilitro di PBS sterile.

Riposizionare la provetta sulla rastrelliera magnetica per cinque minuti, quindi rimuovere il PBS. Dopo aver ripetuto questo lavaggio con PBS una volta, rimuovere il PBS e, infine, risospendere S.Typhimurium contenente fagosomi nel tampone richiesto. Per valutare l'efficacia della biotinilazione di S.Typhimurium mediante microscopia confocale, i BMDM sono stati infettati con mCherry S.Typhimurium marcato con biotina.

Dopo la fissazione e l'incubazione con Cy5-streptavidina, il successo della biotinilazione è stato confermato dal segnale fluorescente Cy5-streptavidina. Questo segnale è stato osservato esclusivamente nel mCherry biotinilato S.Typhimurium, mentre non c'era alcun segnale nel mCherry S.Typhimurium non biotinilato. L'analisi immunobloccante di fagosomi isolati ha mostrato un arricchimento significativo di mCherry che esprime S.Typhimurium nei fagosomi rispetto alla frazione citosolica.

L'analisi immunobloccante utilizzando marcatori endosomici e lisosomiali in fagosomi isolati ha mostrato un arricchimento dei marcatori testati nei fagosomi isolati quattro ore dopo l'infezione rispetto a 30 minuti dopo l'infezione. Quando questo protocollo è stato applicato a Staphylococcus aureus, è stata dimostrata una biotinilazione efficace di S.aureus che esprime GFP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora e mezza a seconda del tempo di incubazione scelto per l'infezione dallo sperimentatore.

Per garantire il successo dell'isolamento dei batteri contenenti fagosomi, assicurarsi che i tamponi contengano le concentrazioni indicate e che le piastre siano agitate per garantire la copertura omogenea delle cellule. Inoltre, sii delicato quando raschia le cellule e quando passi la sospensione cellulare attraverso l'ago. Seguendo questa procedura, altre tecniche come la proteomica o la metabolomica possono essere eseguite con fagosomi isolati per studiare l'alterazione causata da agenti patogeni sotto fattori patogeni coinvolti.