Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere linee cellulari NK o T da pazienti con CAEBV, il che ha un grande significato per la ricerca su questa malattia fatale. Questo metodo aiuta a ottenere linee cellulari NK o T per la ricerca sul meccanismo di CAEBV, come lo studio del VBV grezzo sulla proliferazione cellulare, lo screening degli inibitori che interferiscono con la proliferazione delle cellule NK/T. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto semplice ed efficiente che richiede solo una piccola quantità di sangue periferico e una bassa dose di ferro due per stabilire linee cellulari NK o T da pazienti con CAEBV.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, perché la sopravvivenza cellulare alla prima delle due settimane di coltura è incerta e questo metodo ti mostrerà come determinare la proliferazione cellulare della coltura precoce. Quando abbiamo avuto l'idea di questo metodo, abbiamo scoperto che il ferro sierico umano può includere PBMC per un massimo di due settimane. Abbiamo dimostrato che la dimostrazione di questo metodo è fondamentale, perché mostra la forma delle cellule e la causa della proliferazione.

E quell'estensione delle cellule e la numerazione delle cellule della barra Y Per iniziare questa procedura, purificare la PBMC primaria da due millilitri di sangue intero di pazienti con CAEBV mediante centrifugazione a gradiente. In alternativa, scongelare la PBMC crioconservata dall'azoto liquido con il terreno RPMI-1640. Successivamente, aggiungere due microlitri di blu di tripano allo 0,4% a 18 microlitri di sospensione cellulare per colorare le cellule per tre minuti, quindi trasferire la sospensione sulla piastra contacellule e misurare la concentrazione e la vitalità delle cellule con un contatore di cellule automatizzato.

Preparare la sospensione cellulare a una densità di due o tre volte 10-10-16 cellule per millilitro, integrata con un terreno di coltura completo RPMI-1640 contenente il 20% di siero umano, due millimolari di L-glutammina e antibiotici. Successivamente, seminare un millilitro di sospensione di PBMC per pozzetto nelle piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti. Quindi, aggiungere 150 unità per millilitro di rhIL-2 a ciascun pozzetto.

Posizionare le piastre di coltura in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Il secondo giorno, osserva la morfologia cellulare al microscopio con un ingrandimento di 200 volte. Le celle sono in buone condizioni quando sono luminose e rotonde.

In questa fase, aggiungere due microlitri di blu di tripano allo 0,4% a 18 microlitri di sospensione cellulare e calcolare la concentrazione delle cellule. Successivamente, osservare la morfologia cellulare e monitorare le condizioni di crescita cellulare numerando le cellule prima di cambiare terreno. È importante monitorare la morfologia cellulare e la condizione.

Possiamo giudicare se le cellule sopravvivono in base alle cellule polimorfiche e alle condizioni delle cellule nella fase iniziale di una coltura. Successivamente, rimuovere 500 microlitri di terreno da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura completo fresco. Quindi aggiungere 150 unità per millilitro di rhIL-2 a ciascun pozzetto.

Cambia il mezzo due volte a settimana. Traccia la curva di crescita cellulare. Quando la concentrazione di cellule vitali supera cinque volte 10 per sesta cellule per millilitro, dividere le cellule in nuovi pozzetti a una concentrazione di una o due volte 10 per sesta cellule per millilitro in ciascun pozzetto.

Questo processo richiede da due a quattro settimane. Quando le cellule si sono espanse, raccogli una volta da 10 a un sesto di cellule per determinare i fenotipi delle linee cellulari. Centrifugarli a 240 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente per far precipitare le celle NKNT.

Successivamente, scartare il surnatante, lavare la precipitazione aggiungendo sette millilitri di PBS. Centrifugare per cinque minuti a 240 volte g a temperatura ambiente. Ripetere la procedura ancora una volta, quindi aggiungere 200 microlitri di siero umano in ogni provetta, mescolare bene e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente Centrifugare le cellule a 240 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Scartare il surnatante e risospendere le cellule in una sola volta da 10 a 10 cellule per millilitro con PBSA freddo. Successivamente, dividere le cellule in cinque provette contenenti ciascuna due volte 10 per la quinta cellula. Successivamente, centrifugare le cellule a 240 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius Scartare il surnatante e risospendere le cellule con tampone PBSA o PBSA contenente 10 microlitri di PE e 10 microlitri di anticorpi marcati FITC per colorare i recettori cellulari delle cellule T o NK sul ghiaccio.

Le cellule sospese con tampone PBSA vengono utilizzate come controllo negativo. Successivamente, incubare le cellule con anticorpi per 20-30 minuti su ghiaccio al buio. Lavare le cellule due volte con PBSA freddo e risospendere le cellule con 300 microlitri di PBSA freddo prima dell'analisi con il citometro a flusso.

Al termine dell'analisi del fenotipo cellulare, rimuovere con cura metà del surnatante ed evitare di toccare le cellule sul fondo della piastra. Aggiungere alle piastre lo stesso volume di terreno di coltura fresco contenente rhIL-2 a 300 unità per millilitro, quindi cambiare metà del terreno ogni tre giorni fino a quando i cluster cellulari sono chiaramente visibili al microscopio. Successivamente, trasferire le cellule dalle piastre a 24 pozzetti ai fiaschi di coltura T-25 dopo aver mescolato diversi pozzetti dello stesso lignaggio.

Raddoppiare il volume del terreno di coltura man mano che diventa giallo fino a quando il volume del terreno si espande a 10-15 millilitri. Successivamente, aggiungi rhIL-2 con una concentrazione di 150 unità per millilitro. Cambia il terreno 24 ore prima del congelamento dopo due o tre settimane di crescita, quando la massa cellulare può essere osservata ad occhio nudo.

Misurare la concentrazione delle celle con il contatore di cellule. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare per cinque minuti a 240 volte g e risospendere il pellet cellulare a una densità da cinque a 10 volte da 10 a 10 cellule per millilitro con la soluzione madre congelata che contiene il 90% di siero fetale bovino e il 10% di DMSO. Congelarlo a una velocità compresa tra un grado Celsius al minuto e meno 80 gradi Celsius e quindi trasferirlo direttamente nell'azoto liquido.

Dopo tre giorni di coltura durante la creazione di linee cellulari, iniziano a comparire le cellule polimorfiche. Dopo sette giorni, le cellule crescono rapidamente poiché sia il numero che la vitalità delle cellule sono aumentati ad un ritmo elevato. Piccoli gruppi di cellule sono chiaramente visibili dopo 10-14 giorni di crescita, quando la concentrazione cellulare supera da tre a sei volte 10 a sesto.

In questo periodo, le cellule devono essere espanse mediante divisione in due o tre pozzetti della piastra di coltura. Circa un mese dopo, una volta che il numero di cellule raggiunge da tre a cinque volte 10 per settimo, il conteggio è abbastanza alto per la conservazione. Un'altra questione importante è determinare i fenotipi dopo che le cellule sono state coltivate con successo.

I nostri risultati indicano che le cellule T e NK possono essere coltivate con il metodo sopra descritto e le linee cellulari possono essere stabilite con questa tecnica poiché le cellule sono cresciute per più di tre mesi in buone condizioni. Questo metodo, questa tecnica, può essere fatta ancora di più. È facile da eseguire correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la variabilità della PBMC. Per questa procedura, entrambi i metodi, come il kit di test MTT 8, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come la tossicità delle linee cellulari NK o T che possono essere utilizzate per l'immunoterapia adottiva. Dopo ogni sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della CAEBV per esplorare il meccanismo di NK/T associato a EBV che coinvolge malattie operative nel sistema modello cellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire ed espandere le linee cellulari NK e T seguendo questo protocollo. Non dimenticare che lavorare con un agente patogeno può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni quando si esegue questa procedura.