Name: Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Scopri un metodo semplice ed efficiente per stabilire linee cellulari NK e T da pazienti con CAEBV usando sangue periferico e bassa dose di IL-2. Questa tecnica facilita la ricerca sui meccanismi della malattia.

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Questo lavoro è stato supportato da progetti chiave dell'Accademia cinese delle scienze (KFZD-SW-205), strategico biologico risorse tecnologia sistema di supporto dell'Accademia cinese delle scienze (CZBZX-1 e ZSSB-004) e da sovvenzioni dalla National Science Foundation of China ( 81401640) e fondo di scienze naturali (14ZR1434800) di Shanghai.

Questo studio è stato approvato dal comitato etico del Istituto di genetica e biologia dello sviluppo, Accademia cinese delle scienze, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per benessere umano.
Nota: Vedere la Figura 1 per una schematica del flusso di lavoro.
1. isolamento di PBMC dai pazienti CAEBV
<ol><li>Purificare il primario PBMC da 2 mL di sangue intero di pazienti CAEBV di sfumatura (ad es., Ficoll-placca) centrifugazione seguendo le istruzioni del produttore. In alternativa, scongelare PBMC crioconservati da azoto liquido con medium RPMI 1640.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di trypan blu (0,4%) alla sospensione di cellule di µ l 18, attendere per 3 min a macchiare le cellule, trasferire la sospensione per la contropiastra di cella e misurare la concentrazione delle cellule e la redditività con un contatore di cellule automatizzato.</li>
	<li>Preparare la sospensione cellulare ad una densità di 2-3 × 106 cellule/mL completati con terreno di coltura RPMI 1640 completo contenente 20% di siero umano (calore inattivato a 56 ° C), 2 mM L-Glutammina e gli antibiotici (100 µ g/mL di streptomicina, 100 U/mL di penicillina). Semi di 1 mL di sospensione PBMC per pozzetto in piastre per colture cellulari a 24 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 150 U rhIL-2 per pozzetto.</li>
	<li>Posizionare le piastre di coltura in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.</li>
	<li>Il giorno 2, osservare la morfologia delle cellule al microscopio (ingrandimento X 200); le cellule sono in buone condizioni quando sono luminose e rotondo.</li>
</ol>2. espansione delle cellule e le cellule vitali di numerazione
<ol><li>Osservare la morfologia delle cellule al microscopio (ingrandimento X 200) e controllare la condizione della crescita delle cellule numerando le celle prima di cambiare mezzo: aggiungere 2 µ l di trypan blu (0,4%) alla sospensione di cellule di µ l 18 e calcolare la concentrazione delle cellule (Vedi 1.2, Figura 2).</li>
	<li>Scartare 500 µ l del mezzo in una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 µ l fresco completo colturale. Aggiungere 150U rhIL-2 per pozzetto.</li>
	<li>Modificare il mezzo due volte a settimana come descritto al punto 2.2.</li>
	<li>Disegnare la curva di crescita delle cellule (Figura 3).</li>
	<li>Quando la concentrazione delle cellule vitali supera 5 × 106/mL, dividere le celle in nuovi pozzi ad una concentrazione di 1-2 × 106 cellule/mL in ciascun pozzetto. Questo processo richiede 2-4 settimane.</li>
</ol>3. cellula Phenotyping tramite flusso Cytometry
<ol><li>Quando le cellule sono espansi, raccogliere 1 × 106 cellule per determinare i fenotipi delle linee cellulari. Centrifugare le cellule a 240 x g per 5 min a temperatura ambiente (cellule NK/T precipiterà nella parte inferiore del tubo).</li>
	<li>Eliminare il supernatante, lavare la precipitazione con l'aggiunta di 7 mL di PBS. Centrifugare per 5 min 240 x g a temperatura ambiente. Ripetere una volta.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di siero umano in ogni provetta, mescolare bene e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 240 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 1 × 106/ml con PBSA fredda (PBS+0.2%BSA). Dividere le celle in 5 provette, ogni provetta contenente 2 × 105 celle.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 240 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule con buffer di PBSA o PBSA contenente 10 µ l PE (o PE-Cy7) e 10 µ l FITC etichettato anticorpi per macchiare i recettori delle cellule T o NK sul ghiaccio come indicato dalla Figura 4. Cellule sospese con buffer di PBSA sono utilizzate come controllo negativo.</li>
	<li>Incubare le cellule con anticorpi per 20-30 min su ghiaccio al buio.</li>
	<li>Lavare le cellule due volte con PBSA freddo, risospendere le cellule con 300 µ l PBSA freddo.</li>
	<li>Analizzare il fenotipo delle cellule con un citometro a flusso.<ol>
<li>Impostare il citometro a flusso nella condizione di "Creare il foglio di lavoro". Impostare il modello sperimentale con una trama di puntino che visualizza forward scatter (FSC) contro dispersione laterale (SSC).</li>
		<li>Caricare il tubo di controllo di isotipo per ottimizzare le tensioni FSC e SSC e ottimizzare il valore di soglia FSC per eliminare i detriti senza interferire con la popolazione delle cellule di interesse. Elimina tutti i parametri tranne FSC, SSC, FITC, PE e PE-Cy7.</li>
		<li>Eseguire la compensazione utilizzando il controllo di isotipo e un singolo controllo positivo in ogni gruppo di analisi di 2 colori.</li>
		<li>Caricare i campioni e creare HLA-DR VS CD19, puntino VS CD4 CD8, CD16 VS CD56 e CD3 VS CD16 diagrammi che mostrano diversa popolazione di cellule. Nota: PBMC sono stati utilizzati per eseguire la compensazione utilizzando il controllo negativo/isotipo e il singolo controllo positivo. 2-colore immunofluorescenza con citometro a flusso è stato utilizzato ordinariamente per analizzare l'espressione di marcatori di superficie. Le dotazioni comprendono i seguenti anticorpi: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 coniugato con isotiocianato di fluorescina (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 coniugato con ficoeritrina (PE) e anti-CD19 coniugato con PE-Cy7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. espansione e crioconservazione delle cellule di NK/T
<ol><li>Modificare il mezzo quando viene completata l'analisi del fenotipo delle cellule. Rimuovere la metà del surnatante delicatamente ed evitare di toccare le cellule nella parte inferiore della piastra. Aggiungere lo stesso volume di fresco mezzo di coltura contenente 300 U/mL rhIL-2 per le piastre di cella.</li>
	<li>Modificare la metà del mezzo ogni 3 giorni (come 2.2) fino a quando la cella cluster sono chiaramente visibili al microscopio (Figura 2). In genere, questo processo richiede 2-3 settimane.</li>
	<li>Trasferire le cellule da 24 pozzetti per matracci di cultura T25 dopo la miscelazione di diversi pozzetti della stessa stirpe. Doppio del volume di terreno di coltura come si diventa giallo fino a quando il volume del mezzo si espande a 10-15 mL. Aggiungere rhIL-2 con la concentrazione di 150 U/mL.</li>
	<li>Modificare media 24 h prima del congelamento dopo 2-3 settimane di crescita, quando la cella di massa può essere osservato ad occhio nudo. Misurare la concentrazione di cellule con un contatore di cellule.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 240 x g e risospendere il pellet cellulare ad una densità di 5-10 x 106 cellule/mL con la soluzione di riserva congelata contenente siero bovino fetale di 90% e 10% dimetilsulfossido (DMSO). Congelare a un tasso di 1 ° C / min a-80 ° C e poi trasferire direttamente in azoto liquido.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus infection.</a> N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).</li>
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<li>Oshimi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+and+managing+natural+killer-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies.</a> Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cytological+and+cytogenetic+features+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+natural+killer+%28NK%29+cells+and+cell+lines+derived+from+patients+with+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas%2C+chronic+active+EBV+infection+and+hydroa+vacciniforme-like+eruptions%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions.</a> Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).</li>
<li>Oyoshi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+Vgamma9-JgammaP%2FVdelta2-Jdelta3+gammadelta+T+cells+in+nasal+T-cell+lymphoma+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).</li>
<li>Imadome, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+xenograft+models+reveal+a+critical+role+of+CD4%2B+T+cells+in+the+proliferation+of+EBV-infected+T+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).</li>
<li>Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine+requirement+for+the+generation+of+natural+killer+cells+from+CD34%2B+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).</li>
<li>Spits, H., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Human+T+and+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cloning of Human T and Natural Killer Cells.</a> Methods. 9 (3), 416-421 (1996).</li>
<li>Liu, X., Xu, C., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Red+Blood+Cell+Lysis+Method+for+the+Establishment+of+B+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Kawabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometric+in+situ+hybridization+assay+to+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer+cell+lymphoproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases.</a> Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).</li>
</ol>

D.Z., X.Z. e X.C. sono co-inventori su domande di brevetto che copre potenziali utilizzi di questo metodo per stabilire linee di cellule NK/T e le linee cellulari stabilite in questo studio in. D.Z., X.Z. e X.C. non dichiarare concorrenti interessi finanziari in questo lavoro. Gli autori restanti dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

In questo protocollo, è stata sviluppata una nuova tecnica per l'istituzione di linee di cellule NK/T dal sangue intero dei pazienti CAEBV. Confrontato con i metodi esistenti, il principale vantaggio di questo metodo è la sua semplicità e la sua esigenza di solo un piccolo volume di sangue, mentre esibisce un alto tasso di successo e buone condizioni di attuabilità delle cellule. Inoltre, linee di cellule NK/T possono essere stabilite coltivando PBMC senza determinare i tipi di cellule EBV latente infettati in anticipo, ...

Virus di Epstein - Barr (EBV) è onnipresente e infetta non solo le cellule di B, ma anche T e cellule natural killer (NK), che provoca una serie di malattie linfoproliferative EBV-associati NK/T (LPD) e linfoma/leucemia, quali hemophagocytic EBV-associati lymphohistiocytosis, Idroa vacciniforme-come linfoma, extranodal linfoma a cellule NK/T, tipo nasale e NK aggressivo delle cellule di leucemia1,2,3. Tra questi è attivo EBV (SCAEBV) la malattia cronica severa, che è incidente principalmente in Asia orientale, e che è ora considerato un LPD causati dall'espansione clonale di EBV-infettate T o NK cellule4,5,6, 7, ma senza l'immunodeficenza apparente presenti nella mononucleosi contagiosa (IM)-come i sintomi compreso febbre, epatosplenomegalia, linfoadenopatia e disfunzione del fegato con insistenza o periodica, nonché alto EBV-DNA carico nella sangue periferico8,9. Pazienti con CAEBV hanno una prognosi difficile10,11e la relativa patogenesi e il ruolo dell'EBV è poco chiaro. Pertanto, le linee derivate da malattie linfoproliferative EBV-associati NK/T cellulari e linfomi sono molto utili come modelli cellulari per chiarire il meccanismo di EBV indotta da proliferazione NK o cellula T e la sua relazione con alta incidenza di leucemia o linfoma.
Ad oggi, parecchie linee cellulari sono state stabilite con diverse tecniche12,13,14,15,16. Una linea di cellule NK umana, NK-YS, è stata fondata da leucemia/linfoma a cellule NK, di co-coltura con una linea di cellule stromali di topo come alimentatore e in presenza di rhIL-2 ad una concentrazione di 20U per mL15. Kai3 era un'altra linea di cellule NK stabilita da pazienti con un'allergia grave zanzara o SCAEBV con linea cellulare autologo linfoblastoidi (LCL), cellule di B trasformate da EBV, come le cellule di alimentatore e aggiunta di rhIL-2 a 100U/mL16. SNK6 e SNT8 sono stati derivati da tessuti tumorali di pazienti di linfoma a cellule NK/T nasali con l'aggiunta della alto-dose di rhIL-2 (700U/mL)12. Con tecnica simile, la cella di SNK-1 era da pazienti CAEBV, coltivati da PBMC rimuovendo le cellule di T e aggiungendo 700U/mL rhIL-213,17. SNT13 e SNT15 sono stati stabiliti tramite la rimozione di CD4 + e CD8 + cellule18. Finora, altre linee cellulari delle cellule T e NK dai pazienti EBV-NK/T LPD sono stati sviluppati con questo metodo19.
Gli svantaggi dei metodi esistenti di cui sopra comprendono l'impiego di cellule di alimentatore, il requisito di un alto-dose del-2, l'utilizzazione di quanto 10 mL di sangue intero o la purificazione delle cellule di NK/T, che è molto impegnativo in clinica a causa la necessità di verificare quali tipi di cella che EBV latente infetta prima di iniziare a cultura. Come CAEBV si verifica principalmente nei bambini in Asia, 10 mL di sangue non è facile acquisire in tutte le regioni. In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo metodo semplice con un alto tasso di successo per stabilire linee NK e/o cellula T coltivando PBMC dai pazienti CAEBV utilizzando una basso-dose di rhIL2 e un volume di 2 mL di sangue intero senza cellule di alimentatore. I risultati di questo metodo hanno dimostrato la sua elevata efficienza e risparmio di tempo.

<table><tbody><tr><td>Hu HLA-DR FITC</td><td>BD</td> 560944 <td></td><td>anticorpo per FACS</td></tr><tr><td>Hu CD4 FITC</td><td>BD</td><td>555346</td><td>anticorpo per FACS</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD8 PE</td><td>BD</td><td></td><td>557086 anticorpo per FACS</td></tr><tr><td>Hu CD3 PE</td><td>BD</td><td>555340</td><td>anticorpo per FACS</td></tr><tr><td>Hu CD16 FITC 3G8</td><td>BD</td><td>555406</td><td>anticorpo per FACS</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD56 PE MY31</td><td>BD</td><td>anticorpo 556647</td><td>per FACS</td></tr><tr><td>hu/CD19 PE-Cy7</td><td>BD</td><td>560728</td><td>anticorpo per FACS</td></tr><tr><td>umano IL-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>siero umano</td><td>MRC</td><td>CCC118-125</td><td></td></tr><tr><td>incubatore a CO2</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Microscopio per centrifugazione</td></tr><tr><td></td><td>OLYMPUS CKX53</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato</td><td>Countstar</td><td>IC 1000</td><td>Per il conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>cluster di colture cellulari a 24 pozzetti</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Piastre in polistirene</td></tr><tr><td>25cm2 Pallone per colture cellulari</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Polistirene</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Componente del mezzo cellulare</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>life</td><td>22400089</td><td>Per il terreno cellulare</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Amresco</td><td>374</td><td>Componente del terreno cellulare</td></tr><tr><td>100 x streptomicina penicillina soluzione BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Componente del terreno cellulare</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Per l'isolamento in vitro del linfocita</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Per il congelamento delle cellule</td></tr><tr><td>citometro a flusso</td><td>BD</td><td>BD FACSAria II</td><td></td></tr><tr><td>soft ware</td><td>BD</td><td>BD FACSDiva soft ware</td><td>Analisi FACS</td></tr></tbody></table>

un metodo semplice ed efficace per stabilire nk e linee a cellula t da pazienti con infezione attiva cronica del virus di epstein - barr

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Un numero di metodi è state descritto per stabilire linee di cellule NK/T da pazienti con sindrome di linfoma o lymphoproliferative. Questi metodi impiegati le cellule di alimentatore, le cellule NK o T purificate per quanto 10 ml di sangue o un'alto-dose del-2. Questo studio presenta un nuovo metodo con una strategia semplice e potente per stabilire linee delle cellule T e NK, coltivando il periferico del sangue cellule mononucleari (PBMC) con l'aggiunta del-2 di umana ricombinante (rhIL-2) e utilizza più di 2 mL di sangue intero. Le cellule possono proliferare rapidamente in due settimane ed essere mantenute per più di 3 mesi. Con questo metodo, 7 linee NK o cellula T sono state stabilite con un alto tasso di successo. Questo metodo è semplice, affidabile e applicabile alla creazione di linee cellulari da più casi di linfoma a cellule NK/T o CAEBV.

Dopo 3 giorni cultura durante l'istituzione di linee cellulari, le cellule polimorfiche cominciano ad apparire (Figura 2). Dopo 7 giorni, le cellule crescono rapidamente, come il numero e la vitalità delle cellule sono aumentati ad un ritmo elevato (Figura 3). Piccoli grappoli di cellule sono chiaramente visibili dopo 10-14 giorni in crescita, quando la concentrazione di cellule può superare i 3-6 × 106. In questo peri...

Un metodo semplice per ottenere cloni delle cellule T e NK dai pazienti CAEBV è stato sviluppato con alta efficienza, una piccola quantità di sangue periferico e una basso-dose del-2.

Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere linee cellulari NK o T da pazienti con CAEBV, il che ha un grande significato per la ricerca su questa malattia fatale. Questo metodo aiuta a ottenere linee cellulari NK o T per la ricerca sul meccanismo di CAEBV, come lo studio del VBV grezzo sulla proliferazione cellulare, lo screening degli inibitori che interferiscono con la proliferazione delle cellule NK/T. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto semplice ed efficiente che richiede solo una piccola quantità di sangue periferico e una bassa dose di ferro due per stabilire linee cellulari NK o T da pazienti con CAEBV.In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, perché la sopravvivenza cellulare alla prima delle due settimane di coltura è incerta e questo metodo ti mostrerà come determinare la proliferazione cellulare della coltura precoce. Quando abbiamo avuto l'idea di questo metodo, abbiamo scoperto che il ferro sierico umano può includere PBMC per un massimo di due settimane. Abbiamo dimostrato che la dimostrazione di questo metodo è fondamentale, perché mostra la forma delle cellule e la causa della proliferazione.E quell'estensione delle cellule e la numerazione delle cellule della barra Y Per iniziare questa procedura, purificare la PBMC primaria da due millilitri di sangue intero di pazienti con CAEBV mediante centrifugazione a gradiente. In alternativa, scongelare la PBMC crioconservata dall'azoto liquido con il terreno RPMI-1640. Successivamente, aggiungere due microlitri di blu di tripano allo 0,4% a 18 microlitri di sospensione cellulare per colorare le cellule per tre minuti, quindi trasferire la sospensione sulla piastra contacellule e misurare la concentrazione e la vitalità delle cellule con un contatore di cellule automatizzato.Preparare la sospensione cellulare a una densità di due o tre volte 10-10-16 cellule per millilitro, integrata con un terreno di coltura completo RPMI-1640 contenente il 20% di siero umano, due millimolari di L-glutammina e antibiotici. Successivamente, seminare un millilitro di sospensione di PBMC per pozzetto nelle piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti. Quindi, aggiungere 150 unità per millilitro di rhIL-2 a ciascun pozzetto.Posizionare le piastre di coltura in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Il secondo giorno, osserva la morfologia cellulare al microscopio con un ingrandimento di 200 volte. Le celle sono in buone condizioni quando sono luminose e rotonde.In questa fase, aggiungere due microlitri di blu di tripano allo 0,4% a 18 microlitri di sospensione cellulare e calcolare la concentrazione delle cellule. Successivamente, osservare la morfologia cellulare e monitorare le condizioni di crescita cellulare numerando le cellule prima di cambiare terreno. È importante monitorare la morfologia cellulare e la condizione.Possiamo giudicare se le cellule sopravvivono in base alle cellule polimorfiche e alle condizioni delle cellule nella fase iniziale di una coltura. Successivamente, rimuovere 500 microlitri di terreno da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura completo fresco. Quindi aggiungere 150 unità per millilitro di rhIL-2 a ciascun pozzetto.Cambia il mezzo due volte a settimana. Traccia la curva di crescita cellulare. Quando la concentrazione di cellule vitali supera cinque volte 10 per sesta cellule per millilitro, dividere le cellule in nuovi pozzetti a una concentrazione di una o due volte 10 per sesta cellule per millilitro in ciascun pozzetto.Questo processo richiede da due a quattro settimane. Quando le cellule si sono espanse, raccogli una volta da 10 a un sesto di cellule per determinare i fenotipi delle linee cellulari. Centrifugarli a 240 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente per far precipitare le celle NKNT.Successivamente, scartare il surnatante, lavare la precipitazione aggiungendo sette millilitri di PBS. Centrifugare per cinque minuti a 240 volte g a temperatura ambiente. Ripetere la procedura ancora una volta, quindi aggiungere 200 microlitri di siero umano in ogni provetta, mescolare bene e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente Centrifugare le cellule a 240 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.Scartare il surnatante e risospendere le cellule in una sola volta da 10 a 10 cellule per millilitro con PBSA freddo. Successivamente, dividere le cellule in cinque provette contenenti ciascuna due volte 10 per la quinta cellula. Successivamente, centrifugare le cellule a 240 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius Scartare il surnatante e risospendere le cellule con tampone PBSA o PBSA contenente 10 microlitri di PE e 10 microlitri di anticorpi marcati FITC per colorare i recettori cellulari delle cellule T o NK sul ghiaccio.Le cellule sospese con tampone PBSA vengono utilizzate come controllo negativo. Successivamente, incubare le cellule con anticorpi per 20-30 minuti su ghiaccio al buio. Lavare le cellule due volte con PBSA freddo e risospendere le cellule con 300 microlitri di PBSA freddo prima dell'analisi con il citometro a flusso.Al termine dell'analisi del fenotipo cellulare, rimuovere con cura metà del surnatante ed evitare di toccare le cellule sul fondo della piastra. Aggiungere alle piastre lo stesso volume di terreno di coltura fresco contenente rhIL-2 a 300 unità per millilitro, quindi cambiare metà del terreno ogni tre giorni fino a quando i cluster cellulari sono chiaramente visibili al microscopio. Successivamente, trasferire le cellule dalle piastre a 24 pozzetti ai fiaschi di coltura T-25 dopo aver mescolato diversi pozzetti dello stesso lignaggio.Raddoppiare il volume del terreno di coltura man mano che diventa giallo fino a quando il volume del terreno si espande a 10-15 millilitri. Successivamente, aggiungi rhIL-2 con una concentrazione di 150 unità per millilitro. Cambia il terreno 24 ore prima del congelamento dopo due o tre settimane di crescita, quando la massa cellulare può essere osservata ad occhio nudo.Misurare la concentrazione delle celle con il contatore di cellule. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare per cinque minuti a 240 volte g e risospendere il pellet cellulare a una densità da cinque a 10 volte da 10 a 10 cellule per millilitro con la soluzione madre congelata che contiene il 90% di siero fetale bovino e il 10% di DMSO. Congelarlo a una velocità compresa tra un grado Celsius al minuto e meno 80 gradi Celsius e quindi trasferirlo direttamente nell'azoto liquido.Dopo tre giorni di coltura durante la creazione di linee cellulari, iniziano a comparire le cellule polimorfiche. Dopo sette giorni, le cellule crescono rapidamente poiché sia il numero che la vitalità delle cellule sono aumentati ad un ritmo elevato. Piccoli gruppi di cellule sono chiaramente visibili dopo 10-14 giorni di crescita, quando la concentrazione cellulare supera da tre a sei volte 10 a sesto.In questo periodo, le cellule devono essere espanse mediante divisione in due o tre pozzetti della piastra di coltura. Circa un mese dopo, una volta che il numero di cellule raggiunge da tre a cinque volte 10 per settimo, il conteggio è abbastanza alto per la conservazione. Un'altra questione importante è determinare i fenotipi dopo che le cellule sono state coltivate con successo.I nostri risultati indicano che le cellule T e NK possono essere coltivate con il metodo sopra descritto e le linee cellulari possono essere stabilite con questa tecnica poiché le cellule sono cresciute per più di tre mesi in buone condizioni. Questo metodo, questa tecnica, può essere fatta ancora di più. È facile da eseguire correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la variabilità della PBMC. Per questa procedura, entrambi i metodi, come il kit di test MTT 8, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come la tossicità delle linee cellulari NK o T che possono essere utilizzate per l'immunoterapia adottiva. Dopo ogni sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della CAEBV per esplorare il meccanismo di NK/T associato a EBV che coinvolge malattie operative nel sistema modello cellulare.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire ed espandere le linee cellulari NK e T seguendo questo protocollo. Non dimenticare che lavorare con un agente patogeno può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni quando si esegue questa procedura.

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Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr (Video) | JoVE Journal

Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr

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