Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno
January 1st, 2018
L'obiettivo del presente protocollo è di dimostrare un metodo efficace per decellularize e decalcificare coclee del mouse per l'utilizzo come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo efficace per decellularizzare e decalcificare le coclee di topo per utilizzare un'impalcatura per applicazioni di ingegneria tissutale dell'orecchio interno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'udito e dell'ingegneria tissutale, come ad esempio, in che modo la coclea 3D e i vari componenti della matrice extracellulare influenzano la differenziazione delle cellule staminali? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente al ricercatore di studiare come le cellule interagiscono direttamente con la matrice extracellulare della coclea per formare l'epitelio sensoriale.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'isolamento dell'osso temporale e l'apparato di profusione cellulare possono essere difficili da visualizzare correttamente sulla base delle sole descrizioni testuali. Per iniziare questa procedura, dividere in due il cranio sul piano sagittale medio utilizzando un paio di forbici chirurgiche affilate. Quindi, rimuovi il tessuto cerebrale dal cranio.
Quindi identificare l'osso temporale attraverso la presenza delle radici del nervo uditivo e vestibolare all'interno del cranio e del condotto uditivo dall'esterno. Tagliare con cura il cranio per isolare l'osso temporale dal resto del cranio. Successivamente, inserire la pinza sottile nell'apertura del condotto uditivo di circa cinque millimetri in modo che le punte non rischino di perforare la coclea.
Rompi delicatamente l'osso della bola in modo che si fratturi. Usando una pinza fine, staccare il resto della bola dall'osso temporale esponendo il labirinto osseo della coclea. Successivamente, immergere l'osso temporale in PBS con le finestre ovali e rotonde della coclea rivolte verso l'alto.
Utilizzando un paio di pinze ultrasottili, rimuovere l'arteria stapediale che passa attraverso la staffa. Quindi inserire una punta della pinza ultrasottile attraverso l'arco della staffa attraverso il quale passa l'arteria e sollevare delicatamente la staffa verso l'alto. Successivamente, forare le finestre ovali e rotonde.
Successivamente, posizionare il tubo che è collegato a una siringa da 28,5 gauge riempita di PBS sopra la finestra ovale. Somministrare due millimetri di antibiotico-atimicotico al 10% e penicillina-streptomicina in PBS attraverso la coclea in cinque minuti per rimuovere la perilinfa. Quindi rimuovere e scartare il tessuto muscolare rimanente e i frammenti ossei.
Per la decellularizzazione, utilizzando la pipetta di trasferimento, aspirare delicatamente la coclea nella pipetta in modo che superi il bordo tagliato di pochi millimetri. Quindi, espellere la coclea nella fiala di scintillazione riempita con soluzione SDS all'1%. Far circolare due millilitri di SDS all'1% in acqua deionizzata attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.
Posizionare la fiala di scintillazione in un rotatore e lasciarla ruotare a 10 giri/min per 72 ore a temperatura ambiente. Sostituire con una soluzione fresca di SDS all'1% ogni 24 ore per un periodo di 72 ore e fare attenzione a non esporre la coclea all'aria durante la sostituzione della soluzione. Successivamente, lavare la coclea tre volte nella stessa fiala di scintillazione per 30 minuti ciascuna in acqua deionizzata.
In questa fase, la coclea dovrebbe essere decellularizzata. Per la decalcificazione, rimuovere l'acqua deionizzata rimanente dalla fiala di scintillazione, lasciandone quanto basta per mantenere la coclea sommersa. Per iniziare la decalcificazione, aggiungere cinque millilitri di EDTA al 10% e acqua deionizzata alla fiala di scintillazione contenente la coclea.
Far circolare due millilitri di EDTA al 10% in acqua deionizzata attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento. Riposizionare la fiala di scintillazione nel rotatore e lasciare che la fiala di scintillazione ruoti a 10 giri/min per 72 ore a temperatura ambiente. Cambia la soluzione EDTA al 10% ogni 24 ore per un periodo di 72 ore.
Fare attenzione quando si cambiano le soluzioni in modo che la coclea non sia esposta all'aria. Quindi sciacquare la coclea tre volte per due ore ciascuna con PBS. In questa fase, la coclea deve essere decalcificata.
Prima di infondere le cellule, iniziare incubando la coclea decellurizzata e decalcificata in un incubatore per colture cellulari al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per un minimo di un'ora. Per cocleae, aggiungi una goccia di MSCGM a ciascuna coclea per evitare che la coclea si secchi. Trasferirli in una nuova piastra a 24 pozzetti utilizzando una pipetta di trasferimento.
Orientare delicatamente la coclea utilizzando una pinza ultrasottile in modo che le finestre ovali e rotonde siano rivolte verso l'alto. Quindi, utilizzando una siringa da insulina sterile calibro 28,5 con tubo collegato, aspirare 0,2 millilitri di cellule di gelatina umana di Wharton risospese. Successivamente, posizionare il tubo sopra la finestra ovale utilizzando una pinza fine sterilizzata.
Innaffiare delicatamente e lentamente la coclea con 0,2 millilitri di cellule di gelatina umana di Wharton risospese per cinque minuti. Questa fase di profusione è importante. La profusione di liquidi attraverso la coclea influisce notevolmente sull'esito di questo protocollo.
Dopo la profusione, aggiungere 0,8 millilitri di MSCGM preriscaldato a 37 gradi Celsius al pozzetto contenente la coclea per portare il volume totale a un millilitro. Ripetere la procedura per ogni coclea. Usando ogni volta una siringa e un tubo nuovi.
Posizionare la coclea abbondante in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e cambiare il terreno tre volte alla settimana. Qui viene mostrata la decellularizzazione e la decalcificazione di successo di una coclea di topo senza cellule iniettate. Nel complesso, l'anatomia della coclea è preservata con vuoti lasciati senza macchie di dappy.
Ecco i risultati rappresentativi delle cellule di gelatina di Wharton umano coltivate con successo su un'impalcatura di coclea. Si osserva un'abbondante colorazione dappy in tutta la coclea e sulla superficie ossea esterna. Un esame più attento dei singoli turni rivela che le strutture fini della coclea sono preservate dopo la decellularizzazione e la decalcificazione e che le cellule iniettate sono attaccate e/o interagiscono con la matrice extracellulare nativa della coclea.
La decellularizzazione in colture cellulari successive è stata studiata anche utilizzando la colorazione H&E. La coclea decellularizzata non conteneva nessuna delle cellule della coclea nativa ma conserva la maggior parte dell'anatomia dell'organo di Corti perché la matrice extracellulare rimane. Iniettato in cellule in coltura può essere osservato attraverso l'organo di Corti, interagendo con la matrice extracellulare decellularizzata.
Una volta padroneggiata, la profusione di cellule in una coclea decellularizzata può richiedere circa 10-15 minuti se la coclea è già preparata e gli strumenti necessari sono disposti in modo appropriato. Durante il tentativo di questa procedura è importante maneggiare la coclea con cura poiché è fragile. È anche importante evitare l'introduzione di aria nella coclea poiché le bolle bloccheranno il flusso dei liquidi durante le profusioni.
Questa procedura generale può essere applicata alle coclee di altre specie e può essere iniettata anche un'ampia gamma di tipi di cellule. I tempi specifici di decellularizzazione e decalcificazione probabilmente varieranno, ma i concetti di base rimarranno gli stessi. Il Dr.Peter Santi dell'Università del Minnesota ha inizialmente sviluppato la tecnica di decellularizzazione che abbiamo modificato per questo protocollo.
Speriamo di rendere la nostra tecnica e la coltura cellulare su scaffold di coclea disponibili ad altri ingegneri tissutali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare, decellularizzare e decalcificare con successo le ossa temporali prima di iniettare le cellule per l'uso negli esperimenti di coltura.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra un metodo efficace per decellularizzare e decalcificare le coclee di topo per l'uso come scaffold nelle applicazioni di ingegneria dei tessuti. La tecnica permette ai ricercatori di studiare l'interazione tra le cellule e la matrice extracellulare cocleare, che è cruciale per comprendere la formazione dell'epitelio sensoriale.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Ingegneria dei tessuti
- Ricerca uditiva
- Interazioni cellulari
Sfondo
- La decellularizzazione e la decalcificazione sono essenziali per creare scaffold.
- Comprendere la struttura cocleare è vitale per la ricerca dell'orecchio interno.
- La differenziazione delle cellule staminali è influenzata dalla matrice extracellulare.
- I metodi visivi migliorano la comprensione di procedure complesse.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per la preparazione di scaffold cocleari.
- Facilitare la ricerca sulle interazioni cellulari cocleari.
- Avanzare la conoscenza nei campi dell'ingegneria uditiva e dei tessuti.
Metodi utilizzati
- Isolamento dell'osso temporale dal cranio.
- Decellularizzazione delle coclee.
- Processo di decalcificazione per la preparazione dello scaffold.
- Dimostrazione visiva della procedura per chiarezza.
Risultati principali
- Decellularizzazione e decalcificazione di successo delle coclee di topo.
- Migliorata comprensione delle interazioni tra cellule e matrice extracellulare.
- Metodi migliorati per studiare la formazione dell'epitelio sensoriale.
- Aiuti visivi migliorano significativamente la comprensione procedurale.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce uno strumento prezioso per la ricerca sull'orecchio interno.
- Apre vie per studiare il comportamento delle cellule staminali negli scaffold cocleari.
- Le dimostrazioni visive sono cruciali per le procedure biologiche complesse.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to generate physiologically relevant cochlear scaffolds for studying stem cell interactions with native extracellular matrix, supporting target validation in auditory regenerative medicine. By preserving extracellular matrix architecture while removing cellular components, the method provides a defined system to de-risk mechanistic hypotheses about matrix-mediated cell behavior in inner ear tissue engineering. The approach supports preclinical model development for hearing loss therapeutics by allowing controlled evaluation of cell-scaffold dynamics in a 3D disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding extracellular matrix influence on stem cell differentiation and sensory epithelium formation.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets by isolating matrix-specific effects from cellular variables in a controlled scaffold system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible biological systems for quantitative assessment of cell invasion, proliferation, and matrix interaction.
- Operational Value: Supports assay scalability and platform reuse through consistent decellularization and decalcification outputs across multiple cochleae.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native cochlear architecture.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by enabling longitudinal observation of cell-scaffold interactions over 30-day culture periods.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing extracellular matrix scaffolds post-isolation, enabling hypothesis testing in lead identification stages before preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by allowing direct study of cell-extracellular matrix interactions without confounding cellular debris.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized scaffold preparation that preserves structural integrity for reliable compound or cell evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via cell invasion depth, proliferation rates, and matrix interaction patterns observable through staining and imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining organ of Corti structure, enabling extrapolation to in vivo-like environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable scaffold platform applicable across cell types and species, reducing redundant isolation efforts in auditory tissue engineering programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in extracellular matrix-mediated cell behavior.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined decellularization (72-hour SDS rotation) and decalcification (72-hour EDTA rotation) protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling early assessment of matrix-dependent cell responses, reducing late-stage biological risk in auditory regenerative programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of stem cell or matrix-modulating candidates based on scaffold-based functional readouts.
Implementation Considerations
- Required expertise in microsurgical temporal bone isolation and sterile cell perfusion techniques.
- Instrumentation needs include ultra-fine forceps, transfer pipets, rotators, and sterile syringe perfusion systems.
- Cross-team standardization requires adherence to solution exchange schedules and air-exposure avoidance during decellularization/decaltification.
- Adaptation considerations include species-specific timing adjustments and validation of scaffold integrity for alternative cell types beyond Wharton's jelly-derived MSCs.
- Practical limitations include cochlear fragility necessitating careful handling to prevent structural damage during isolation and perfusion.
