Name: Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per lingegneria dei tessuti dellorecchio interno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Impara a decellularizzare e decalcificare coclee murine per creare scaffold nell'ingegneria tissutale dell'orecchio interno. Questo metodo consente di studiare le interazioni cellulari con la matrice extracellulare cochleare.

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L'attuale progetto è stato finanziato dalla prova dell'Università del Kansas di fondo di concetto. Vorremmo ringraziare il personale infermieristico a KUMC (Kansas City, KS) per aiutarci a ottenere cordoni ombelicali umani e David Jorgensen per assistere con culture di coclee.

Tutte le procedure, tra cui l'eutanasia degli animali, sono state condotte secondo il protocollo approvato del istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) (Coppa #2014-2234) presso l'University of Kansas Medical Center (KUMC).
Nota: HWJCs sono state isolate da cordone ombelicale umani che sono stati donati dai pazienti che ha fornito il consenso informato e gli esemplari sono stati utilizzati secondo i protocolli approvati dal comitato di soggetti umani di Università del Kansas (KU-IRB #15402).
1. osso temporale raccolto e coclea isolamento
<ol>
	<li>Decapita un mouse in modo appropriato eutanasizzato, 15-settimana-vecchio di taglio tra il cranio e la prima vertebra cervicale con un paio di forbici chirurgiche, quindi spruzzare giù la testa con etanolo al 70% per disinfettare (Figura 1A).</li>
	<li>Bisecare il cranio in un piano sagittale utilizzando lo stesso paio di forbici chirurgiche (Figura 1B- C, le linee tratteggiate).</li>
	<li>Rimuovere il tessuto di cervello dal cranio usando un paio di pinze (Figura 1, punta di freccia).</li>
	<li>Identificare l'osso temporale attraverso la presenza di uditivo e le radici del nervo vestibolare (Figura 1E-F, punte di freccia) all'interno del cranio e il condotto uditivo dall'esterno (Figura 1F, freccia). Accuratamente tagliato attraverso il cranio per isolare l'osso temporale dal resto del cranio (Figura 1). Nota: In alcuni casi, è possibile fare leva delicatamente le ossa circostanti del cranio dall'osso temporale senza la necessità di taglio.</li>
	<li>Inserire il forcipe fine nell'apertura del condotto uditivo circa 5 mm (Figura 1 H), in modo che le punte non si rischiano di perforare della coclea. Delicatamente, rompere l'osso della bulla (Figura 1 H, top rosso zona ombreggiata) così fratture (lineaFigura 1I, rosso punteggiato). Nota: Se necessario, un microscopio di dissezione può essere di aiuto in questo processo per assicurare un posizionamento preciso e manipolazione degli strumenti.</li>
	<li>Utilizzando una pinzetta, leva via il resto della bulla dall'osso temporale, esponendo il labirinto ossuto della coclea (Figura 1J, staffe rossi).</li>
	<li>Inserire una capsula di Petri sufficientemente grande da contenere l'osso temporale (ad esempio, 30 mm o maggiore) sotto la dissezione di campo di ambito e riempirlo con abbastanza Phosphate Buffered Saline (PBS) per coprire l'osso temporale (ad esempio, 0,5-1 mL).</li>
	<li>Immergere l'osso temporale con la bulla rimossa in PBS con le finestre ovale e rotonde della coclea rivolto verso l'alto. Nota: La rimozione del sistema vestibolare dalla coclea non è necessario, come il sistema vestibolare serve anche come un handle per il maneggiamento e orientando le caratteristiche della coclea (Figura 1I e Figura 2B).</li>
	<li>Utilizzando un ultra-sottile paio di pinze, rimuovere l'arteria stapediali, che passa attraverso lo stapes.</li>
	<li>Inserire una punta delle pinze ultra fine attraverso l'arco dello stapes dove l'arteria è attraversato e sollevare delicatamente lo stapes. Stapes disarticolate dovrebbe sollevare fuori la finestra ovale.</li>
	<li>Utilizzando una punta delle pinze ultra-sottile, l'ovale di puntura e finestre rotonde.</li>
	<li>Utilizzando un PBS 1X preriempita 28,5-manometro con tubo (diametro interno 0,28 mm, diametro esterno 0,61 mm) fissato, posizionare il tubo sopra la finestra ovale (Figura 2A -B). Nota: L'apertura del tubo può essere manipolato con forcipe ultra-fine, contribuendo a garantire un posizionamento preciso.<ol>
		<li>Utilizzare una siringa fresco e tubi per ogni coclea.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Irrorare di 2 mL di 10% antibiotico antimicotico (anti-anti) e 10% penicillina-streptomicina (penna-strep) in PBS tramite coclea oltre 5 min per rimuovere perilymph. Che irrora troppo veloce con troppa pressione danneggia le strutture fini all'interno della coclea. Nota: Guida manualmente la siringa a mano per irrorare il fluido attraverso la coclea è efficace, anche se una pompa di perfusione potrebbe essere utilizzata come alternativa.<ol>
		<li>Se manualmente che irrora, usare un paio di belle, dichiusura forcipe per stabilizzare la coclea (Figura 2A) durante l'aspersione afferrando la parte vestibolare dell'osso temporale. Nota: Anche se non richiesto, questo lascia entrambe le mani libere maneggiare gli strumenti; una mano può guidare la siringa (Figura 2A) mentre l'altro può posizionare il tubo in modo appropriato (Figura 2B).</li>
		<li>Da questo punto in avanti, prendersi cura per evitare di esporre la coclea inutilmente all'aria. L'introduzione di bolle d'aria negli spazi fluidi bloccherà la circolazione dei fluidi, e ulteriore essiccazione danneggia le strutture fini all'interno della coclea.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rimuovere ed eliminare eventuali rimanenti frammenti di ossa e dei tessuti dei muscolo utilizzando una pinzetta.</li>
	<li>Se necessario, è possibile memorizzare isolati coclee a 4 ° C in anti-anti 10% e 10% soluzione di penna-strep in PBS per fino a sette giorni con cambi regolari di soluzione antibiotica ogni 48 h.</li>
</ol>
2. coclea elaborazione
<ol>
	<li>Decellularizzazione
	<ol>
		<li>Per ogni coclea, riempire una fiala di scintillazione di vetro da 20 mL con un 1% sodio dodecil solfato soluzione (SDS) in acqua deionizzata (DI), che viene utilizzato per decellularize la coclea.</li>
		<li>Tagliare la punta fuori di una pipetta di plastica 7-mL trasferimento utilizzando una lama di rasoio in modo che l'apertura è abbastanza grande per una coclea di passare attraverso.</li>
		<li>Usando la pipetta, delicatamente redigere la coclea nella pipetta modo passa solo il bordo di taglio di pochi millimetri.</li>
		<li>Espellere la coclea nella fiala di scintillazione riempito di soluzione di 1% SDS.</li>
		<li>Circolare 2 mL di SDS 1% in acqua deionizzata (DI) attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
		<li>Collocare il flaconcino di scintillazione in un rotatore e lasciare riposare il flaconcino scintillazione ruotare a 10 giri per 72 h a temperatura ambiente.<ol>
			<li>Cambiare 1% SDS soluzione ogni 24 ore, per un periodo di 72 h. Fare attenzione quando si cambia SDS per non esporre mai la coclea all'aria.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Lavare la coclea tre volte per 30 minuti ciascuno, con dell'acqua distillata.</li></ol></li></ol>Eseguire i lavaggi del flaconcino di scintillazione stesso utilizzato per le spese di SDS; in questa fase, la coclea è decellularized.
	
	
	<li>Decalcificazione
	<ol>
		<li>Rimuovere l'acqua residua DI dal flaconcino di scintillazione, lasciando appena sufficiente per mantenere la coclea sommersa.</li>
		<li>Per iniziare la decalcificazione, aggiungere 5 mL di 10% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,02 M) in acqua distillata nel flaconcino di scintillazione contenente la coclea.</li>
		<li>Circolare 2 mL di EDTA 10% DI acqua attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
		<li>Collocare il flaconcino di scintillazione indietro nel rotatore e lasciare riposare il flaconcino scintillazione ruotare a 10 giri per 72 h a temperatura ambiente. Cambiare la soluzione di EDTA 10% ogni 24 ore, per un periodo di 72 ore. Fare attenzione quando si cambia soluzioni in modo che la coclea non è esposto all'aria.</li>
		<li>Sciacquare la coclea 3 volte per 2 h ciascuna con PBS 1X; in questa fase, la coclea è decalcificata.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deposito
	<ol>
		<li>Memorizzare le coclee per fino a 72 h in un'anti-anti, 10% penna-strep soluzione al 10% in PBS a 4 ° C. Nota: Più lunghi periodi di stoccaggio possono essere possibili con cambi regolari di soluzione antibiotica; Tuttavia, stoccaggio prolungato di coclee trasformati non è stato convalidato in questo protocollo.</li>
	</ol>
	</li>

3. appalti pubblici e l'espansione di hWJCs
<ol>
	<li>Isolare il hWJCs secondo protocolli precedentemente pubblicati22. Brevemente, segmento cordoni ombelicali in sezioni di 3 cm.</li>
	<li>Attentamente fare un'incisione superficiale con un bisturi longitudinalmente su ciascun segmento di cavo ombelicale per srotolare ed esporre gelatina di Wharton del cordone ombelicale. Utilizzare pinze per rimuovere i vasi sanguigni.</li>
	<li>Lavare cordone ombelicale segmenti due volte con abbastanza PBS (ad es., 40 mL in una capsula di Petri di 60 mm) per immergere il tessuto. Tritare finemente i segmenti di tessuto con un bisturi. Digerire il tessuto in un 100mm Petri con 50 mL di mezzo di digestione (collagenasi tipo 2 0,2%, 1% penicillina-streptomicina, in basso-glucosio Medium (DMEM dell'Aquila per volta di Dulbecco)).</li>
	<li>Posto del tessuto nella digestione medio su agitatore orbitale a 50 rpm durante la notte in un 5% CO2, incubatore 37 ° C. Il giorno seguente, diluire mezzo di digestione con un rapporto di 01:16 in 2% antibiotico antimicotico in PBS e pellet di cellule mediante centrifugazione a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) per 10 min. Discard surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in Mesenchymal Stem Cell crescita medio (MSCGM) e ricombinare le cellule. Piastra le cellule ad una densità di 7 x 103 cellule/cm2 nella coltura del tessuto trattate boccette di T-75. HWJCs in MSCGM della cultura ed espandere al passaggio 5 per esperimenti. Nota: HWJCs può essere sub-coltivate in T-palloni più grandi (ad es., T-150, T-300) quando passaggio per aumentare la resa di hWJCs per gli esperimenti.</li>
</ol>
4. infusione di hWJCs in Decellularized coclee
<ol>
	<li>Preparare decellularizzati coclee
	<ol>
		<li>Utilizzando una tecnica asettica, lavare coclee stored in PBS 1X tre volte per 30 minuti ciascuno.</li>
		<li>Coclee di trasferimento in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 1 mL di 37 ° C pre-riscaldati MSCGM.</li>
		<li>Incubare le coclee in un 5% CO2, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C per un minimo di 1 h prima dell'infusione delle cellule.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissociare hWJCs e risospendere
	<ol>
		<li>HWJCs di lavaggio con 37 ° C pre-riscaldati 1X PBS due volte.</li>
		<li>Aggiungere sufficiente 37 ° C pre-riscaldati tripsina con EDTA 0,5% per coprire la superficie del vaso di cella.</li>
		<li>Incubare hWJCs per fino a 5 min in un 5% CO2, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C.<ol>
			<li>Verificare che il 90% delle cellule staccato dalla superficie di coltura delle cellule visualizzando le cellule al microscopio invertito. Nota: Le cellule che si muovono quando la nave di cultura delicatamente è sfruttata, staccato. Le cellule che rimangono fisse, non siano staccate.</li>
			<li>Picchiettare delicatamente i lati del pallone per sloggiare ulteriormente cellule allegate.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utilizzando una tecnica asettica, hWJCs trasferimento dal recipiente di coltura in una provetta conica da 50 mL contenente un volume equivalente di MSCGM al volume di tripsina utilizzato per dissociare le cellule.</li>
		<li>A pellet il hWJCs mediante centrifugazione a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) per 5 min.</li>
		<li>Aspirare il supernatante e risospendere hWJCs in MSCGM ad una concentrazione di 500.000 cellule/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Irrorare le coclee
	<ol>
		<li>Coclee di trasferimento ad una nuova piastra 24 pozzetti usando una pipetta di trasferimento.</li>
		<li>Aggiungere una goccia di MSCGM per ogni coclea per impedire qualsiasi coclea asciugarsi.</li>
		<li>Delicatamente e orientare la coclea utilizzando forcipe ultra-fine, in modo che le finestre ovali e rotonde sono rivolto verso l'alto. Nota: La estrema attenzione direttamente ogni coclea come la coclea è danneggiata facilmente.</li>
		<li>Usando una siringa sterile 28,5-calibro insulina con tubi collegati, redigere 0,2 mL risospese hWJCs (100.000 cellule).</li>
		<li>Con una pinzetta sterilizzata, posizionate tubi finestra ovale.</li>
		<li>Delicatamente e lentamente irrorare la coclea con 0,2 mL di sedimento hWJCs utilizzando una siringa da insulina 28,5-manometro collegata al tubo in polietilene (diametro esterno: 0,61 mm, diametro interno: 0,28 mm) sopra circa 5 min.</li>
		<li>Dopo aspersione, aggiungere 0,8 mL di 37 ° C pre-riscaldati MSCGM al bene contenente la coclea per portare il volume totale nel pozzo a 1 mL.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 4.3.3-4.3.7 per ogni coclea, usando una siringa fresca e tubi ogni volta.</li>
		<li>Posto irrorati coclee in un cambiamento supporti tre volte alla settimana, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C e 5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. conservazione e raccolto coclea
Nota: Coclee possono essere coltivate e raccolgono in qualsiasi momento post-l'aspersione fino a 30 giorni.
<ol>
	<li>Per conservare le coclee, difficoltà in paraformaldeide al 4% in PBS 1X durante la notte a 4 ° C su una piattaforma a dondolo.</li>
	<li>Dopo la fissazione, lavare coclee con PBS 1X tre volte per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Gradualmente disidratare coclea con etanolo e chiaro con un solvente idrocarburo alifatico prima di incorporare in paraffina.</li>
	<li>Sezione campioni ad uno spessore di 10 µm utilizzando un microtomo e montare su vetrini. Nota: I campioni sono pronti per l'istologico o immunohistochemical elaborazione utilizzando protocolli standard.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo dimostrato con successo che le cellule cocleari native possono essere rimosso dalla coclea tramite un processo di decellularizzazione, che consente l'utilizzo della coclea come un'impalcatura di tessuto intricato, tridimensionale. Santi et al. 15 ha sviluppato il metodo iniziale per coclee decellularizing e hanno valutato esattamente i volumi di molte strutture cocleari attraverso con l'aiuto del foglio leggero microscopia23. Questi primi lavori servito com...

La coclea è una struttura a spirale intricato trovata nell'osso temporale. Esso è composto da un labirinto osseo esterno e un labirinto membranoso concentrici, interno1. Il labirinto membranoso è costituito da tre spazi fluidi: vestibuli di scala, Scala media e tympani di Scala1. I mezzi di scala ospita l'epitelio sensoriale, che è composto da una moltitudine di tipi di cellule, ma le cellule ciliate sensoriali (HC), che trasducono energia meccanica in onde sonore in impulsi nervosi2, sono di particolare interesse. L'esposizione al trauma acustico3,4,5, farmaco6, malattia7,8e9 di invecchiamento può provocare di alterata funzione uditiva tramite morte HC. Perdita di capelli cellulare nei mammiferi è permanente, a differenza di aviaria HCs, che può rigenerare dopo lesioni10.
Una varietà di sforzi di ricerca contemporanea hanno cercato di ripristinare perso HCs, anche se gli approcci sperimentali specifici variano. Manipolazione dell'espressione genica in epitelio sensoriale e l'impianto di cellule staminali differenziate all'esterno del corpo sono approcci dominanti nel campo, anche se i metodi di induzione che cercano di differenziare le cellule staminali in organoids cocleari sono stati ha tentato di11,12,13. Ciascuno di questi approcci sia reliant direttamente su cellule staminali, o i segnali dello sviluppo utilizzati dalle cellule staminali; Tuttavia, un secondo ha condiviso, e potenzialmente critici, elemento è l'ECM della coclea stessa14,15.
L'ECM non solo fornisce supporto fisico per cellule e tessuti, che comprende una superficie di adesione delle cellule, proliferazione, sopravvivenza e migrazione, ma svolge anche il ruolo critico nello sviluppo di HCs e la spirale del ganglio15,16 ,17. Naturalmente che si verificano ECM fornisce segnali induttivi che possono guidare la determinazione del fenotipo cellulare e/o di adesione, proliferazione e sopravvivenza cellulare18. Di conseguenza, l'uso di decellularizzazione coclea in combinazione con hWJCs coltivate offrono un'occasione unica per esplorare il ruolo della rigenerazione ECM e HC. HWJCs sono un tipo di cellula prontamente disponibili, non controverso isolato dal cordone ombelicale umani che si comportano come cellule staminali mesenchimali19. HWJCs hanno dimostrato la capacità di differenziarsi verso il basso delle cellule neurosensoriali lignaggi20,21. Così, l'attuale protocollo dettagli l'isolamento, decellularizzazione e perfusione delle coclee da carcasse del mouse C57BL con hWJCs per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno.

<table><tbody><tr><td>Allegra X-14R Centrifuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Tubi semirigidi intramedici</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 2000 Shaler orbitale</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Pinze ultrafini</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Fisher Scientific</td> Siringa da <td>insulina FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>U-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>Fiala a scintillazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Piastra</td> <td>a 24 pozzettiFisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio in vetro SuperFrost PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant con DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Serie II 3110 CO2 Incubatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali Lonza</td><td></td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 Pallone di coltura</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 Fiaschetta di coltura</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>Pallone di coltura TPP T-300</td><td>Microscopio per</td><td></td> dissezione TP90301 <td></td>MidSci</tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito Nikon Eclipse Ts2R-FL Nikon</td><td>Instruments</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire Classe II, tipo A2 Cabina di biosicurezza</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione SDS 1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo per decellularizing mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Nei mammiferi, le cellule ciliate che mechanosensory che facilitano la mancanza dell'udito la capacità di rigenerare, che ha limitato i trattamenti per la perdita dell'udito. Attuali strategie di medicina rigenerativa sono concentrati sul trapianto di cellule staminali o la manipolazione genetica delle cellule di supporto nell'orecchio interno per incoraggiare la sostituzione delle cellule danneggiate di staminali per correggere la perdita della capacità uditiva circostanti. Ancora, la matrice extracellulare (ECM) può svolgere un ruolo vitale nell'induzione e mantenimento della funzione delle cellule ciliate e non è stato ben studiata. Utilizzando il cocleare ECM come impalcatura per crescere le cellule staminali adulte possono fornire intuizioni uniche come la composizione e l'architettura dell'ambiente extracellulare aiuta le cellule nel sostenere la funzione uditiva. Qui presentiamo un metodo per isolare e decellularizing coclee da topi da utilizzare come scaffold accettando irrorato le cellule staminali adulte. Nel protocollo attuale, coclee sono isolate da topi eutanasizzati, decellularized e decalcificati. In seguito, cellule di gelatina di Wharton umana (hWJCs) che sono state isolate da cordone ombelicale sono state irrorate con attenzione in ogni coclea. Le coclee sono stati usati come bioreattori, e le cellule sono state coltivate per 30 giorni prima in fase di elaborazione per l'analisi. Coclee decellularizzati mantenuto strutture extracellulari identificabili, ma non hanno rivelato la presenza di cellule o notevoli frammenti di DNA. Cellule irrorate nella coclea invasero la maggior parte dell'interno ed esterno della coclea ed è cresciuta senza incidenti nel corso di una durata di 30 giorni. Così, il metodo corrente può essere utilizzato per studiare come cocleare ECM colpisce cellule sviluppo e comportamento.

Utilizzando i metodi presentati qui, successo decellularizzazione di coclee è stata valutata esaminando la presenza o l'assenza di DNA attraverso 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Coclee sono stati considerati pienamente decellularizzati se il DNA non è stato identificato all'interno della coclea decellularizzata. Una coclea nativa da un esperimento precedente che non subissero decellularizzati o decalcificazione è stata utilizzata come controllo positivo per illustrare l...

L'obiettivo del presente protocollo è di dimostrare un metodo efficace per decellularize e decalcificare coclee del mouse per l'utilizzo come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.

Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo efficace per decellularizzare e decalcificare le coclee di topo per utilizzare un'impalcatura per applicazioni di ingegneria tissutale dell'orecchio interno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'udito e dell'ingegneria tissutale, come ad esempio, in che modo la coclea 3D e i vari componenti della matrice extracellulare influenzano la differenziazione delle cellule staminali? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente al ricercatore di studiare come le cellule interagiscono direttamente con la matrice extracellulare della coclea per formare l'epitelio sensoriale.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'isolamento dell'osso temporale e l'apparato di profusione cellulare possono essere difficili da visualizzare correttamente sulla base delle sole descrizioni testuali. Per iniziare questa procedura, dividere in due il cranio sul piano sagittale medio utilizzando un paio di forbici chirurgiche affilate. Quindi, rimuovi il tessuto cerebrale dal cranio.Quindi identificare l'osso temporale attraverso la presenza delle radici del nervo uditivo e vestibolare all'interno del cranio e del condotto uditivo dall'esterno. Tagliare con cura il cranio per isolare l'osso temporale dal resto del cranio. Successivamente, inserire la pinza sottile nell'apertura del condotto uditivo di circa cinque millimetri in modo che le punte non rischino di perforare la coclea.Rompi delicatamente l'osso della bola in modo che si fratturi. Usando una pinza fine, staccare il resto della bola dall'osso temporale esponendo il labirinto osseo della coclea. Successivamente, immergere l'osso temporale in PBS con le finestre ovali e rotonde della coclea rivolte verso l'alto.Utilizzando un paio di pinze ultrasottili, rimuovere l'arteria stapediale che passa attraverso la staffa. Quindi inserire una punta della pinza ultrasottile attraverso l'arco della staffa attraverso il quale passa l'arteria e sollevare delicatamente la staffa verso l'alto. Successivamente, forare le finestre ovali e rotonde.Successivamente, posizionare il tubo che è collegato a una siringa da 28,5 gauge riempita di PBS sopra la finestra ovale. Somministrare due millimetri di antibiotico-atimicotico al 10% e penicillina-streptomicina in PBS attraverso la coclea in cinque minuti per rimuovere la perilinfa. Quindi rimuovere e scartare il tessuto muscolare rimanente e i frammenti ossei.Per la decellularizzazione, utilizzando la pipetta di trasferimento, aspirare delicatamente la coclea nella pipetta in modo che superi il bordo tagliato di pochi millimetri. Quindi, espellere la coclea nella fiala di scintillazione riempita con soluzione SDS all'1%. Far circolare due millilitri di SDS all'1% in acqua deionizzata attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.Posizionare la fiala di scintillazione in un rotatore e lasciarla ruotare a 10 giri/min per 72 ore a temperatura ambiente. Sostituire con una soluzione fresca di SDS all'1% ogni 24 ore per un periodo di 72 ore e fare attenzione a non esporre la coclea all'aria durante la sostituzione della soluzione. Successivamente, lavare la coclea tre volte nella stessa fiala di scintillazione per 30 minuti ciascuna in acqua deionizzata.In questa fase, la coclea dovrebbe essere decellularizzata. Per la decalcificazione, rimuovere l'acqua deionizzata rimanente dalla fiala di scintillazione, lasciandone quanto basta per mantenere la coclea sommersa. Per iniziare la decalcificazione, aggiungere cinque millilitri di EDTA al 10% e acqua deionizzata alla fiala di scintillazione contenente la coclea.Far circolare due millilitri di EDTA al 10% in acqua deionizzata attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento. Riposizionare la fiala di scintillazione nel rotatore e lasciare che la fiala di scintillazione ruoti a 10 giri/min per 72 ore a temperatura ambiente. Cambia la soluzione EDTA al 10% ogni 24 ore per un periodo di 72 ore.Fare attenzione quando si cambiano le soluzioni in modo che la coclea non sia esposta all'aria. Quindi sciacquare la coclea tre volte per due ore ciascuna con PBS. In questa fase, la coclea deve essere decalcificata.Prima di infondere le cellule, iniziare incubando la coclea decellurizzata e decalcificata in un incubatore per colture cellulari al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per un minimo di un'ora. Per cocleae, aggiungi una goccia di MSCGM a ciascuna coclea per evitare che la coclea si secchi. Trasferirli in una nuova piastra a 24 pozzetti utilizzando una pipetta di trasferimento.Orientare delicatamente la coclea utilizzando una pinza ultrasottile in modo che le finestre ovali e rotonde siano rivolte verso l'alto. Quindi, utilizzando una siringa da insulina sterile calibro 28,5 con tubo collegato, aspirare 0,2 millilitri di cellule di gelatina umana di Wharton risospese. Successivamente, posizionare il tubo sopra la finestra ovale utilizzando una pinza fine sterilizzata.Innaffiare delicatamente e lentamente la coclea con 0,2 millilitri di cellule di gelatina umana di Wharton risospese per cinque minuti. Questa fase di profusione è importante. La profusione di liquidi attraverso la coclea influisce notevolmente sull'esito di questo protocollo.Dopo la profusione, aggiungere 0,8 millilitri di MSCGM preriscaldato a 37 gradi Celsius al pozzetto contenente la coclea per portare il volume totale a un millilitro. Ripetere la procedura per ogni coclea. Usando ogni volta una siringa e un tubo nuovi.Posizionare la coclea abbondante in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e cambiare il terreno tre volte alla settimana. Qui viene mostrata la decellularizzazione e la decalcificazione di successo di una coclea di topo senza cellule iniettate. Nel complesso, l'anatomia della coclea è preservata con vuoti lasciati senza macchie di dappy.Ecco i risultati rappresentativi delle cellule di gelatina di Wharton umano coltivate con successo su un'impalcatura di coclea. Si osserva un'abbondante colorazione dappy in tutta la coclea e sulla superficie ossea esterna. Un esame più attento dei singoli turni rivela che le strutture fini della coclea sono preservate dopo la decellularizzazione e la decalcificazione e che le cellule iniettate sono attaccate e/o interagiscono con la matrice extracellulare nativa della coclea.La decellularizzazione in colture cellulari successive è stata studiata anche utilizzando la colorazione H&E. La coclea decellularizzata non conteneva nessuna delle cellule della coclea nativa ma conserva la maggior parte dell'anatomia dell'organo di Corti perché la matrice extracellulare rimane. Iniettato in cellule in coltura può essere osservato attraverso l'organo di Corti, interagendo con la matrice extracellulare decellularizzata.Una volta padroneggiata, la profusione di cellule in una coclea decellularizzata può richiedere circa 10-15 minuti se la coclea è già preparata e gli strumenti necessari sono disposti in modo appropriato. Durante il tentativo di questa procedura è importante maneggiare la coclea con cura poiché è fragile. È anche importante evitare l'introduzione di aria nella coclea poiché le bolle bloccheranno il flusso dei liquidi durante le profusioni.Questa procedura generale può essere applicata alle coclee di altre specie e può essere iniettata anche un'ampia gamma di tipi di cellule. I tempi specifici di decellularizzazione e decalcificazione probabilmente varieranno, ma i concetti di base rimarranno gli stessi. Il Dr.Peter Santi dell'Università del Minnesota ha inizialmente sviluppato la tecnica di decellularizzazione che abbiamo modificato per questo protocollo.Speriamo di rendere la nostra tecnica e la coltura cellulare su scaffold di coclea disponibili ad altri ingegneri tissutali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare, decellularizzare e decalcificare con successo le ossa temporali prima di iniettare le cellule per l'uso negli esperimenti di coltura.

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Immagini dal vivo della coclea embrionale dei mammiferi è impegnativo, perché i processi di sviluppo a portata di mano operano su un gradiente temporale nell'arco di dieci giorni. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura e quindi l'imaging embrionale dei tessuti espianto cocleare preso da un topo reporter fluorescente in cinque giorni.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

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Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

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L&#39;approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Le ciglia primarie influenzano varie vie di segnalazione. La coclea dei mammiferi è ideale per esaminare la segnalazione della polarità cellulare planare (PCP). La disfunzione delle ciglia colpisce la crescita cocleare, il patterning cellulare e l'orientamento delle cellule ciliate, le letture della PCP. Il nostro obiettivo è analizzare la segnalazione della PCP nella coclea murina attraverso l'analisi fenotipica, l'immunoistochimica e la microscopia elettronica a scansione.

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Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

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