Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno
1 gennaio 2018
L'obiettivo del presente protocollo è di dimostrare un metodo efficace per decellularize e decalcificare coclee del mouse per l'utilizzo come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo efficace per decellularizzare e decalcificare le coclee di topo per utilizzare un'impalcatura per applicazioni di ingegneria tissutale dell'orecchio interno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'udito e dell'ingegneria tissutale, come ad esempio, in che modo la coclea 3D e i vari componenti della matrice extracellulare influenzano la differenziazione delle cellule staminali? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente al ricercatore di studiare come le cellule interagiscono direttamente con la matrice extracellulare della coclea per formare l'epitelio sensoriale.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'isolamento dell'osso temporale e l'apparato di profusione cellulare possono essere difficili da visualizzare correttamente sulla base delle sole descrizioni testuali. Per iniziare questa procedura, dividere in due il cranio sul piano sagittale medio utilizzando un paio di forbici chirurgiche affilate. Quindi, rimuovi il tessuto cerebrale dal cranio.
Quindi identificare l'osso temporale attraverso la presenza delle radici del nervo uditivo e vestibolare all'interno del cranio e del condotto uditivo dall'esterno. Tagliare con cura il cranio per isolare l'osso temporale dal resto del cranio. Successivamente, inserire la pinza sottile nell'apertura del condotto uditivo di circa cinque millimetri in modo che le punte non rischino di perforare la coclea.
Rompi delicatamente l'osso della bola in modo che si fratturi. Usando una pinza fine, staccare il resto della bola dall'osso temporale esponendo il labirinto osseo della coclea. Successivamente, immergere l'osso temporale in PBS con le finestre ovali e rotonde della coclea rivolte verso l'alto.
Utilizzando un paio di pinze ultrasottili, rimuovere l'arteria stapediale che passa attraverso la staffa. Quindi inserire una punta della pinza ultrasottile attraverso l'arco della staffa attraverso il quale passa l'arteria e sollevare delicatamente la staffa verso l'alto. Successivamente, forare le finestre ovali e rotonde.
Successivamente, posizionare il tubo che è collegato a una siringa da 28,5 gauge riempita di PBS sopra la finestra ovale. Somministrare due millimetri di antibiotico-atimicotico al 10% e penicillina-streptomicina in PBS attraverso la coclea in cinque minuti per rimuovere la perilinfa. Quindi rimuovere e scartare il tessuto muscolare rimanente e i frammenti ossei.
Per la decellularizzazione, utilizzando la pipetta di trasferimento, aspirare delicatamente la coclea nella pipetta in modo che superi il bordo tagliato di pochi millimetri. Quindi, espellere la coclea nella fiala di scintillazione riempita con soluzione SDS all'1%. Far circolare due millilitri di SDS all'1% in acqua deionizzata attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.
Posizionare la fiala di scintillazione in un rotatore e lasciarla ruotare a 10 giri/min per 72 ore a temperatura ambiente. Sostituire con una soluzione fresca di SDS all'1% ogni 24 ore per un periodo di 72 ore e fare attenzione a non esporre la coclea all'aria durante la sostituzione della soluzione. Successivamente, lavare la coclea tre volte nella stessa fiala di scintillazione per 30 minuti ciascuna in acqua deionizzata.
In questa fase, la coclea dovrebbe essere decellularizzata. Per la decalcificazione, rimuovere l'acqua deionizzata rimanente dalla fiala di scintillazione, lasciandone quanto basta per mantenere la coclea sommersa. Per iniziare la decalcificazione, aggiungere cinque millilitri di EDTA al 10% e acqua deionizzata alla fiala di scintillazione contenente la coclea.
Far circolare due millilitri di EDTA al 10% in acqua deionizzata attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento. Riposizionare la fiala di scintillazione nel rotatore e lasciare che la fiala di scintillazione ruoti a 10 giri/min per 72 ore a temperatura ambiente. Cambia la soluzione EDTA al 10% ogni 24 ore per un periodo di 72 ore.
Fare attenzione quando si cambiano le soluzioni in modo che la coclea non sia esposta all'aria. Quindi sciacquare la coclea tre volte per due ore ciascuna con PBS. In questa fase, la coclea deve essere decalcificata.
Prima di infondere le cellule, iniziare incubando la coclea decellurizzata e decalcificata in un incubatore per colture cellulari al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per un minimo di un'ora. Per cocleae, aggiungi una goccia di MSCGM a ciascuna coclea per evitare che la coclea si secchi. Trasferirli in una nuova piastra a 24 pozzetti utilizzando una pipetta di trasferimento.
Orientare delicatamente la coclea utilizzando una pinza ultrasottile in modo che le finestre ovali e rotonde siano rivolte verso l'alto. Quindi, utilizzando una siringa da insulina sterile calibro 28,5 con tubo collegato, aspirare 0,2 millilitri di cellule di gelatina umana di Wharton risospese. Successivamente, posizionare il tubo sopra la finestra ovale utilizzando una pinza fine sterilizzata.
Innaffiare delicatamente e lentamente la coclea con 0,2 millilitri di cellule di gelatina umana di Wharton risospese per cinque minuti. Questa fase di profusione è importante. La profusione di liquidi attraverso la coclea influisce notevolmente sull'esito di questo protocollo.
Dopo la profusione, aggiungere 0,8 millilitri di MSCGM preriscaldato a 37 gradi Celsius al pozzetto contenente la coclea per portare il volume totale a un millilitro. Ripetere la procedura per ogni coclea. Usando ogni volta una siringa e un tubo nuovi.
Posizionare la coclea abbondante in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e cambiare il terreno tre volte alla settimana. Qui viene mostrata la decellularizzazione e la decalcificazione di successo di una coclea di topo senza cellule iniettate. Nel complesso, l'anatomia della coclea è preservata con vuoti lasciati senza macchie di dappy.
Ecco i risultati rappresentativi delle cellule di gelatina di Wharton umano coltivate con successo su un'impalcatura di coclea. Si osserva un'abbondante colorazione dappy in tutta la coclea e sulla superficie ossea esterna. Un esame più attento dei singoli turni rivela che le strutture fini della coclea sono preservate dopo la decellularizzazione e la decalcificazione e che le cellule iniettate sono attaccate e/o interagiscono con la matrice extracellulare nativa della coclea.
La decellularizzazione in colture cellulari successive è stata studiata anche utilizzando la colorazione H&E. La coclea decellularizzata non conteneva nessuna delle cellule della coclea nativa ma conserva la maggior parte dell'anatomia dell'organo di Corti perché la matrice extracellulare rimane. Iniettato in cellule in coltura può essere osservato attraverso l'organo di Corti, interagendo con la matrice extracellulare decellularizzata.
Una volta padroneggiata, la profusione di cellule in una coclea decellularizzata può richiedere circa 10-15 minuti se la coclea è già preparata e gli strumenti necessari sono disposti in modo appropriato. Durante il tentativo di questa procedura è importante maneggiare la coclea con cura poiché è fragile. È anche importante evitare l'introduzione di aria nella coclea poiché le bolle bloccheranno il flusso dei liquidi durante le profusioni.
Questa procedura generale può essere applicata alle coclee di altre specie e può essere iniettata anche un'ampia gamma di tipi di cellule. I tempi specifici di decellularizzazione e decalcificazione probabilmente varieranno, ma i concetti di base rimarranno gli stessi. Il Dr.Peter Santi dell'Università del Minnesota ha inizialmente sviluppato la tecnica di decellularizzazione che abbiamo modificato per questo protocollo.
Speriamo di rendere la nostra tecnica e la coltura cellulare su scaffold di coclea disponibili ad altri ingegneri tissutali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare, decellularizzare e decalcificare con successo le ossa temporali prima di iniettare le cellule per l'uso negli esperimenti di coltura.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra un metodo efficace per decellularizzare e decalcificare i coclei di topo da utilizzare come impalcature in applicazioni di ingegneria tissutale. La tecnica consente ai ricercatori di studiare l'interazione tra le cellule e la matrice extracellulare cocleare, fondamentale per comprendere la formazione dell'epitelio sensoriale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria dei tessuti
- Ricerca uditiva
- Interazioni cellulari
Sfondo
- La decellularizzazione e la decalcificazione sono essenziali per creare impalcature.
- Comprendere la struttura del coclea è fondamentale per la ricerca sull'orecchio interno.
- La differenziazione delle cellule staminali è influenzata dalla matrice extracellulare.
- I metodi visivi migliorano la comprensione delle procedure complesse.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per la preparazione di scaffold cocleari.
- Facilitare la ricerca sulle interazioni cellulari cocleari.
- Far progredire le conoscenze nei campi dell'udito e dell'ingegneria tissutale.
Metodi Utilizzati
- Isolamento dell'osso temporale dal cranio.
- Decellularizzazione delle coclee.
- Processo di decalcificazione per la preparazione del scaffold.
- Dimostrazione visiva della procedura per maggiore chiarezza.
Risultati principali
- Decellularizzazione e decalcificazione con successo di coclee di topo.
- Migliore comprensione delle interazioni tra cellule e matrice extracellulare.
- Metodi migliorati per lo studio della formazione dell'epitelio sensoriale.
- Gli ausili visivi migliorano significativamente la comprensione delle procedure.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce uno strumento prezioso per la ricerca nell'orecchio interno.
- Apre nuove prospettive per lo studio del comportamento delle cellule staminali all'interno di impalcature cocleari.
- Le dimostrazioni visive sono fondamentali per procedure biologiche complesse.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente ai team di ricerca e sviluppo della biotecnologia farmaceutica di generare impalcature cocleari fisiologicamente rilevanti per lo studio delle interazioni tra cellule staminali e la matrice extracellulare nativa, supportando la validazione degli obiettivi nella medicina rigenerativa dell'udito. Preservando l'architettura della matrice extracellulare ed eliminando al contempo i componenti cellulari, il metodo fornisce un sistema definito per ridurre i rischi associati a ipotesi meccanicistiche riguardo al comportamento cellulare mediato dalla matrice nell'ingegneria tissutale dell'orecchio interno. L'approccio favorisce lo sviluppo di modelli preclinici per terapie contro la perdita dell'udito, consentendo una valutazione controllata della dinamica cellula-impalcatura in un sistema tridimensionale rilevante per la patologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Analizza ipotesi terapeutiche riguardo l'influenza della matrice extracellulare sulla differenziazione delle cellule staminali e sulla formazione dell'epitelio sensoriale.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico degli obiettivi isolando gli effetti specifici della matrice dalle variabili cellulari in un sistema di impalcatura controllato.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici standardizzati e riproducibili per la valutazione quantitativa dell'invasione cellulare, della proliferazione e dell'interazione con la matrice.
- Valore operativo: Favorisce la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma grazie a risultati di descellularizzazione e decalcificazione costanti su più coclee.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Stabilisce una continuità del sistema rilevante per la malattia, dall'individuazione alla validazione preclinica, mantenendo l'architettura nativa del coclea.
- Valore operativo: Favorisce decisioni di avanzamento con valutazione del rischio consentendo l'osservazione longitudinale delle interazioni tra cellule e scaffold per periodi di coltura di 30 giorni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso della scoperta fornendo impalcature della matrice extracellulare dopo l'isolamento, consentendo la verifica di ipotesi nelle fasi di identificazione dei composti promettenti prima dei test preclinici di efficacia.
- Biologia della Scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la riduzione dei rischi meccanicistici permettendo lo studio diretto delle interazioni tra cellule e matrice extracellulare senza interferenze dovute a detriti cellulari.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso una preparazione standardizzata del scaffold che preserva l'integrità strutturale per una valutazione affidabile di composti o cellule.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti tramite la profondità di invasione cellulare, i tassi di proliferazione e i modelli di interazione con la matrice osservabili mediante colorazione e imaging.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica mantenendo la struttura del dotto cocleare, consentendo l'estrapolazione ad ambienti simili a quelli in vivo.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma di scaffold riutilizzabile su diversi tipi cellulari e specie, riducendo gli sforzi ridondanti di isolamento nei programmi di ingegneria dei tessuti udittivi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei comportamenti cellulari mediati dalla matrice extracellulare.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante protocolli definiti di descellularizzazione (rotazione con SDS per 72 ore) e decalcificazione (rotazione con EDTA per 72 ore).
- Valore strategico: Decisioni più informate su prosegui/non prosegui, consentendo una valutazione precoce delle risposte cellulari dipendenti dalla matrice e riducendo i rischi biologici in fase avanzata nei programmi di rigenerazione uditiva.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta in base al rischio di candidati basati su cellule staminali o modulatori della matrice, in base a letture funzionali ottenute su scaffold.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza specifica nell'isolamento microchirurgico dell'osso temporale e nelle tecniche di perfusione cellulare sterili.
- Le attrezzature necessarie includono pinze ultrasottili, pipette di trasferimento, dispositivi rotatori e sistemi di perfusione sterili con siringa.
- La standardizzazione tra gruppi diversi richiede l'adesione a programmi prestabiliti per il ricambio delle soluzioni e l'evitare l'esposizione all'aria durante la decellularizzazione e la decalcificazione.
- Le considerazioni per l'adattamento includono aggiustamenti dei tempi specifici per specie e la validazione dell'integrità del supporto (scaffold) per tipi cellulari alternativi rispetto alle cellule staminali mesenchimali derivate dalla gelatina di Wharton.
- Le limitazioni pratiche comprendono la fragilità del cocleo, che richiede un'accurata manipolazione al fine di prevenire danni strutturali durante l'isolamento e la perfusione.
