Sintesi e valutazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio

L'obiettivo generale della sintesi e della purificazione è quello di produrre in modo relativamente semplice un analogo del rutenio 360 utilizzato nei saggi di captazione del calcio mitocondriale che sia 10 volte più efficace del rutenio 360 disponibile in commercio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del calcio mitocondriale fornendo un inibitore puro dell'assorbimento del calcio mitocondriale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il prodotto finale è molto potente e puro.

Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché la purificazione richiede tempo e pazienza. A dimostrare la produttrice sarà Sarah Nathan, una studentessa laureata del mio laboratorio. Inizia questa procedura con la sintesi della pentaammina cloro-rutenio dicloruro come descritto nel protocollo di testo.

Sciogliere 100 milligrammi di pentaammina clororutenio dicloruro in 50 millilitri di soluzione di idrossido di ammonio molare in un pallone a fondo tondo da 200 millilitri. Tappare il pallone con un tappo di vetro e scaldare la miscela di reazione a 75 gradi Celsius per sei ore. Il riscaldamento di un recipiente sigillato provoca un accumulo di pressione.

Assicurarsi che il tappo del vetro sia allentato per consentire il rilascio della pressione in eccesso. Dopo sei ore togliere la miscela di reazione dal fuoco. E mescolare a temperatura ambiente per quattro giorni per ottenere una soluzione verde scuro.

Per purificare l'octo-ammina trans-diaqua mu-oxo dirutenio pentacloruro risultante mediante cromatografia a scambio cationico, sospendere prima cinque grammi di resina a scambio cationico a rete in 10 millilitri di HCL molare da 0,1 molari in un becher da 25 millilitri. Caricare questo liquame in una colonna da 10 millilitri fissata con un serbatoio di solvente da 50 millilitri. Lavare la resina con circa 20-30 millilitri di HCL molare 0,1 fino a quando l'eluizione è incolore.

Successivamente, aggiungere HCL concentrato alla soluzione di reazione verde precedentemente isolata per regolare il PH a due, a quel punto il colore della soluzione cambia in marrone. Caricare questa soluzione acidificata sulla colonna di resina a scambio cationico pipettandola delicatamente sopra la resina. Lasciare scolare completamente l'eluizione e continuare a caricare la soluzione.

Ripetere questo processo fino a quando l'intera soluzione non è stata aggiunta. La parte superiore della resina sarà marrone scuro o nera. La resina diminuirà leggermente di volume.

Successivamente, coprire la parte superiore della resina con perle di vetro per evitare che la resina venga disturbata quando vengono aggiunte nuove soluzioni. Eluire la colonna con 20 millilitri di HCL molare. Quindi eluire la colonna con 50 millilitri di una concentrazione aumentata di HCL di 1,5 molare.

Una soluzione gialla inizierà a fuoriuscire dalla colonna. Quindi aumentare la concentrazione di HCL a due molari e continuare a eluire con 150-200 millilitri. L'eluente inizierà come un giallo molto pallido e passerà a un giallo brillante.

Attendere che l'eluente proveniente dalla colonna sia di nuovo molto pallido. La pazienza è fondamentale in questa fase. L'eluente deve essere molto pallido.

Aumentare ulteriormente la concentrazione di HCL a 2,5 molari. Raccogliere l'eluente sotto forma di frazioni in provette. Infine, aumentare la concentrazione a tre molari di HCL.

Il prodotto eluirà dalla colonna sotto forma di soluzione verde-marrone. Una frazione rosso-marrone può anche iniziare a staccarsi dalla colonna. Queste frazioni sono impurità brune del rutenio e non devono essere raggruppate con le frazioni verde-brune.

Per testare tutte le frazioni mediante spettroscopia UV-Vis, aggiungere 100 microlitri di una data frazione in due millilitri di ammoniaca a tre molari. Quindi analizzare la miscela mediante spettroscopia UV-Vis. Le frazioni contenenti prodotto puro avranno un'ampia banda di assorbanza a 360 nanometri e un'assorbanza meno intensa a 600 nanometri.

L'assorbanza a 480 nanometri è indicativa del marrone rutenio e l'assorbanza a 533 nanometri rappresenta le impurità del rosso rutenio. Altre impurità si osservano con assorbanza inferiore a 300 nanometri. Raggruppare le frazioni contenenti prodotto puro ed evaporare la soluzione fino alla secchezza mediante evaporazione rotativa prima dell'analisi del campione allo stato solido mediante spettroscopia IR.

Procedere alla valutazione dell'inibizione dell'assorbimento mitocondriale di calcio mediante spettroscopia fluorescente come dettagliato nel protocollo di testo. Gli spettri UV-Vis dell'octo-ammina trans-diaqua purificata mu-oxo dirutenio pentacloruro sono caratterizzati da assorbimenti maggiori e minori rispettivamente a 360 nanometri e 600 nanometri. Al contrario, una miscela impura mostra bande di assorbimento a 533 nanometri dalle impurità del rosso rutenio e a 275-300 nanometri dal materiale di partenza.

La caratterizzazione dello stato solido mediante spettroscopia infrarossa ha gli allungamenti attesi dalle ammine. Così come il rutenio ossigeno rutenio allungarsi a 850 centimetri inversi. Le cellule HeLa permeabalizzate trattate con un colorante fluorescente sensibile al calcio e l'octoammina trans-diaqua mu-oxo dirutenio pentacloruro mostrano inibizione dell'assorbimento del calcio nei mitocondri.

Durante il tentativo di eseguire la procedura è importante ricordare di consentire alle frazioni di eluire completamente. La pazienza darà un prodotto puro. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare, purificare e caratterizzare questo potente analogo del rutenio 360.

I livelli di calcio mitocondriale regolano un'ampia gamma di processi intercellulari, tra cui la bioenergetica e la morte cellulare controllata. L'inibitore prodotto da questo metodo può essere applicato in studi per comprendere il ruolo della biologia del calcio mitocondriale nella mediazione di altri processi biologici. Non dimenticare che lavorare con acidi e basi concentrati è corrosivo e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare DPI adeguati.