Name: Sintesi e valutazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Scopri la sintesi e la purificazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio. Questo metodo produce un analogo dieci volte più efficace di quelli commerciali per studi di biologia mitocondriale.

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Questa ricerca è stata sostenuta dalla Cornell University. Questo lavoro fatto uso del Cornell Center per servizi in comune ricerca materiali, che sono supportati tramite il programma NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. riconosce il sostegno di un NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) e Dr. Dave Holowka per assistenza con gli esperimenti di calcio. Opinioni, conclusioni e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori (s) e non riflettono necessariamente le opinioni di National Science Foundation.

Nota: acidi concentrati e basi sono utilizzati in questa sintesi. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si esegue la reazione compreso l'uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (PPE) tra cui occhiali, guanti, camice da laboratorio, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse.
 1. preparazione di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>sintesi di Cl [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 12 <ol><li>dissolvere 1.00 g di RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru di peso, 4,1 mmol) in 5 mL di H 2 O. Cool la soluzione marrone scura a 0 ° C in un bagno di ghiaccio. Aggiungere mL 11 (0,23 mol) di soluzione di idrato di idrazina 80% in modo goccia a goccia. La reazione iniziale sarà vigorosa con il gas di evoluzione, risultante in una soluzione marrone. La soluzione risultante si mova augellin a temperatura ambiente per 16 h; la soluzione finale sarà rosso scuro 
		Attenzione: L'idrazina è acutamente tossici e cancerogeni. Inoltre, anidra forme di questo reagente sono esplosive. Come sempre, uso appropriati cappe PPE e fumi durante la manipolazione. Non concentrare queste soluzioni per secchezza.</li>
		<li>Per questa soluzione, aggiungere circa 5-10 mL di HCl concentrato per aggiustare il pH a 2. A questo punto, la soluzione sarà giallo-marrone a colori.</li>
		<li>Calore questa soluzione a 105 ° C continuando a mescolare per 1-2 h. Un solido giallo precipita dalla soluzione. Quando non più visibilmente precipitare forme, togliere dal fuoco.</li>
		<li>Permettere la miscela di reazione per raffreddare a temperatura ambiente e quindi posto in un bagno di ghiaccio 0 ° C per 10 min. raccogliere il solido giallo di filtrazione sotto vuoto e lavaggio con 5 mL di etanolo ed etere etilico.</li>
		<li>Sciogliere completamente il prodotto grezzo in 15-25 mL di acqua calda. Chill 10 mL di una soluzione di HCl concentrata in una beuta per filtrazione collocandolo in un bagno di ghiaccio. Filtrare la soluzione gialla nella soluzione di HCl refrigerata per indurre la precipitazione di un solido puro giallo pallido. Questo precipitato di filtrare e lavare con 5 mL ciascuno di 0,5 M HCl, etanolo ed etere.</li>
		<li>Caratterizzare il composto utilizzando la spettroscopia IR. Verificare purezza tramite l'identificazione delle frequenze d'allungamento a 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 e cm 801 -1. Una comune impurità minori a 2069 cm -1 è assegnata a [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.</li>
	</ol></li> <li>Sintesi di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>sciogliere 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 in 50 mL di 1m NH 4 OH in un recipiente a pressione a fondo rotondo parete pesante 200 mL. Senza bloccare il recipiente con un tappo di cap e riscaldare la miscela di reazione a 75 ° C per 6 h. Togliere dal fuoco e mescolare a temperatura ambiente per 4 giorni per produrre una soluzione verde scura. 
		Attenzione! Riscaldamento un risultati di vaso sigillato in un accumulo di pressione. Assicurarsi di utilizzare appropriato cristalleria di pressione-cassetta di sicurezza. Per questa reazione, lo scopo di sigillare la nave è quello di minimizzare la perdita di gassosa NH 3. Pertanto, inserire il tappo senza stringere per consentire per il rilascio della pressione in eccesso.</li>
	</ol></li> <li>Purificazione mediante cromatografia a scambio cationico <ol><li>In un becher da 25 mL, sospendere la resina a scambio cationico 5g (ad es., Dowex 50WX2 200-400 mesh (forma H +) in 10 mL di 0.1 M HCl.</li>
		<li>Caricare questo impasto in una colonna di 10 mL (10 mm di diametro, altezza 15 cm) munito di un serbatoio solvente 50 mL. Lavare la resina con circa 20-30 mL di 0.1 M HCl, finché l'eluato è incolore.</li>
		Soluzione di reazione di <li>ritorno al verde isolata al punto 1.2.1. Per questa soluzione, aggiungere HCl concentrato per regolare il pH a 2, al punto che il colore della soluzione diventa marrone.</li>
		<li>Caricare questa soluzione acidificata alla colonna di resina di scambio cationico preparata al punto 1.3.2 pipettando delicatamente sopra la resina. Lasciate che l'eluato completamente scarico e continuare a caricare la soluzione. Ripetere questo processo fino a quando l'intera soluzione è stato aggiunto. Parte superiore della resina sarà marrone scuro/nero. La resina diminuisce di volume leggermente.</li>
		<li>Perle di vetro di uso per coprire la parte superiore della resina. Questi impedirà la resina di essere disturbati quando vengono aggiunte nuove soluzioni.</li>
		<li>Eluire la colonna con 20 mL di 1 M HCl.</li>
		<li>Eluire la colonna con una maggiore concentrazione di HCl di 1,5 M (&#8776; 50 mL). Una soluzione gialla inizierà a venire fuori la colonna. Aumentare la concentrazione di HCl 2 m e continuare ad eluizione finché l'eluato è incolore o giallo-verde molto pallido. Un volume totale di 150-200 mL sarà richiesto per questo processo.</li>
		<li>Aumentare la concentrazione di HCl a 2,5 M (20-50 mL). Raccogliere l'eluato come frazioni in provette. Aumentare a 3 M HCl. Il prodotto sarà eluire dalla colonna come soluzione di verde-marrone. Una frazione di rosso-marrone può anche cominciare a venire fuori la colonna. Come queste frazioni sono le impurità ossidato rutenio rosso, non fare piscina con le frazioni di verde-marrone.</li>
	</ol></li> <li>Caratterizzazione e la verifica della purezza di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>tutte le frazioni da testare Passo 1.3.8. dalla spettroscopia UV-vis. Per eseguire questa operazione, aggiungere 100 µ l di una determinata frazione in 2 mL di 3 M NH3 e analizzare mediante spettroscopia UV-vis. Le frazioni contenenti il prodotto puro avrà una band di grande capacità di assorbimento a 360 nm e una meno intensa assorbanza a 600 nm. Assorbanza a 533 o 480 nm è indicativo di ossidato rutenio rosso e le impurità del rutenio rosso, rispettivamente.</li>
		<li>Piscina frazioni contenenti il prodotto puro ed evaporare la soluzione ad essiccazione per evaporazione rotante. Il prodotto sarà isolato come un solido verde-marrone. Rendimenti sono tipicamente dell'ordine di 5-15 mg (10-20% di rendimento). Monocristalli, adatti per diffrazione dei raggi x, possono essere ottenute dalla diffusione del vapore dell'etanolo in soluzioni acquose del composto.</li>
		<li>Per verificare la purezza, analizzare il composto dalla spettroscopia UV-vis in una soluzione di soluzione tampone fosfato pH 7.4 (PBS). Purezza può essere valutata prendendo il rapporto di intensità di 360 nm e 600 nm cime. Questo rapporto è 31 per un composto puro. Per i composti impuri, il rapporto sarà più piccolo.</li>
		<li>Analizzare il campione nella a stato solido di spettroscopia IR. Bande di diagnostiche sono al 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 e 815 cm -1. Bande di impurità comuni sono visti al 1762 cm -1 e 1400 cm -1, caratteristico di NH 4 cl. rutenio rosso può essere identificato da bande a 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 e 800 cm -1.</li>
	</ol></li> <li>Valutazione di inibizione di assorbimento del calcio mitocondriale dalla spettroscopia di fluorescenza attenzione! Le procedure seguenti utilizzano cellule di mammiferi. Lavoro deve essere svolto in cappe a flusso laminare appropriati che sono certificate per sicurezza biologica di livello 2 (BSL2) ricerca. 
	&#8203; Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 verrà essere denominato come [Ru] in questa sezione <ol><li>Make tamponata contenenti glucosio soluzione salina (BGSS) il supporto di analisi. BGSS è una soluzione composta da 110 mM KCl, 1mm KH 2 PO 4, 1mm MgCl 2, 20mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), succinato del sodio di 5 mM, 30 µM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA). Combinare tutto tranne l'EGTA, regolare il pH a 7,4. Aggiungere EGTA e regolare il pH a 7,4. Per 50 mL di media saggio aggiungere 0,5 mL di glucosio 1 mg/mL.</li>
		<li>Cellule HeLa di cultura in 500 cm 2 piastre Petri Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) in un incubatore con 5% CO 2 al 37 cellule di C. amplificare HeLa ° che crescono in un 100mm di Petri da semina li in una capsula di Petri 2 500 cm. Il volume totale media nel grande piatto è 115 mL. Ogni piatto grande resa di circa 18 milioni di cellule, abbastanza per due esperimenti di spettroscopia di fluorescenza.
		<ol><li>Crescere le cellule fino a quando raggiungono il 90-95% confluenza. Rimuovere i supporti e lavare le cellule con 15 mL di PBS pH 7.4. Aggiungere 15 mL di 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS e incubare per 10 minuti staccare le cellule. Trasferire le cellule a 14 mL fondo falcon tubi tondi</li></ol></li> <li>contare le celle utilizzando trypan blu e un emocitometro con un microscopio invertito e calcolare il numero totale delle cellule ed il volume dei mezzi necessari per raggiungere 7,5 milioni di cellule per 1,8 mL di volume del mezzo. Centrifugare le cellule per 10 min a 5310 × g. decantare il supernatante e aggiungere il volume calcolato di BGSS. Risospendere delicatamente le cellule.
		<ol><li>Per questo test, preparare soluzioni di riserva di digitonina 40mm in dimetilsolfossido (DMSO), 1 mM calcio verde-5N in H 2 O e 10 mM CaCl 2 in soluzioni di riserva di H 2 O. [Ru], preparati in acqua pura, può variare da 1-3 mM. 
			&#8203; Nota: calcio verde-5N è sensibile alla luce. Conservare al buio e ridurre al minimo l'esposizione alla luce.</li>
		</ol></li> <li>Setup il fluorimetro per eccitare a 506 nm e leggere l'emissione a 532 nm con il cuvetta-titolare controllato a 37 ° C. Prepare una cuvetta acrilico con ancoretta o ruota, 1,8 mL di sospensione cellulare da 1.5.2 sopra, 1,8 µ l di soluzione di digitonina, 3.6 & #181; L calcio verde-5N (soluzione) e 9 µ l [Ru] (per la soluzione 1 mM, concentrazione finale di 5 µM). Incubare le cellule per 15 min nel fluorimetro.
		<ol><li>Leggere i dati come rapporto di eccitazione/emissione invece l'assorbimento crudo. Questa pratica riduce al minimo gli errori associati con le fluttuazioni dell'intensità della sorgente luminosa.</li>
			<li>Svolgere analisi del prima campione in assenza di [Ru] per misurare l'effetto dell'aggiunta di CaCl 2 sulla risposta delle cellule.</li>
			<li>Analisi Begin il fluorimetro con le impostazioni descritte 1.5.4. Attendere circa 2 minuti per stabilire una base di emissione stabile e quindi aggiungere 1,8 µ l di CaCl 2 (concentrazione finale di 10 µM). L'intensità di emissione aumenterà immediatamente dopo l'aggiunta di CaCl 2 e quindi decadrà nel corso dei minuti come gli ioni di calcio entra i mitocondri. Attendere che il decadimento ha terminato (&#8776; 5 min). Aggiungere i boli supplementare del calcio per determinare la risposta di assorbimento del calcio mitocondriale delle cellule non trattate con [Ru].</li>
		</ol></li> <li>In un'altra provetta contenente 5 µM [Ru], ripetere l'esperimento, come descritto in precedenza in 1.5.4.3. In presenza dell'inibitore, intensità di emissione farà aumentare, ma non decadere. Questa osservazione indica bloccato l'assorbimento del calcio mitocondriale.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enjoy+the+trip%3A+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li>
<li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li>
<li>Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li>
<li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244437951_The_component_of_ruthenium_red_responsible_for_inhibition_of_mitochondrial_calcium_ion_transport_Spectra_electrochemistry_and_aquation_kinetics_Crystal_structure_of_m-O-HCO2NH34Ru2Cl_3">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2%2B+Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360%2C+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li>
<li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v67-220#.WW5AYYjyvIU">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25631032">Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Il calcio mitocondriale assorbimento inibitore [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 può essere sintetizzato da [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un ruthenium(III) ben noto a partire del materiale, come descritto in questa procedura. La sintesi di [Ru (NH3)5Cl] Cl2 è realizzata prontamente con poca difficoltà. Dopo agitazione RuCl3 per 16 h in idrazina idrato, il pH della soluzion...

Calcio mitocondriale è un regolatore chiave per un certo numero di processi che sono fondamentali per la funzione normale delle cellule, tra cui l'apoptosi e la produzione di energia. 1 , 2 , 3 il calcio mitocondriale uniporter (MCU), una proteina del trasportatore dello ione che si trova sulla membrana mitocondriale interna, regola l'afflusso degli ioni di calcio nei mitocondri. 4 , 5 , 6 inibitori chimici della MCU sono strumenti preziosi per proseguire gli sforzi per studiare la funzione e i ruoli cellulari di questa proteina di trasporto e di calcio mitocondriale. Il composto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, è uno degli inibitori selettivi noti soli per la MCU con un valore did K riferito di 24 µM.7 ,8,9,10 , questo complesso è una comune impurità trovata in formulazioni commerciali del rutenio rosso (RuRed), un triruthenium di-µ-oxo "a ponte" hexacation della formula [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, che è stato utilizzato anche come un inibitore di assorbimento del calcio. Anche se Ru360 è disponibile in commercio, è molto costoso. Inoltre, la sintesi e l'isolamento di Ru360 è sfidato da purificazione difficili procedure e metodi di caratterizzazione ambigua.
Recentemente abbiamo segnalato procedure alternative per accedere un Ru360 analogici, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 questo composto inibisce la MCU con alta affinità, simile a Ru360. In questo protocollo, descriveremo la nostra sintesi più efficace di questo composto, che comincia da [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificazione del prodotto utilizzando la resina a scambio cationico fortemente acido è dettagliato, insieme a trabocchetti comuni per questa procedura. Inoltre presentiamo metodi di caratterizzazione e valutazione della purezza del composto e delineare un approccio semplice per testare la sua efficacia nel bloccare l'assorbimento di calcio mitocondriale.

<table><tbody><tr><td>Tricloruro di rutenio idrato</td><td>Pressione Chimico</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico concentrato</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio concentrato</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Green 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>Succinato di sodio</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 Pallone a fondo tondo</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>Tappo in vetro</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>Colonna in vetro da 10 mm x 15 cm con serbatoi</td><td>Personalizzato - simile alle colonne Chemglass</td><td>Simile a CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tubi Falcon a fondo tondo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm2 piastre di</td><td>Petri Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ematocitometro</td><td>Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette acriliche</td><td>VWR&nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro UV-Vis</td><td>Agilent Modello Cary 8454&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro</td><td>SLM Modello 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro IR</td><td>Bruker Hyprion FTIR con attacco</td><td></td><td></td>ATR</tr><tr><td>Centrifuga</td><td>ALC Modello PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a luce invertita</td><td>VWR&nbsp;</td><td>89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

sintesi e valutazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Dettagliamo la sintesi e la purificazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]+ 5. La sintesi ottimizzata di questo composto ha inizio dalla [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1m NH4OH in un contenitore chiuso, ottenendo una soluzione verde. Purificazione viene eseguita mediante cromatografia a scambio cationico. Questo composto è caratterizzato e verificato per essere puro mediante spettroscopia UV-vis e IR. Le proprietà inibitorie di assorbimento di calcio mitocondriale sono valutate in cellule HeLa permeabilized dalla spettroscopia di fluorescenza.

Questo metodo descrive una sintesi di calcio mitocondriale assorbimento inibitore [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partire da [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un materiale di partenza ben noto ruthenium(III). [Ru (NH3)5Cl] CL2 è caratterizzato dalla spettroscopia IR, con modi vibrazionali a 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1</s...

Un protocollo per la sintesi, purificazione e caratterizzazione di un inibitore dell'assorbimento del calcio mitocondriale basato sul rutenio è presentato. Una procedura per valutare la sua efficacia in cellule di mammifero permeabilized è dimostrata.

Sintesi e valutazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

L'obiettivo generale della sintesi e della purificazione è quello di produrre in modo relativamente semplice un analogo del rutenio 360 utilizzato nei saggi di captazione del calcio mitocondriale che sia 10 volte più efficace del rutenio 360 disponibile in commercio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del calcio mitocondriale fornendo un inibitore puro dell'assorbimento del calcio mitocondriale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il prodotto finale è molto potente e puro.Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché la purificazione richiede tempo e pazienza. A dimostrare la produttrice sarà Sarah Nathan, una studentessa laureata del mio laboratorio. Inizia questa procedura con la sintesi della pentaammina cloro-rutenio dicloruro come descritto nel protocollo di testo.Sciogliere 100 milligrammi di pentaammina clororutenio dicloruro in 50 millilitri di soluzione di idrossido di ammonio molare in un pallone a fondo tondo da 200 millilitri. Tappare il pallone con un tappo di vetro e scaldare la miscela di reazione a 75 gradi Celsius per sei ore. Il riscaldamento di un recipiente sigillato provoc

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Chimica

Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l'indicazione espressa nei mitocondri.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri...

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Questo video descrive un test basato su un lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale in mitocondri isolati. Il test analizza il segnale di fluorescenza di un colorante fluorescente sensibile al calcio per studiare la cinetica dell'assorbimento mitocondriale del calcio e del sovraccarico di calcio.

Saggio di captazione del calcio mitocondriale: un metodo basato su lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio nei mitocondri isolati

Questo video descrive un test basato sull'imaging al microscopio confocale per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale nelle cellule in coltura. Il test utilizza il colorante fluorescente sensibile al calcio Rhod-2/AM per misurare il calcio mitocondriale in cellule coltivate permeabilizzate.

Saggio dell'afflusso di calcio per misurare l'assorbimento mitocondriale di calcio nelle cellule in coltura

Complessi di Rutenio fosfina sono ampiamente utilizzati per le reazioni catalitiche omogenee quali idrogenazioni. È riportata la sintesi di una serie di nuovi complessi di rutenio tridentate recanti il N -triphos ligando N (CH 2 PPh 2) 3. Inoltre, la reazione stechiometrica di un complesso diidruro RU N -triphos con acido levulinico è descritto.

La sintesi, caratterizzazione e reattività di una serie di rutenio<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Complessi

I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ Ψm) di sequestrare il calcio (Ca 2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico 2 + Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +- innescato mitocondriale gonfiore di mitocondri isolati di SH-SY5Y cellule passo-passo.

Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell'afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca2 + importazione analisi usando il Ca2 + sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca2 + colorante Rhod-2/AM.

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca2+ in astrociti e neuroni.

Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

L'adattamento metabolico è fondamentale per le cellule T in quanto detta differenziazione, persistenza e citotossicità. Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per il monitoraggio della respirazione mitocondriale in cellule T primarie umane differenziate ex vivo con citochine.

Monitoraggio in tempo reale della respirazione mitocondriale in cellule T primarie umane graduate differenziate con citochine

Presentiamo un metodo non invasivo e in tempo reale per monitorare la salute mitocondriale utilizzando la Spettroscopia Raman a Risonanza (RRS). Abbiamo utilizzato RRS per quantificare gli stati redox mitocondriali e sviluppato una metrica per la salute mitocondriale, il rapporto ridotto mitocondriale Resonance Raman (3RMR), che mostra una risposta più rapida ai cambiamenti di ossigenazione rispetto agli analiti ematici ematici e gasses.

Valutazione in tempo reale e non invasiva della funzione mitocondriale tramite spettroscopia Raman a risonanza

Scopri la sintesi e la purificazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio. Questo metodo produce un analogo dieci volte più efficace di quelli commerciali per studi di biologia mitocondriale.

Sintesi e valutazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio

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