DNA che macchia il metodo basato su Formazan precipitazione indotta dall'esposizione alla luce blu
28 gennaio 2018
Questo metodo permette la colorazione selettiva e quantificazione del DNA in gel immergendo il gel in un SYBR Green mi / Nitro blu di tetrazolio soluzione e poi esporla alla luce solare o una fonte di luce blu. Questo produce un precipitato visibile e quasi non richiede un equipaggiamento, che lo rende ideale per uso sul campo.
Il protocollo di colorazione del DNA prevede tre fasi generali. Il primo consiste nel mettere il gel in una soluzione di SYBR Green I e nitro blue tetrazolium, noto anche come NBT. Il gel viene quindi mescolato per 25 minuti se si tratta di un gel di poliacrilammide e un'ora se si tratta di un gel di agarosio.
L'ultimo passaggio consiste nell'esporre il gel a una fonte di luce blu come LED blu o luce solare. Durante questa fase compaiono alcune bande precipitate. Queste bande hanno una correlazione diretta con la concentrazione di DNA e il gel può quindi essere digitalizzato in uno scanner da ufficio per quantificare il DNA.
Per il gel di poliacrilammide viene preparato un gel di poliacrilammide non denaturante. Il gel viene quindi caricato con i campioni e inizia il processo di elettroforesi. SYBR Green I è stato diluito a 1,2X e le soluzioni NBT da 20 millimolari sono ora pronte.
Il gel viene messo in un contenitore di plastica e vengono aggiunti 16,75 mil di SYBR Green I diluito e 325 mil di NBT a 20 millimolari. Quindi il contenitore viene coperto con Parafilm e foglio di alluminio e mescolato a 60 giri/min per 25 minuti. Infine, il foglio di alluminio e un Parafilm vengono rimossi e il gel viene esposto alla luce solare o a una fonte di luce blu.
Per la quantificazione delle bande e le curve di calibrazione, il gel viene inserito in uno scanner da ufficio, quindi l'immagine viene analizzata utilizzando un software di analisi delle immagini. Infine, viene effettuato un innesto di segnale normalizzato rispetto alla concentrazione. Viene prodotto un gel di agarosio.
I pozzetti sono caricati con un plasmide che ha resistenza all'ampicillina e il gel viene tagliato in due pezzi, ognuno dei quali è colorato con una colorazione diversa. Quindi la banda plasmidica viene estratta e trasformata tramite trasformazione chimica in cellule competenti con terreni che contengono ampicillina. Un gel di agarosio all'1% viene preparato in tampone TAE 1X e caricato con quattro microlitri di plasmide a circa 100 nanogrammi per microlitro.
Il gel nella camera di elettroforesi viene quindi fatto funzionare a 100 volt per un'ora. Metà del gel è colorato con il metodo SYBR Green I e NBT e l'altra metà con il metodo SYBR Green I UV. Per il gel di agarosio, il metodo SYBR Green I NBT viene eseguito utilizzando SBYR Green I a una concentrazione di 1,2X e NBT a 2 millimolari.
Il gel viene messo in un contenitore di plastica e il volume della soluzione viene ridimensionato per coprire il gel e il tempo di agitazione viene esteso a un'ora. Per i gel di agarosio, il metodo SYBR Green I comunemente usato viene eseguito coprendo il gel con la soluzione 1X SYBR Green I e mescolando per un'ora. Quindi il gel viene esposto a un transilluminatore UV per la visualizzazione della banda per due minuti.
Una volta colorato il gel, la banda plasmidica viene tagliata con un bisturi e il plasmide estratto con un kit di estrazione commerciale. Il DNA è normalizzato a 9,1 nanogrammi per microlitro per trasformare i batteri Escherichia coli XL 10 chimici competenti. Infine, si contano le colonie.
Vengono calcolate le unità formanti colonie. Il risultato viene innestato e i risultati ottenuti da SYBR Green I NBT e SYBR Green I UV vengono confrontati. Un precipitato viola di formazan appare dove si trova il DNA.
Nell'esperimento è stata caricata una scala di DNA per creare una curva di calibrazione con un limite di rilevamento di 192 picogrammi a 1.500 coppie di basi. L'uso di gel di agarosio consente il prelievo del campione utilizzando i kit disponibili in commercio e non interferisce con l'estrazione. Un certo recupero utilizzando questo metodo con LED blu si traduce in una qualità migliore rispetto al SYBR Green I che utilizza il transilluminatore.
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Panoramica
Questo metodo consente la colorazione selettiva e la quantificazione del DNA in gel utilizzando una soluzione di SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium. Il processo richiede un'attrezzatura minima, rendendolo adatto ad applicazioni in campo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia molecolare
- Chimica biologica
- Applicazioni sul campo
Sfondo
- La quantificazione del DNA è essenziale per vari studi biologici.
- I metodi tradizionali richiedono spesso apparecchiature complesse.
- Questo metodo semplifica notevolmente il processo.
- Utilizza reagenti comuni per ottenere risultati efficaci.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo semplice per la colorazione del DNA.
- Permettere la quantificazione del DNA in diversi tipi di gel.
- Facilitare il lavoro sul campo con requisiti minimi di attrezzatura.
Metodi Utilizzati
- Imbibizione del gel in una soluzione di SYBR Green I e NBT.
- Agitazione del gel per 25 minuti (poliacrilamide) o 1 ora (agarosio).
- Esposizione del gel a una sorgente di luce blu o alla luce solare.
- Digitalizzazione del gel per la quantificazione del DNA.
Risultati principali
- Le bande di precipitato visibili corrispondono alla concentrazione di DNA.
- Colorazione efficace ottenuta con attrezzature minime.
- I risultati possono essere quantificati utilizzando scanner da ufficio standard.
- Il metodo dimostra affidabilità in condizioni di campo.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio pratico alla quantificazione del DNA.
- È adatto a diversi tipi di gel e ad applicazioni in campo.
- Migliora l'accessibilità per i ricercatori in zone remote.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo di colorazione del DNA consente la visualizzazione diretta e la quantificazione degli acidi nucleici senza l'uso di attrezzature specializzate, supportando una rapida validazione degli obiettivi in contesti con risorse limitate. Eliminando la dipendenza dai transilluminatori a UV, riduce i rischi per la sicurezza e la complessità operativa nei flussi di lavoro delle fasi iniziali di scoperta. L'approccio aumenta l'affidabilità predittiva grazie a una correlazione riproducibile tra il segnale derivante dal colorante e la concentrazione di DNA, facilitando decisioni di avanzamento o interruzione nei processi di identificazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la verifica di ipotesi attraverso la correlazione diretta tra l'intensità del precipitato di formazano e la concentrazione di DNA, supportando la valutazione dell'interazione con il bersaglio.
- Valore operativo: Utilizza agitazione a temperatura ambiente ed esposizione alla luce blu, evitando protocolli con raggi UV pericolosi e apparecchiature specializzate per l'immagine.
- Valore predittivo: Fornisce un'uscita quantitativa compatibile con scanner da ufficio, permettendo un rapido confronto dei rendimenti di acidi nucleici tra diverse condizioni sperimentali.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del Saggio: Genera bande di precipitato stabili e visibili che fungono da letture standardizzate per formati di screening dell'acido nucleico ad alto rendimento.
- Riproducibilità: Tempi di agitazione definiti (25 min per poliacrilamide, 60 min per agarosio) e concentrazioni di reagenti scalabili garantiscono una generazione del segnale costante tra i diversi lotti.
- Compatibilità con la Piattaforma: Funziona sia con gel di agarosio che di poliacrilamide, consentendo un'integrazione senza interruzioni nei flussi di lavoro di elettroforesi esistenti per l'analisi di varianti o plasmidi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Consente il recupero di plasmidi funzionali dopo la colorazione, come dimostrato da un numero maggiore di unità formanti colonie rispetto ai metodi basati su UV, permettendo così una validazione funzionale successiva.
- De-risking meccanicistico: Evita il danno al DNA indotto da UV, preservando l'integrità del campione per una correlazione accurata genotipo-fenotipo nei saggi di screening fenotipico.
- Utilità preclinica: Permette la quantificazione sul campo di costrutti di espressione genica o di titoli virali in modelli preclinici senza necessità di infrastrutture di laboratorio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'estrazione degli acidi nucleici alla validazione del saggio funzionale, in particolare nei casi in cui l'accesso alle attrezzature è limitato o è richiesta una rapida iterazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la validazione del target fornendo letture quantitative di DNA che si correlano con l'efficienza trascrizionale o di editing negli studi di modulazione delle vie metaboliche.
- Screening: Permette una quantificazione standardizzata degli acidi nucleici per la conferma dei risultati positivi in librerie CRISPR o di sovraespressione, migliorando la riproducibilità del saggio.
- Analisi: Genera curve lineari segnale-concentrazione mediante imaging con scanner da ufficio, supportando la normalizzazione dei dati in formati basati su piastre multipozzetto o su gel.
- Ricerca traslazionale: Facilita il recupero di acidi nucleici integri per saggi funzionali in vitro, collegando la fase di scoperta ai test di efficacia preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Richiede soltanto SYBR Green I, NBT e una sorgente di luce blu, rendendolo un modulo a basso costo e riutilizzabile tra più team di progetto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica evitando artefatti indotti da UV, migliorando l'affidabilità dei dati nei saggi di validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Elimina la necessità di camere oscure o transilluminatori, aumentando la produttività e riducendo i colli di bottiglia nelle strutture centralizzate condivise.
- Valore strategico: Riduce la spesa iniziale per la quantificazione degli acidi nucleici, consentendo test decentralizzati in laboratori satelliti o sedi collaborative.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce un avanzamento adeguato al rischio fornendo una conferma precoce e indipendente dall'attrezzatura del rendimento del costrutto, prima di investire nella purificazione a valle.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede una formazione di base in biologia molecolare per la preparazione dei gel e l'elettroforesi.
- Necessita di un accesso a una sorgente di luce blu (ad esempio, LED a 470 nm) o alla luce solare e a un comune equipaggiamento da laboratorio per l'agitazione.
- Richiede tempi di colorazione e concentrazioni di reagenti standardizzati per garantire la riproducibilità tra laboratori.
- Potrebbe richiedere un'ottimizzazione per formati ad alto rendimento a causa dei passaggi manuali di manipolazione dei gel.
- Limitato alla rilevazione di acidi nucleici; non applicabile per saggi su proteine o molecole piccole senza adattamenti.
