Acidi grassi saturi indurre la morte delle cellule del macrofago Ceramide-collegato

L'obiettivo generale di questo esperimento, in cui i macrofagi vengono trattati con acidi grassi saturi, è dimostrare che la morte cellulare dei macrofagi indotta dagli acidi grassi saturi è associata ai livelli cellulari accumulati di Ceramidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'infiammazione metabolica. Ad esempio: morte cellulare e infiammazione indotte dagli acidi grassi saturi.

Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di fornire un approccio semplice ma dettagliato per spingere i coniugati di acidi grassi BSA. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è difficile preparare una soluzione coniugata di acidi grassi BSA stabile e accurata con risultati coerenti. Iniziare questa procedura con la rimozione della tibia e delle ossa del femore da un topo selvatico sano di sei-otto settimane soppresso, come descritto nel protocollo di testo.

Tagliare entrambe le estremità delle ossa della tibia e del femore con una forbice e una cappa sterile per coltura tissutale. Sciacquare le ossa con un ago calibro 25 con PBS più il due percento di siero fetale bovino in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare le cellule del midollo osseo a 500 g, quattro gradi centigradi per cinque minuti.

Quindi, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi per lisare i globuli rossi per meno di un minuto. Diluire immediatamente le cellule con nove millilitri di 1x PBS. Centrifugare di nuovo, come prima, e decantare il surnatante.

Risospendere il pellet della cella in 10 millilitri di 1x PBS. Quindi, filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon sterile da 40 micron in un altro tubo da 15 millilitri per rimuovere detriti e grumi cellulari. Dopo la centrifugazione come prima, risospendere il pellet cellulare in 15 millilitri di terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute con il cinque percento di FBS e 10 microgrammi per millilitro di gentamicina.

Quindi, piastrate le cellule in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri e mettetele in un incubatore a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Agitare delicatamente il piatto, estrarre le celle galleggianti e contarle. Successivamente, piastra 6.000.000 di cellule in un piatto da 100 millimetri con 12 millilitri di terreno di differenziazione dei macrofagi e 10 nanogrammi per millilitro di fattore stimolante le colonie di macrofagi di topo ricombinante, o MCSF, per due giorni.

Dopo la coltura per due giorni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il cinque percento di CO2, alimentare ogni piatto con sei millilitri di terreno di differenziazione dei macrofagi freschi contenenti 10 nanogrammi per millilitro di MCSF. Il quinto giorno, prelevare otto millilitri del vecchio terreno senza disturbare le cellule e aggiungere 10 millilitri di terreno di differenziazione dei macrofagi freschi con 10 nanogrammi per millilitro di MCSF. Il settimo giorno, raccogli i macrofagi derivati dal midollo osseo, o BMDM, utilizzando un sollevatore cellulare.

Confermare il fenotipo dei BMDM mediante citometria a flusso, come indicato nel protocollo di testo. Per preparare il coniugato di acidi grassi BSA, preparare cinque millimolari di sale sodico di acidi grassi in due millimolari BSA. Riscaldare la miscela a 37 gradi Celsius o superiore, se necessario.

Quindi, Sonic Heat la miscela di due millimolari di BSA e sale di sodio degli acidi grassi fino ad ottenere una soluzione limpida. Dopo la sonicazione, filtrare la soluzione di acido grasso BSA, attraverso un filtro da 0,22 micron. Quindi, aliquotare la soluzione filtrata in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Conservare i tubi a quattro gradi Celsius per un uso a breve termine o a meno 20 gradi Celsius per una conservazione a lungo termine. Non si devono osservare precipitazioni dopo la conservazione a quattro gradi Celsius in frigorifero. Piastra i BMDM in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti con 0,4 milioni di cellule per millilitro in terreni di differenziazione dei macrofagi.

Trattare le cellule con acido palmitico 0,4 millimolare e acido stearico per 16-24 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius con il cinque percento di CO2. Utilizzare BSA come controllo negativo. Raccogliere le cellule con un sollevatore di cellule dopo il trattamento.

Quindi, centrifugare le celle a 500 g, quattro gradi Celsius per cinque minuti. Colorare le cellule con Annexin V-Alexa 488 e 7-AAD in 100 microlitri di tampone legante Annexin-V per 15 minuti a temperatura ambiente. Diluire il campione con 200 microlitri di tampone legante l'annessina e mescolare delicatamente.

Conservare i campioni in ghiaccio dopo il periodo di incubazione. Analizzare le cellule colorate il prima possibile mediante citometria a flusso. L'annessina V-Alexa 488 viene rilevata nel canale FITC e 7-ADD viene rilevato nel canale PerCP PerCP-Cy5.5.

Dopo il trattamento con acidi grassi, raccogliere le cellule come prima. Quindi, fissare le cellule in paraformaldeide al quattro percento per 30 minuti. Lavare il campione con un millilitro di 1x PBS prima di centrifugare il campione come prima.

Dopo aver travasato il surnatante, colorare le cellule con anticorpo primario anti-ceramide in 100 microlitri di 1x tampone di permeabilizzazione per 30 minuti. Dopo aver lavato e centrifugato le cellule come prima, colorare le cellule con anticorpo secondario IgM anti-topo in 100 microlitri di 1x tampone di permeabilizzazione per 30 minuti. Lavare e centrifugare nuovamente le celle come prima.

Quindi, aggiungere 250 microlitri di 1x PBS e analizzare le cellule colorate mediante citometria a flusso. I BMDM sono stati coltivati in vitro con livelli obesi di acidi grassi alimentari e la morte delle cellule macrofagiche è stata misurata utilizzando la colorazione citometrica a flusso. Rispetto al controllo BSA, gli acidi grassi saturi, in particolare gli acidi sterici, inducono una significativa morte cellulare dei BMDM.

Le cellule morte sono state mostrate come popolazione doppiamente positiva colorata con Annessina V e 7-AAD. Inoltre, la morte cellulare indotta dagli acidi grassi saturi è positivamente associata all'accumulo di livelli cellulari di Ceramide nei macrofagi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le coniugazioni degli acidi grassi BSA e trattare i macrofagi con i coniugati degli acidi grassi BSA per studiare la morte cellulare e l'infiammazione.

Al suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'infiammazione metabolica per esplorare la morte cellulare indotta dagli acidi grassi saturi e l'infiammazione nell'obesità.