Analisi delle cellule immuni in singolo nervo sciatico e del ganglio della radice dorsale da un singolo Mouse mediante citometria a flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere un numero sufficiente di cellule dai gangli delle radici dorsali e dai nervi sciatici da un singolo topo in modo da poter eseguire l'analisi della citometria a flusso delle cellule. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il materiale neuronale periferico genera grandi quantità di detriti quando viene digerito. Il vantaggio principale di questo metodo è che è possibile utilizzare diversi marcatori contemporaneamente per identificare più tipi di cellule.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di infiammazione e immunopatologia durante la neuropatia. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui modelli murini, può essere applicato anche ad altri organismi, come i nervi umani e suini, con piccole modifiche. In generale, le persone che si avvicinano per la prima volta a questo metodo avranno difficoltà a causa delle grandi quantità di detriti generati dalle digestioni.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di dissezione e dissociazione cellulare sono difficili da eseguire perché il materiale neuronale per topo è limitante. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo visto un protocollo che isolava le cellule di cigno dal nervo sciatico dal laboratorio di Steve Lacroix. Per iniziare, preparare il mouse come descritto nel protocollo di testo allegato e posizionarlo con il lato ventrale rivolto verso il basso mentre si allungano gli arti inferiori.

Quindi, usa un paio di pinze per sezionare bilateralmente l'intero nervo sciatico. Inizia separando il tessuto muscolare dalla parte superiore della coscia dorsale e segui il nervo lungo la colonna vertebrale. Taglia il nervo dove esce dalla colonna vertebrale e immediatamente sopra il ginocchio all'altra estremità.

Quindi trasferire i nervi asportati in una provetta da 1,5 millilitri contenente 1 millilitro di PBS ghiacciato. Conserva i nervi sul ghiaccio. Quindi, isola il ganglio della radice dorsale.

Inizia tagliando le costole parallelamente e vicino alla colonna vertebrale su entrambi i lati. Quindi, tagliare trasversalmente la colonna vertebrale a livello dei femori sul lato posteriore e vicino al cranio sul lato anteriore. Rimuovi la colonna vertebrale e usa le forbici dell'iride per tagliare via tutti i muscoli, il grasso e altri tessuti molli dalla colonna vertebrale.

Quindi, posiziona la colonna vertebrale con il lato ventrale rivolto verso l'alto e aprila iniziando dall'estremità caudale facendo scorrere una punta delle forbici nel canale vertebrale a ore 12 e tagliando l'osso. Procedendo fino a tagliare l'intera colonna vertebrale, ripetere questa procedura a ore sei fino a quando la colonna vertebrale non si è dimezzata. Separare le due metà della colonna vertebrale, quindi posizionare il campione sotto un microscopio da dissezione.

Rimuovere il midollo spinale per esporre i nervi spinali, quindi individuare e rimuovere i gangli della radice dorsale lombare tirando delicatamente la radice dorsale per tirarla nei canali vertebrali. Quindi, usa le forbici dell'iride per tagliare i nervi e il tessuto connettivo attorno al ganglio della radice dorsale. Usando una pinza, trasferisci i gangli della radice dorsale in un tubo da 1,5 millilitri e conservali sul ghiaccio.

Localizzare i gangli delle radici dorsali, estrarli senza danneggiarli e liberarli dal nervo spinale, richiede esercizio e abilità. Preparare un terreno di digestione, integrarlo con cento microgrammi per millilitro di desossiribonucleasi e conservarlo in ghiaccio. Quindi, aggiungere 500 microlitri di terreno di digestione in ciascuna delle provette con i nervi sciatici e i gangli delle radici dorsali.

Per i nervi sciatici, tritare il materiale da 15 a 20 volte usando un paio di forbici a molla, quindi incubare le sospensioni di tessuto in un'incubatrice agitata a 37 gradi Celsius per 20 minuti con una leggera agitazione. Dopo l'incubazione, triturare ripetutamente la sospensione cellulare attraverso un puntale di pipetta da 1.000 microlitri per dissociare meccanicamente il tessuto non completamente digerito. Ripetere la triturazione attraverso un puntale per pipetta da 1.000 microlitri.

Quindi incubare il campione per altri 10 minuti a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione. Preparare il tampone FACS ghiacciato e utilizzarlo per risciacquare e immergere uno schermo in acciaio inossidabile con una dimensione delle maglie di 140 micron in una capsula di Petri da 60 millimetri su ghiaccio. Quindi, utilizzare una pinza smussata per tenere il filtro a schermo da 140 micron sopra la capsula di Petri e far passare ripetutamente le sospensioni di tessuto attraverso il filtro.

Raccogliere la sospensione cellulare dalla capsula di Petri e trasferirla nella stessa provetta da 1,5 millilitri conservata nel ghiaccio. Spingere il tessuto non completamente digerito che rimane sul filtro mediante triturazione ripetuta con un puntale per pipetta da 1.000 microlitri. Quindi, sciacquare due volte il filtro a rete con 500 microlitri di tampone FACS e combinarlo con la sospensione cellulare nel tubo da 1,5 millilitri.

Se una parte eccessiva del campione viene digerita in modo incompleto e passa attraverso la rete metallica, può verificarsi una perdita di cellule e l'analisi della citometria a flusso può essere impossibile. Centrifugare le sospensioni cellulari ed eliminare il surnatante. Quindi risospendere il pellet della cella in un millilitro di tampone FACS.

Ripetere questa fase di lavaggio una volta, rimettendo in sospensione il pellet della cella finale in 150-350 microlitri di tampone FACS. Le cellule sono ora pronte per la colorazione. Al computer, selezionare i canali appropriati per il rilevamento dei fluorofori di interesse, la velocità di flusso appropriata dei campioni e il numero totale di eventi da raccogliere per campione.

Il numero minimo di eventi dovrebbe essere di un milione. Successivamente, crea grafici a dispersione in un foglio di lavoro globale della dispersione laterale A rispetto alla dispersione diretta A e per ogni fluoroforo di interesse rispetto alla dispersione diretta A.Inoltre, crea una vista statistica che visualizzerà il numero di eventi e l'intensità fluorescente media per i fluorofori selezionati. Determinare il cancello padre, P1, in base al grafico a dispersione dei controlli di colorazione solo DAPI.

Allegare il campione alla citometria a flusso e fare clic su acquisisci. Osservare il grafico DAPI rispetto a FSC e ridurre la tensione del canale blu del Pacifico del DNA fino a quando la popolazione DAPI+ diventa visibile. Utilizzando lo strumento di controllo rettangolare, disegna un riquadro attorno alla popolazione DAPI+.

Questo rappresenta il gate P1. Selezionare i grafici a dispersione per ciascuno dei fluorofori e visualizzare solo gli eventi DAPI+. Questo rappresenta la fluorescenza di fondo per ciascuno dei fluorofori.

Usando anche il gating rettangolare, disegna una casella nei grafici a dispersione per ciascuno dei fluorofori, partendo da 103 sull'asse y. Questa porta rappresenta la regione in cui dovrebbero essere trovati gli eventi positivi per ciascuno dei marcatori indicati. Regolare le tensioni per ciascuno dei fluorofori utilizzando i controlli di colorazione solo DAPI.

Allegare il campione alla citometria a flusso e fare clic su acquisisci. Osservare la posizione della popolazione DAPI+ per ciascuno dei fluorofori e regolare le rispettive tensioni in modo che le popolazioni cadano al di fuori del gate rettangolare. Una volta impostato il citometro a flusso, eseguire i campioni ed esportare i file Forward Scatter per ulteriori analisi.

Il lavaggio della colorazione DAPI prima dell'analisi mediante citometria a flusso ha ridotto l'intensità fluorescente dei detriti non nucleati. Ciò ha permesso di escludere il materiale all'estremità superiore dell'asse di dispersione in avanti, che contiene tessuto non completamente digerito, nella selezione della popolazione singoletto. Complessivamente, più di 30.000 singolette possono essere ottenute regolarmente da due nervi sciatici completi e più di 200.000 singolette possono essere ottenute dai gangli della radice dorsale.

Dai nervi sciatici, circa il 5% dei singoletti esprimeva CD45 sulla loro superficie, mentre circa il 5-10% è risultato esprimerlo nei gangli delle radici dorsali, definendo così queste cellule come leucociti di origine ematopoietica. La maggior parte dei singoletti CD45 positivi esprimeva anche MHC di classe II in modo graduale. Nei gangli della radice dorsale, tuttavia, CD11b può essere utilizzato per rilevare cellule simili alla microglia; Questa popolazione di microglia è assente dai nervi sciatici.

Nel nervo sciatico e nel ganglio della radice dorsale, dal 2% al 5% dei singoletti esprimeva CD68. Nei nervi sciatici circa il 60%80% dei macrofagi CD68 positivi esprimeva CD206. Mentre una percentuale minore di CD68 positivo co-esprimeva CD206 nel ganglio della radice dorsale.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante mantenere una temperatura costante per garantire un risultato costante. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo del diabete di esplorare gli effetti tossici della streptozotocina usata per indurre il diabete nei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la citometria a flusso sul tessuto neuronale periferico.

Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere pericoloso e bisogna sempre prendere precauzioni, come indossare guanti e occhiali protettivi.