4.12: Rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno

Le specie reattive dell'ossigeno prodotte nelle cellule sono state implicate nell'omeostasi dei tessuti, nell'invecchiamento cellulare e negli stati patologici come il cancro. Come suggerisce il nome, queste molecole derivano dall'ossigeno, che esiste naturalmente come molecola stabile di diossigeno poiché tutti i suoi elettroni sono accoppiati. L'aggiunta di un elettrone spaiato lo rende instabile e porta alla formazione dell'anione superossido, una forma di specie reattive dell'ossigeno o ROS. Oltre all'anione superossido, ci sono diversi tipi di specie reattive con elettroni spaiati, i cui livelli la cellula mira a controllare strettamente.

In questo video, impareremo in che modo le specie reattive dell'ossigeno sono correlate al metabolismo cellulare e alle malattie, esploreremo i principi alla base di un test per il suo rilevamento utilizzando una sonda fluorescente e esamineremo un protocollo generalizzato per questo test. Infine, indagheremo su come gli scienziati stanno implementando questo metodo negli esperimenti di oggi.

Innanzitutto, discutiamo di come vengono prodotte le specie reattive dell'ossigeno e consideriamo la loro influenza nel metabolismo cellulare e nelle malattie.

Una fonte significativa di specie reattive all'ossigeno cellulare sono i mitocondri. Normalmente, durante il metabolismo cellulare gli elettroni vengono trasportati attraverso una catena di complessi proteici, culminando nella riduzione dell'ossigeno molecolare in acqua e nella contemporanea generazione di ATP. Nonostante la straordinaria regolazione di questo processo, gli elettroni fuoriescono, con conseguente formazione di anione superossido.

La presenza di anione superossido dà rapidamente origine ad altre forme di specie reattive dell'ossigeno, come il perossido di idrogeno e il radicale ossidrile. Questi radicali, che possiedono tutti un elettrone spaiato altamente reattivo, possono danneggiare ossidativamente le membrane, il DNA e le proteine. Per contrastare, la cellula mantiene la propria scorta antiossidante di enzimi come la superossido dismutasi o molecole come la vitamina C, che riducono i radicali liberi. Qualsiasi squilibrio in questo sistema di difesa può provocare un ciclo di feedback positivo potenzialmente fatale, con conseguente condizione di eccessiva reattività delle specie dell'ossigeno nota come stress ossidativo.

Le specie reattive dell'ossigeno sono state implicate nell'inizio e nella progressione del cancro. Un altro effetto dannoso di queste molecole è l'induzione dell'invecchiamento cellulare, noto anche come senescenza. Le? Teoria dei radicali liberi sull'invecchiamento? propone che le specie reattive dell'ossigeno prodotte nelle cellule durante il normale metabolismo evochino la senescenza cellulare e la morte.

Fino ad ora, abbiamo discusso gli aspetti negativi di queste molecole altamente reattive, ma hanno anche ruoli positivi nella fisiologia cellulare. Durante le risposte immunitarie, quando i fagociti inghiottono gli agenti patogeni, le cellule montano un'esplosione "respiratoria" durante il quale vengono generate quantità eccessive di specie reattive dell'ossigeno per degradare ossidativamente gli agenti patogeni. Inoltre, sono intermedi e regolatori necessari di una varietà di vie di segnalazione cellulare e possono persino segnalare la morte delle cellule che sono diventate cancerose.

Per quantificare questi influenti ossidanti cellulari, gli scienziati sfruttano molecole che dopo l'ossidazione diventano fluorescenti. Una sonda comunemente usata per rilevare le specie reattive dell'ossigeno è H2DCFDA o dicloro-diidro-fluoresceina diacetato, un analogo non fluorescente della fluoresceina. Quando viene aggiunto alle cellule, la sua natura cellulare gli consente di diffondersi passivamente.

Quindi, le esterasi intracellulari catalizzano una reazione di idrolisi, che provoca la scissione dei gruppi acetato. Questo rende il composto più polare, in modo che venga trattenuto all'interno della cellula. Dopo l'ossidazione, che comporta la rimozione degli atomi di idrogeno da parte di un'ampia gamma di specie reattive dell'ossigeno, il H2DCFDA non fluorescente viene convertito nella dicloro-fluoresceina altamente fluorescente, o DCF. Questo può essere letto e quantificato da un lettore di piastre, un citometro a flusso o una microscopia a fluorescenza.

Ora che sai come funziona questo test, vediamo come viene eseguito in un ambiente di laboratorio.

Iniziare trasferendo le cellule coltivate in terreno di coltura in soluzione salina tamponata con fosfato, quindi con la centrifugazione per lavarle. Rimuovere il surnatante e aggiungere la sonda fluorescente H2DCFDA soluzione. Incubare le cellule cariche di colorante al buio per prevenire il fotosbiancamento. Dopo l'incubazione, lavare le cellule per rimuovere il colorante scaricato e trasferire le cellule su una piastra. A questo punto, possono essere aggiunti induttori sperimentali dello stress ossidativo.

Quando sono pronte per l'analisi, le celle possono essere inserite nel lettore di piastre. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono impostate per la fluoresceina. Dopo la lettura delle targhe, è possibile analizzare i valori. I risultati rivelano la quantità relativa di specie reattive dell'ossigeno tra i campioni in particolari punti temporali.

Ora che abbiamo esaminato il protocollo vero e proprio, diamo un'occhiata a come viene applicato negli esperimenti di oggi.

I ricercatori usano spesso questo metodo per studiare i meccanismi della fagocitosi. Questo gruppo di scienziati voleva studiare la capacità del pesce zebra di montare una risposta immunitaria in diverse fasi di sviluppo. Come accennato in precedenza, la fagocitosi provoca la generazione di specie ad alta reattività dell'ossigeno, o "un'esplosione respiratoria", che viene utilizzato per uccidere gli agenti patogeni. Poiché l'enzima NADPH ossidasi è un significativo produttore di ROS nelle cellule fagocitiche, questi scienziati hanno indotto la risposta burst trattando il pesce zebra con un induttore di NADPH. I risultati hanno dimostrato che tra gli embrioni di zebrafish il cui "burst? La risposta è stata provocata, quelli a 72 ore dopo la fecondazione hanno mostrato uno sviluppo di specie reattive dell'ossigeno più elevato rispetto a quelli a 48 ore dopo la fecondazione.

La disfunzione mitocondriale dovuta all'aumento delle specie reattive dell'ossigeno è una caratteristica patologica di molte malattie. Pertanto, i ricercatori possono identificare la disfunzione mitocondriale misurando il livello di stress ossidativo. Qui, gli scienziati hanno caricato H2DCFDA sui neuroni e poi hanno montato i campioni su un microscopio a fluorescenza. Con l'aggiunta di un fattore di stress ossidativo, come il perossido di idrogeno, i corpi cellulari hanno mostrato un improvviso aumento della fluorescenza, che potrebbe essere un'indicazione di disfunzione mitocondriale.

È stato suggerito che gli astrociti proteggano i neuroni del sistema nervoso centrale dallo stress ossidativo. A causa di questa importanza, questi ricercatori miravano a sviluppare un test per rilevare lo stress ossidativo negli astrociti in presenza di un induttore esterno. Lo hanno fatto incubando gli astrociti con perossido di idrogeno e la sonda fluorescente per il rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno. La successiva fluorescenza generata è stata analizzata utilizzando un citometro a flusso. È stato osservato che gli astrociti attivati per lo stress ossidativo rientrano in una regione di maggiore intensità di fluorescenza, spostata verso destra.

Hai appena visto il video di JoVE sul rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno o ROS. Per riassumere, in questo video abbiamo discusso il legame tra le specie reattive dell'ossigeno, il metabolismo cellulare e la malattia. Abbiamo quindi esaminato il principio e la procedura di un test per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno. Infine, abbiamo esplorato come i ricercatori stanno applicando questo metodo alle loro indagini. L'analisi dei ruoli ancora enigmatici delle specie reattive dell'ossigeno è di grande interesse per i biologi cellulari e la misurazione affidabile con sonde fluorescenti si sta rivelando inestimabile. Come sempre, grazie per la visione!