Name: Uso di zinco sinaptica istochimica per rivelare diverse regioni e lamine nel cervello in via di sviluppo ed adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Scopri l'istochimica dello zinco sinaptico per distinguere regioni e lamine cerebrali nel cervello in via di sviluppo e adulto utilizzando sezioni di cervello congelato di furetto. Questo metodo semplice e affidabile aiuta i ricercatori a identificare pattern di colorazione unici.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal centro nazionale per le risorse di ricerca (2G12RR03060-26A1); L'Istituto nazionale sulla salute delle minoranze e le disparità di salute (8G12MD007603-27) dal National Institutes of Health; Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY); e facoltà Research Grant (la RFG II) American University of Sharjah. Ringraziamo Vidyasagar Sriramoju per introdurre noi a questi metodi.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo studio corrente impiega una tecnica istochimica basata su una versione modificata del Danscher (1982) metodo10, per cui zinco sinaptica localizzazione può essere rilevato e visualizzato nel cervello. Questo metodo funziona essenzialmente iniettando l'animale con il selenito di sodio chelante (Na2SeO3) di zinco (15 mg/kg). A seguito di iniezione, la selenite viaggia al cervello e si lega di zinco liberi che è localizzato alle vescicole presinaptiche di zinco contenente neur...

Le macchie istologiche sono state usate tradizionalmente per aiutare nell'identificazione delle aree corticali in varie specie, rivelando le differenze nelle caratteristiche architettoniche. L'uso combinato di tecniche istochimiche come sostanza di Nissl, reattività del citocromo ossidasi (CO) o mielina può rivelarsi fruttuosa, come rivelano i limiti areali simili nel cervello adulto. Tuttavia, queste macchie istochimiche non rivelano sempre adeguatamente chiari confini tra aree corticali e livelli nel cervello immaturo.
Nel sistema nervoso centrale, lo zinco ha diverse funzioni critiche che includono la struttura del DNA, che agisce come cofattore degli enzimi, che partecipano a numerose funzioni di regolamentazione e di agire come un neuromodulatore attraverso la sua presenza in vescicole sinaptiche di stabilizzazione 1. zinco sinaptico è unico in quanto possono essere visualizzato utilizzando i metodi istologici, mentre lo zinco legato alle proteine non può essere visualizzato in quel momento2. Questa caratteristica è stata sfruttata per rivelare il disegno di zinco sinaptica in diverse regioni corticali e l'istochimica zinco sinaptica è stato utilizzato in una serie di studi. Un sottoinsieme di neuroni glutamatergici nella corteccia cerebrale contengono zinco nelle vescicole presinaptiche entro loro assoni terminali3,4. Gli studi istochimici hanno rivelato una distribuzione eterogenea di zinco sinaptica in corteccia cerebrale5,6,7. Ci sembra essere una diversa distribuzione area e laminare di zinco histochemically reattiva in diverse regioni corticali (ad es., visual contro corteccia somatosensory), o strati (ad esempio, i livelli dello zinco nella supragranular e infragranular strati della corteccia visiva primaria sono sostanzialmente superiori a livello di input thalamocortical IV con i livelli relativamente bassi dello zinco sinaptica)5,8,9. L'eterogeneità in zinco sinaptico colorazione osservata nella corteccia è particolarmente vantaggioso, in quanto facilita l'identificazione areal e laminare.
Qui presentiamo una descrizione dettagliata di una procedura di istochimica zinco sinaptica, che è una versione modificata 1982 metodo10 di Danscher. Questo metodo utilizza la selenite iniettata intraperitonealmente (IP) in animali come un agente chelante. La selenite viaggia al cervello di reagire con piscine di zinco liberi trovati in vescicole di un sottoinsieme di glutamatergic sinapsi nel cervello. Questa reazione produce un precipitato che può essere migliorato successivamente di sviluppo d'argento2,10,11.
Questa procedura rivela pattern laminare e areali di zinco sinaptico colorazione; l'analisi densitometrica può essere utilizzato per valutare questi modelli sia qualitativamente che quantitativamente nel cervello adulto e immaturo per studiare gli effetti di altri interventi, come manipolazioni sensoriale, ambientale, farmacologiche o genetiche. Inoltre, uno potrebbe anche voler valutare potenziali cambiamenti inerenti allo sviluppo nella distribuzione di zinco sinaptica in altre strutture corticale o sottocorticale in altri sistemi-modello. Le informazioni quantitative che fornisce analisi densitometrica in questo metodo possono essere vantaggiose per il seguente sviluppo del cervello nel corso del tempo. Questo protocollo fornisce un compagno ad altri marcatori istochimici e immuno - per rivelare i confini laminari e areali.

<table><tbody><tr><td>Euthasol (soluzione di eutanasia)</td><td>Henry Schein</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Ketaved)</td><td>Henry Schein</td><td>48858</td><td>100 mg/ml iniettabili</td></tr><tr><td>Xilazina (Anased)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td>100 mg/ml iniettabili</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Diluire a 4%</td></tr><tr><td>Gomma arabica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Idrochinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>Lattato d'argento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina di pesce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td> <td>(Tipo III, da cuore equino)</td></tr><tr><td>Catalse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C10</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Domino</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Utilizzato per la disidratazione prima del montaggio dei vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td></td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3660-1</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini smerigliati non sottotitolati</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3875-FR</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>American Optical Company</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX-60</td><td></td></tr><tr><td>Adope Photoshop</td><td>Adobe Systems, San Jose, CA</td><td></td><td>Per assemblare le immagini</td></tr>, <tr>il software<td>gratuito ImageJ</td><td>può essere scaricato all'indirizzo http://rsb.info.nih.gov/ij/</td><td></td> <td>Per le misure densometriche</td></tr><tr><td>Vassoio di plastica</td><td>Qualsiasi vassoio di plastica standard può essere utilizzato</td><td></td><td>per immergere i vetrini nella soluzione di sviluppo</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>È possibile utilizzare</td><td></td><td></td> qualsiasi piastra riscaldante standard</tr></tbody></table>

uso di zinco sinaptica istochimica per rivelare diverse regioni e lamine nel cervello in via di sviluppo ed adulto

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Caratterizzazione di organizzazione anatomica e funzionale del cervello e sviluppo richiede un'identificazione accurata di circuiti neurali distinti e regioni nel cervello adulto e immaturo. Qui descriviamo una procedura di colorazione istochimica di zinco che rivela differenze nel pattern di colorazione tra diversi strati e regioni del cervello. Altri hanno utilizzato questa procedura non solo per rivelare la distribuzione di zinco-contenendo i neuroni e circuiti nel cervello, ma anche per delineare correttamente areali e laminari confini nel cervello in via di sviluppo e adulto in diverse specie. Qui illustriamo questa procedura con immagini dallo sviluppo di colorazione e furetto adulto cervelli. Abbiamo rivelato un modello di macchiatura di zinco che serve come indicatore anatomico delle aree e livelli e può essere utilizzati in modo affidabile per distinguere le aree corticali visive nella corteccia visiva in via di sviluppo e adulta. L'obiettivo principale del presente protocollo è di presente un metodo istochimico che permette l'identificazione precisa dei livelli e delle regioni nel cervello adulto e in via di sviluppo dove altri metodi non riescono a farlo. Secondariamente, in concomitanza con analisi densitometrica delle immagini, questo metodo permette di valutare la distribuzione di zinco sinaptica per rivelare potenziali modifiche nel corso dello sviluppo. Questo protocollo descrive dettagliatamente i reagenti, strumenti e passaggi necessari per successivamente macchia sezioni di cervello congelato. Anche se questo protocollo è descritto usando il tessuto di cervello di furetto, può essere facilmente adattato per l'uso in roditori, gatti o scimmie così come in altre regioni del cervello.

I passaggi principali relativi a questo protocollo per macchiare le sezioni del cervello per zinco sinaptico sono presentati in un diagramma di flusso nella Figura 1. Il protocollo può essere diviso in tre fasi: 1) aspersione e tessuto raccolta, preparazione 2) tessuto e la macchiatura e l'istochimica 3) zinco. Brevemente, durante la prima fase del protocollo, l'animale è anestetizzato e IP iniettato con la dose appropriata di selenito di sodio. Dopo un perio...

Descriviamo una procedura istochimica che rivela la caratteristica dello zinco laminare e areal modelli in diverse regioni del cervello di macchiatura. Il modello di macchiatura di zinco può essere utilizzato in combinazione con altri marcatori anatomici per distinguere attendibilmente strati e regioni nel cervello in via di sviluppo e adulto.

Uso di zinco sinaptica istochimica per rivelare diverse regioni e lamine nel cervello in via di sviluppo ed adulto

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

L'obiettivo generale di questo metodo è eseguire la colorazione istochimica su sezioni di cervello congelate per furetto per illustrare l'utilizzo dei modelli di colorazione sinaptica dello zinco nel distinguere diverse regioni e strati nel cervello in via di sviluppo e adulto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave come le differenze qualitative e quantitative nel modello di colorazione sinaptica dello zinco tra diverse regioni e strati del cervello. Il vantaggio principale è che questa tecnica è semplice e affidabile, consentendo di identificare diverse regioni e strati nel cervello in via di sviluppo e adulto in base a modelli di colorazione unici.Sebbene questo metodo sia stato utilizzato per fornire informazioni sulla demarcazione di aree e strati nella corteccia visiva selvaggia, può anche essere utilizzato per differenziare gli strati in diverse regioni del cervello di roditori, gatti o primati. Per preparare 200 millilitri della soluzione dello sviluppatore, aggiungere lentamente 40 grammi di gomma arabica a 120 millilitri di acqua calda e continuare a mescolare con una bacchetta di vetro per scioglierla completamente. Poi lo lascia raffreddare per qualche minuto, quindi filtralo attraverso sei-otto strati di garza in un imbuto.Quindi aggiungere 5,04 grammi di acido citrico e 4,7 grammi di citrato di sodio in 20 millilitri di acqua distillata e sciogliere per creare il tampone citrato. Quindi aggiungere 1,7 grammi di idrochinone a 30 millilitri di acqua distillata riscaldata. Aggiungere 0,22 grammi di lattato d'argento a 30 millilitri di acqua per ottenere una soluzione di lattato d'argento.Nell'ordine seguente, mescola le soluzioni di gomma arabica, tampone citrato, idrochinone e, infine, lattato d'argento per preparare la soluzione dello sviluppatore e tenerla al buio. Per iniziare questa procedura, iniettare una dose di 15 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di soluzione di selenito di sodio, un chelante di zinco, per via intraperitoneale nel furetto anestetizzato. Quindi attendere da 60 a 90 minuti affinché la soluzione di selenito di sodio raggiunga il cervello.Quindi iniettare un sovradosaggio di 100 milligrammi per chilogrammo di fenobarbital per via intraperitoneale per sopprimere l'animale e attendere alcuni minuti affinché l'eutasolo funzioni. Eseguire la perfusione transcardica sul furetto soppresso prima con una normale soluzione salina per un minuto, e poi con paraformaldeide al 4% per 20 minuti. Quindi utilizzare un fissativo con saccarosio per completare la procedura di fissazione totale in un'ora.Usa un bisturi per praticare un'incisione sulla linea mediana partendo dal naso al collo per esporre il cranio. Rimuovere delicatamente il cervello e quindi utilizzare una lama di bisturi per separare gli emisferi. Quindi tagliare e separare la parte posteriore dal resto del cervello e post-fissare per due o quattro ore.Lascia affondare il cervello mantenendo il tessuto in una soluzione di saccarosio al 30% in tampone fosfato molare 0,1. Dopo che il cervello è affondato, usa un microtomo scorrevole congelante per creare sezioni semi-tangenziali spesse 40 micrometri attraverso la corteccia visiva. Usa un pennello per raccogliere tutte le sezioni del cervello e mettile in una scatola piena di soluzione salina tamponata con fosfato.Quindi, montare rapidamente una o due serie di sezioni cerebrali su vetrini rivestiti di bianco d'uovo. Conservare i vetrini a temperatura ambiente per una notte per farli asciugare. Dopo che i vetrini si sono asciugati, immergerli in alcool assoluto per 15 minuti.Attendere quindi un'ora per lasciare asciugare completamente i vetrini a temperatura ambiente. Immergere rapidamente le sezioni in una soluzione di gelatina all'1% per 10 secondi, quindi scolarle accuratamente. Conservare le sezioni a temperatura ambiente per asciugarle durante la notte.Utilizzare un vassoio di plastica per disporre i vetrini uno accanto all'altro. Quindi versare sopra la soluzione di sviluppo e assicurarsi che i vetrini siano completamente immersi in essa. Ricordarsi di controllare le sezioni ogni 30 minuti per lo sviluppo della reazione.Se i vetrini sono stati colorati in modo appropriato, rimuovere le sezioni montate sui vetrini dal vassoio e conservare i vetrini su un rack per vetrini. Utilizzare un grande piatto per vetri per lavare i vetrini all'interno del rack per vetrini sotto l'acqua corrente tiepida per 10 minuti per lavare lo strato di gelatina e il deposito d'argento esterno. Dopo aver asciugato i vetrini a temperatura ambiente, disidratarli per cinque minuti in etanolo al 100% e chiarirli per cinque minuti in xilene.Infine, posizionare un vetrino coprioggetto con il supporto di montaggio sulla diapositiva. Usa un microscopio a campo chiaro per esaminare le sezioni e scattare foto delle aree di interesse. Seleziona le sezioni colorate di zinco dalle fotomicrografie delle regioni di interesse per scegliere casualmente colonne corticali di circa 450 micrometri di larghezza.In ogni regione di interesse, scegli un numero appropriato di colonne campione da diverse sezioni del cervello. Quindi trasferisci le immagini delle colonne a un software di elaborazione delle immagini. Nel software, utilizzare lo strumento di sezione rettangolare per comprendere l'intera colonna corticale.Quindi utilizza lo strumento di inversione per invertire il contrasto dell'immagine. Quindi utilizzare lo strumento del profilo di stampa per creare un grafico bidimensionale delle intensità dei pixel lungo la linea per produrre profili di densità ottica dalle immagini. Infine, utilizzare le opzioni del profilo di stampa per convertire il grafico del profilo di stampa in un profilo verticale.Quindi fare nuovamente clic sul profilo della trama. Le fotomicrografie di sezioni semi-tangenziali colorate di zinco del cervello di un giovane furetto mostrano la caratterizzazione di tessuti sovra-colorati e sotto-colorati. Il tessuto sovra-colorato sviluppa un colore marrone molto scuro con variazione laminare inadeguata e sostanza bianca densamente colorata.Al contrario, i tessuti sotto-colorati sviluppano un colore marrone chiaro con una sostanza bianca minimamente colorata. Le fotomicrografie delle sezioni semi-tangenziali mostrano la colorazione sinaptica dello zinco nella citocromo ossidasi nelle aree corticali visive di un furetto adulto. L'intensità della colorazione dello zinco sinaptico è elevata negli strati sopragranulari e infragranulari delle aree 17 e 18, mentre lo strato quattro colora leggermente.Al contrario, lo strato quattro, dell'area di 17 e 18, è fortemente colorato quando colorato per la reattività alla citocromo ossidasi. Le fotomicrografie colonnari mostrano la distribuzione laminare dello zinco sinaptico in tutti gli strati corticali con i loro valori complementari di densità ottica normalizzata. Per riflettere i cambiamenti nella colorazione sinaptica dello zinco in base alla profondità corticale, sono stati generati grafici normalizzati dei valori di densità ottica in ciascuna area corticale visiva.La depressione presente nei profili dei grafici mostra una bassa colorazione sinaptica di zinco nel quarto strato delle aree 17 e 18. Questa procedura può aiutare a spiegare se ci sono cambiamenti nello sviluppo e nell'intensità delle macchie in particolari regioni del cervello nel tempo. Questa tecnica si è rivelata utile per i ricercatori di neuroanatomia per esplorare come le manipolazioni sensoriali, ambientali, farmacologiche o genetiche possano influenzare la distribuzione della colorazione sinaptica dello zinco nel cervello adulto e immaturo in una serie di specie.Grazie per l'attenzione. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

Questo protocollo presenta un metodo per il recupero morfologica dei neuroni rattoppati durante le registrazioni elettrofisiologiche utilizzando riempimento biocitina e successiva postprocessing immunoistochimica. Abbiamo dimostrato che spesse sezioni biocitina-riempita che erano macchiate e coprioggetto possono essere ricolorate con un secondo giorni di anticorpi primari o mesi dopo.

Immunocolorazione delle sezioni biocitina-riempite e trasformati per neurochimici Marcatori

Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

Il protocollo descritto qui descrive l'analisi di immunofluorescenza, biocitina recupero e ricostruzioni di alta qualità di hippocampal CA2 interneuroni seguendo le registrazioni elettrofisiologiche intracellulari in vitro, permettendo un neurone caratterizzazione e infine bene anatomia un neurone per essere studiato.

Recupero di biocitina e ricostruzioni 3D di interneuroni riempito Hippocampal CA2

La combinazione di microscopia elettronica di trasmissione e trasduzione nell'utero è un approccio potente per studiare i cambiamenti morfologici nell'ultrastruttura bene del sistema nervoso durante lo sviluppo. Questo metodo combinato consente approfondimenti cambiamenti nei dettagli strutturali sottostanti la neuroplasticità rispetto alla loro rappresentazione topografica.

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

Descriviamo le procedure per l'elaborazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici ad alta risoluzione per l'analisi morfolometrica della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi. I micrografi ottenuti con questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia di un certo numero di altri componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali.

Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi

La dissezione della crio-sezione consente la preparazione fresca e congelata della più grande nicchia neurogena nel cervello murino per l'analisi quantitativa profonda del proteoma. Il metodo è preciso, efficiente e provoca una minima perturbazione tissutale. Pertanto, è ideale per studiare il microambiente molecolare di questa nicchia, così come altri organi, regioni e specie.

Dissezione crio-sezione della zona subependimale adulta per un'analisi quantitativa accurata e profonda del proteoma

Il protocollo presentato descrive l'uso della microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per quantificare i cambiamenti circadiani nella corteccia del barile del topo, concentrandosi principalmente sul numero di sinapsi e sulla morfologia della spina dendritica.

Microscopia elettronica a trasmissione come tecnica di visualizzazione per l'analisi della plasticità sinaptica circadiana nella corteccia del barile del topo

Scopri l'istochimica dello zinco sinaptico per distinguere regioni e lamine cerebrali nel cervello in via di sviluppo e adulto utilizzando sezioni di cervello congelato di furetto. Questo metodo semplice e affidabile aiuta i ricercatori a identificare pattern di colorazione unici.

Uso di zinco sinaptica istochimica per rivelare diverse regioni e lamine nel cervello in via di sviluppo ed adulto

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