In Vitro Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe

C'è una domanda per fare pre-clinica test per una nuova classe di farmaci "orfani" chiamato chaperoni farmacologici riproducibile, veloce ed efficiente. Abbiamo sviluppato un test cellulari semplice, altamente standardizzate e versatile cultura alla schermata per i pazienti eleggibili come pure droghe romanzo chaperoni farmacologici.

L'obiettivo generale di questo protocollo di coltura cellulare modificato è quello di fornire una rapida valutazione fenotipica della varianza allelica nella malattia di Fabry e Pompe. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie da accumulo lisosomiale, come gli esiti prognostici e le decisioni terapeutiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente riproducibile e che può aiutare nello sviluppo di nuovi farmaci, come i farmaco-chaperoni.

Per effettuare la mutagenesi sito-specifica, iniziare utilizzando le sequenze di riferimento NM 00169.2 e NM 00152.4 come modelli per la mutagenesi dei geni GLA e GAA, rispettivamente. Utilizza lo strumento gratuito Primer Design per supportare la progettazione di primer. Quindi, avere una serie di primer ad alta purezza e privi di sale sintetizzati da un fornitore commerciale, con primer senso e antisenso che portano una delle rispettive modifiche di sequenza, fondamentali per la loro lunghezza, per introdurre individualmente la mutazione.

Preparare la miscela di reazione in un volume di 50 microlitri ed eseguire il programma PCR utilizzando le condizioni standard fornite dal produttore e come elencato nel protocollo di testo. Dopo la PCR, aggiungere un microlitro di enzima di restrizione Dpn1 e continuare a incubare le fiale di reazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo aver trasformato il DNA plasmatico in cellule di E.coli competenti e aver preparato i plasmidi della trasformazione desiderata secondo il protocollo di testo, utilizzare uno strumento di biologia molecolare adatto per analizzare la sequenza.

Quando viene rilevata la mutazione desiderata e non si osservano ulteriori anomalie di sequenza rispetto a NM 000169.2 per l'alfa-galattosidasi A o NM 000152.4 per l'alfa-galattosidasi acida, selezionare il clone per la purificazione plasmidico di grado trasfezione. Determinare la purezza del DNA misurando l'assorbanza in uno spettrofotometro. Dopo la coltivazione di cellule HEK293H in un pallone di coltura T75 secondo il protocollo di testo, 24 ore prima della trasfezione, utilizzare PBS senza calcio o magnesio per lavare le cellule una volta.

Con lo 0,05% di tripsina-EDTA, raccogliere le cellule e nelle cavità di una piastra di coltura a 24 pozzetti utilizzare 500 microlitri di DMEM integrato con il 10% di FBS per seminare 1,5 volte 10 nelle cinque cellule. Eseguire la trasfezione cellulare secondo il manuale del produttore. Utilizzando una miscela di un microgrammo di DNA plasmidico disciolto in 100 microlitri di DMEM privo di siero e 2,5 microlitri di reagente di trasfezione.

Incubare la soluzione per 20 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungerla alle cellule in modo gocciolato. Dopo un periodo di quattro ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2, rimuovere il terreno contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 500 microlitri di DMEM fresco con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Come opzione durante questo passaggio, aggiungere DGJ o DNJ al terreno di coltura dove previsto.

Il giorno del raccolto, rimuovere le cellule dall'incubatrice. Quindi aspirare il terreno e utilizzare PBS con calcio e magnesio per lavare accuratamente le cellule due volte. Questo passaggio è fondamentale perché DGJ e DNJ sono inibitori di entrambi gli enzimi e quindi qualsiasi avanzo invaliderebbe il test.

Dopo il lavaggio, aggiungere 200 microlitri di acqua deionizzata direttamente sopra le celle. Quindi sciacquare le cellule dalla piastra e trasferirle in una provetta di reazione da 1,5 millilitri. Posizionare i campioni in un apposito rack di schiuma e farli vorticare per cinque secondi per rendere la lisi più efficiente.

Quindi alternare i campioni tra azoto liquido per 10 secondi e un bagno d'acqua a temperatura ambiente fino al completamento dello scongelamento. Dopo aver ripetuto la procedura di omogeneizzazione cinque volte, centrifugare i campioni per cinque minuti a 10.000 g. Quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta di reazione.

Per effettuare il test BCA, preparare una provetta nuova per ogni campione contenente 40 microlitri di H20 deionizzato e aggiungere 10 microlitri di campione. Mescolare ogni soluzione agitando brevemente e trasferire 10 microlitri di ciascun campione in triplicato nelle cavità di una piastra a 96 pozzetti. Per preparare una curva standard, diluire una soluzione madre BSA da 2 milligrammi per millilitro e deionizzare l'H2O secondo il protocollo di testo.

Dopo aver combinato il reagente A e il reagente B, avviare la reazione aggiungendo 200 microlitri della soluzione di reagente BCA e incubare i campioni al buio a 37 gradi Celsius e 300 giri/min su un agitatore orbitale per un'ora. Quindi misurare l'assorbanza a 560 nanometri in un lettore di piastre. I campioni contengono in genere da uno a 1,5 microgrammi di proteine per microlitro.

Diluire la quantità calcolata di ciascun campione e pipettarlo in provette di reazione fresche da 1,5 millilitri per ottenere 0,05 microgrammi di alfa-galattosidasi A o 0,5 microgrammi di alfa-glucosidasi acida per microlitro di soluzione. Agitare nuovamente i campioni per cinque secondi e pipettare 10 microlitri di questa diluizione in duplicato in una piastra a 96 pozzetti. Avviare le reazioni aggiungendo 20 microlitri della rispettiva soluzione di substrato.

Per l'alfa-galattosidasi A, aggiungere due millimolari di 4-metilumbelliferil alfa-D galattopiranoside, o 4-MU-gal, in tampone fosfato-citrato molare 0,06, pH 4,7. Per l'alfa-glucosidasi acida, aggiungere 2 millimolari di 4-metilumbelliferil alfa-D glucopiranoside, o 4-MU-glu, in acetato di sodio 0,025 molari, pH 4,0. Incubare le reazioni enzimatiche per un'ora al buio a 37 gradi Celsius e 300 giri/min su un agitatore orbitale.

Quindi terminare la reazione aggiungendo 200 microlitri di tampone glicina sodico-idrossido aggiustato a pH 1,0 molare 10,5. Preparare una curva standard di 4-MU da un impasto di 0,01 milligrammi per millilitro secondo il protocollo di testo e pipettare 10 microlitri di soluzioni in duplicato in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 200 microlitri di tampone glicina sodico-idrossido molare da 1,0 molari a ciascun pozzetto per regolare il volume e il pH.

Infine, misurare l'attività enzimatica in un lettore di florescenza dotato del set di filtri appropriato. E analizza i dati utilizzando il software appropriato per il dispositivo di lettura della fluorescenza. Per valutare l'efficienza della mutagenesi del gene GLA, le mutazioni sono state classificate in tre categorie e hanno rivelato che circa il 66,5% è stato ottenuto al primo tentativo.

Un ulteriore 25% potrebbe essere ottenuto dopo una seconda PCR leggermente modificata. Nella terza categoria, è stato necessario intraprendere uno sforzo maggiore, come la riprogettazione del primer, per produrre il clone desiderato. Questa tabella si riferisce ai risultati della misurazione dell'attività enzimatica per tre mutazioni dell'alfa-galattosidasi A e tre dell'alfa-glucosidasi acida non trattate o trattate con DGJ e DNJ.

I dati vengono visualizzati come valori assoluti per il turnover del substrato e hanno valori relativi normalizzati all'enzima wild-type. I dati sull'attività enzimatica assoluta sono stati corretti per l'attività enzimatica endogena delle cellule HEK293H utilizzando cellule trasfettate con un vettore pcDNA 3.1 vuoto. I valori di attività enzimatica sono stati normalizzati in enzima wild-type da esperimenti corrispondenti, il che spiega la deviazione dei valori relativi tra i diversi mutanti.

Una volta padroneggiata, la frazione di coltura post-cellulare di questo esperimento, che rappresenta la maggior parte del tempo pratico, può essere eseguita entro quattro ore. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie da accumulo lisosomiale per esplorare le correlazioni genotipo-fenotipo nella malattia di Fabry e nella malattia di Pompe. Questo protocollo può aiutare nello sviluppo di nuovi farmaci nelle malattie da accumulo lisosomiale.