Name: In Vitro Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Impara a misurare l'attività enzimatica in vitro per testare la reattività dei chaperone farmacologici nelle malattie di Fabry e Pompe. Questo metodo cellulare altamente riproducibile facilita lo screening di nuovi farmaci e le decisioni terapeutiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desidera ringraziare Mandy Loebert e Tina Czajka per supporto tecnico eccellente. Ringraziamo Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) per la lingua modifica Guida.

1. preparazione di costrutti pcDNA3.1/GLA e pcDNA3.1/GAA mutante
Nota: Le strategie di clonazione per il GLA e GAA codifica di sequenze (cds) sono stati segnalati precedenti15,18.
<ol>
	<li>Mutagenesi sito-diretta mediante mutagenesi sito-diretta
	<ol>
		<li>Uso il riferimento sequenze NM_000169.2 e NM_000152.4 come modelli per la mutagenesi dei geni GLA e GAA , rispettivamente. Avere un set di primer gratuito sale ad alta purezza (25-37-mers) sintetizzato da un provider commerciale, con gli iniettori di senso e antisenso che trasportano uno delle modifiche rispettiva sequenza centrale alla loro lunghezza di introdurre individualmente la mutazione. Utilizzare lo strumento di disegno di primer gratuito per sostenere il disegno di primer19.</li>
		<li>Per la miscela di reazione, utilizzare le condizioni standard per la soluzione di reazione e le condizioni PCR fornite dal produttore.<ol>
			<li>Mix 5 µ l di tampone di reazione, 10 10x ng modello double-stranded del DNA del plasmide (pcDNA3.1/GLA o pcDNA3.1/GAA), 125 ng di ogni primer, 1 µ l della miscela dei dNTP fornito, 3 µ l di reagente di DMSO in un volume adeguato di acqua deionizzata (volume di reazione finale : 50 Μ L). Infine, aggiungere 2,5 U di DNA polimerasi e Miscelare pipettando su e giù. Come controllo negativo, portare con sé un campione no-primer.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Avviare la PCR utilizzando il seguente programma: passo 1: 95 ° C per 1 min, passo 2: 95 ° C per 50 s, passo 3: 60 ° C per 50 s, passo 4: 68 ° C per 8 min, ripetere il passaggio 2-4 18 volte e passo 5: 68 ° C per 10 min.<ol>
			<li>Dopo la PCR, aggiungere 1 µ l di Dpnho degli enzimi di limitazione (10 U / µ l) e ulteriormente Incubare la fiala di reazione a 37 ° C per 1 h.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trasformazione e lo Screening per il Clone desiderato
	<ol>
		<li>Trasformare un'aliquota di cellule ultracompetent in conformità con le raccomandazioni del produttore. Utilizzo medio SOC (tryptone 2% (p/v), lievito estratto di 0,5% (p/v), 10mm di NaCl, KCl 2.5 mM, sterilizzare a 121 ° C e quindi aggiungere soluzioni sterili filtrato di MgCl2 e il glucosio fino a concentrazioni finali di 10 e 20 mM, rispettivamente) invece del produttore medio. Dopo la procedura, piastra 250 µ l della mutagenesi di esempio su un LB piastra contenente 100 ampicillina di µ g/mL e incubare a 37 ° C per 18 ore.</li>
		<li>Assicurare che il numero dei transformants è &#62; 10 e la reazione produce almeno tre volte come molte colonie come la reazione di controllo no-primer, per esempio, usando un piatto luminoso per facilitare il conteggio di Colonia. Poi scegli 3 colonie e preparare 3ml culture durante la notte nel mezzo di libbra di brodo.</li>
		<li>Il giorno successivo, svolgere Miniprep con un kit standard e analizzare l'intera sequenza usando T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) e BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) primer tramite standard Sanger sequenziamento.</li>
		<li>Utilizzare uno strumento adatto biologia molecolare per analizzare la sequenza. Quando viene rilevata la mutazione desiderata e nessun ulteriore sequenza anomalia rispetto al NM_000169.2 (α-galattosidasi A) o NM_000152.4 (α-glucosidasi acida) è visto, selezionare il clone per la purificazione del plasmide di transfezione-grado.</li>
		<li>Determinare la purezza del DNA misurando l'assorbanza a uno spettrofotometro. Nota: Consenti solo i preparativi che producono una purezza del plasmide con un rapporto di assorbanza 260/280 di &#62; 1.8 per cella esperimenti della coltura.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. coltivazione di cellule HEK293H
<ol>
	<li>Mantenere le cellule HEK293H in alto glucosio (4,5 g/L) Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina. Mantenere le cellule un incubatore a 37 ° C sotto un 5% CO2 ambiente di pluritubulare.</li>
	<li>Coltivare le cellule ad una densità di 80-90%.</li>
	<li>Il mezzo di aspirare e lavare una volta utilizzando fosfato tampone salino (PBS) senza Ca2 + e Mg2 +.</li>
	<li>Passaggio con l'aggiunta di 0.05% tripsina-EDTA e incubare per 5 min a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Dividere le celle 01:15 in mezzo fresco e il seme in una nuova staffa T75 per mantenere la cultura permanente. Non usare celle con più di 25 passaggi.</li>
</ol>
3. pcDNA3.1/GLA e pcDNA3.1/GAA plasmide transfezione e trattamento di HEK293H
<ol>
	<li>24 h prima la transfezione, lavare le cellule HEK293H in un matraccio di cultura T75 cella una volta con PBS con Ca2 +, Mg2 +. Raccogliere le cellule con 0,05% tripsina-EDTA come indicato sopra e cellule5 seme 1.5 x 10 nelle cavità di una piastra di coltura ben 24 utilizzando 500 µ l DMEM supplementato con 10% FBS senza antibiotici.</li>
	<li>Eseguire un protocollo di transfezione secondo il manuale del produttore. In genere, è possibile utilizzare una miscela di 1 µ g di DNA plasmidico e 2,5 µ l di reagente di transfezione in 100 µ l di DMEM privo di siero. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente e aggiungere alle celle in modo sospensione da allora in poi.</li>
	<li>Rimuovere il supporto contenente il reagente di transfezione dopo un periodo di 4 h a 37 °C/5% CO2 e aggiungere 500 µ l di fresco DMEM con 10% FBS / 1% di penicillina/streptomicina. Nota: Durante questa fase, 1-Deoxygalactonojirimycin cloridrato (DGJ) o 1-Deoxynojirimycin cloridrato (DNJ) potrebbe essere aggiunto al terreno di coltura dove previsto (utilizzare una soluzione acquosa di stock di 10 mM per ottenere una concentrazione finale di 20 µM DGJ e DNJ ). Fresco DGJ o DNJ è stato aggiunto 42h dopo trasfezione di plasmide.</li>
</ol>
4. cellula raccolto e α-galattosidasi A o la misurazione dell'attività α-glucosidasi acida
<ol>
	<li>Colture di cellule
	<ol>
		<li>Il giorno della raccolta, rimuovere le cellule dall'incubatrice ed aspirare il mezzo. Lavare accuratamente le cellule 2 volte con PBS con Ca2 + e Mg2 +. Nota: Questo passaggio è fondamentale perché DGJ e DNJ sono potenti inibitori della α-galattosidasi e α-glucosidasi, rispettivamente, ed eventuali rimanenze invaliderebbe il test.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di acqua deionizzata direttamente sopra le cellule. Sciacquare le cellule dalla piastra e trasferirli in una provetta di reazione da 1,5 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Omogeneizzazione di congelamento e scongelamento
	<ol>
		<li>Mettere i campioni in un rack di schiuma appropriata e vortexare per 5 s per rendere più efficiente la lisi. Mettere i campioni alternati in azoto liquido per 10 s e in un bagno di acqua temperatura ambiente fino a quando lo scongelamento era completa (5 min).</li>
		<li>Ripetere questa procedura 5 volte e poi girare i campioni per 5 min a 10.000 x g.</li></ol></li></ol>Conservare il surnatante e pipetta in un nuovo tubo di reazione.
	
	
	<li>Determinazione di concentrazione nella proteina usando bicinconinico acido (BCA) analisi
	<ol>
		<li>Preparare una nuova provetta per ciascun campione contenente 40 µ l di deionizzata H2O e aggiungere 10 µ l di campione. Mescolare la soluzione nel Vortex brevemente e trasferire 10 µ l in una cavità di una piastra ben 96 (ogni campione in triplice copia). Diluire una soluzione madre di albumina di siero bovino (BSA) 2 mg/mL in deionizzata di H2O come indicato di seguito per ottenere una curva standard: 50 µ l di H2O/50 BSA µ l; 60 µ l H2O/40 µ l BSA; µ L 70 H2O/30 µ l BSA; BSA a 80 µ l H2O/20 µ l; µ L 90 H2O/10 µ l BSA; 100 µ l di H2O.</li>
		<li>Iniziare la reazione aggiungendo 200 µ l di reagente BCA (Reagente A e il reagente B mescolati ad un rapporto di 50: 1) e incubare per 1 h al buio a 37 ° C sotto agitazione leggera su agitatore orbitale (300 giri/min). Misurare l'assorbanza a 560 nm in un lettore di piastra. Nota: I campioni contengono in genere tra 1 e 1,5 µ g di proteine per µ l.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Misurazione dell'attività enzimatica con substrati artificiali 4-Methylumbelliferyl (4-MUG)
	<ol>
		<li>Diluire la quantità calcolata di ogni campione e dispensare nelle provette di reazione fresco 1,5 mL per ottenere 0,5 (per α-glucosidasi acida) o 0.05 (per α-galattosidasi A) µ g proteine / µ l soluzioni. Vortice i campioni per 5 s nuovo e dispensare 10 µ l di questa diluizione in un 96 ben piatto (ogni campione in duplicato).</li>
		<li>Iniziare la reazione aggiungendo 20 µ l di soluzione substrato rispettivi: Per α-galattosidasi r: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galattopiranoside (4-MU-gal) in tampone citrato di 0,06 M fosfato, pH 4,7. Per α-glucosidasi acida: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) in acetato di sodio 0,025 M, pH 4,0.</li>
		<li>Incubare le reazioni enzimatiche per 1 h al buio a 37 ° C sotto agitazione leggera su agitatore orbitale (300 giri/min). Terminare la reazione con l'aggiunta di 200 µ l di 1,0 M, tampone a pH 10,5 regolato glicina-NaOH.</li>
		<li>Preparare una curva standard di 4-methylumbelliferone (4-MU) da uno stock di 0,01 mg/mL come segue: 100 µ l di H2O / no 4-MU; 80 µ l di H2O / 20 µ l 4-MU; 60 µ l H2O / 40 µ l 4-MU; 40 µ l di H2O / 60 µ l 4-MU; 20 µ l H2O / 80 µ l 4-MU; No di H2O / 100 µ l 4-MU, dispensare 10 µ l di ciascuna diluizione nel pozzo 96 piastra (in duplicato) e aggiungere 200 µ l di buffer di glicina-NaOH 1,0 M in ciascun pozzetto al fine di regolare il volume e il pH.</li>
		<li>Misura l'attività dell'enzima in un lettore di fluorescenza con il set di filtri appropriati e analizzare i dati utilizzando il software appropriato per la periferica del lettore di fluorescenza. Nota: Entrambi i substrati 4-MUG sono ridotti a 4-MU durante l'esposizione al α-galattosidasi A o α-glucosidasi acida. Rilasciato 4-MU è un fluorocromo, che può essere misurato a 360 e 465 nm come lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione, rispettivamente, utilizzando un lettore di micropiastre fluorescenza.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Cardiff University. , 
 <a target="_blank" href="http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.">http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.</a> (2017).</li>
<li>Meiji Pharmaceutical University. , <a target="_blank" href="http://fabry-database.org">http://fabry-database.org</a> (2017).</li>
<li>Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , <a target="_blank" href="http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en">http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en</a> (2017).</li>
<li>Ishii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+alpha-galactosidase+A+enzymes+identified+in+Fabry+disease+patients+with+residual+enzyme+activity%3A+biochemical+characterization+and+restoration+of+normal+intracellular+processing+by+1-deoxygalactonojirimycin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin.</a> Biochem J. 406, 285-295 (2007).</li>
<li>Tajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+studies+on+Pompe+disease+and+a+%26%2334%3Bpseudodeficiency+of+acid+alpha-glucosidase%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical studies on Pompe disease and a &#34;pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase&#34.</a> J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).</li>
<li>Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Clinical+Consequences+of+Novel+%CE%B1-Galactosidase+A+Mutations+in+Fabry+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease.</a> Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).</li>
<li>Parenti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+lysosomal+storage+diseases+with+pharmacological+chaperones%3A+from+concept+to+clinics%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics.</a> EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).</li>
<li>Yasuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabry+disease%3A+characterization+of+alpha-galactosidase+A+double+mutations+and+the+D313Y+plasma+enzyme+pseudodeficiency+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele.</a> Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).</li>
<li>Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutations+of+the+GLA+gene+in+Japanese+patients+with+Fabry+disease+and+their+functional+characterization+by+active+site+specific+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone.</a> Hum Mutat. 29, 331(2008).</li>
<li>Andreotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+of+Fabry+disease+with+pharmacological+chaperones%3A+from+in+silico+predictions+to+in+vitro+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests.</a> Orphanet J Rare Dis. 6, 66(2011).</li>
<li>Khanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacological+chaperone+AT2220+increases+the+specific+activity+and+lysosomal+delivery+of+mutant+acid+alpha-glucosidase%2C+and+promotes+glycogen+reduction+in+a+transgenic+mouse+model+of+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease.</a> PLoS One. 9, e102092(2014).</li>
<li>Siekierska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Galactosidase+aggregation+is+a+determinant+of+pharmacological+chaperone+efficacy+on+Fabry+disease+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants.</a> J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).</li>
<li>Parenti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+enhancement+of+mutated+alpha-glucosidase+activity+in+fibroblasts+from+patients+with+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease.</a> Mol Ther. 15, 508-514 (2007).</li>
<li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacogenetic+approach+to+identify+mutant+forms+of+%CE%B1-galactosidase+A+that+respond+to+a+pharmacological+chaperone+for+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease.</a> Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).</li>
<li>Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterisation+of+alpha-galactosidase+a+mutations+as+a+basis+for+a+new+classification+system+in+fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease.</a> PLoS Genet. 9, e1003632(2013).</li>
<li>Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermodynamic+assay+to+test+pharmacological+chaperones+for+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).</li>
<li>, <a target="_blank" href="https://www.google.ch/patents/US9095584">https://www.google.ch/patents/US9095584</a> (2017).</li>
<li>Lukas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+enhancers+for+the+treatment+of+Fabry+and+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease.</a> Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).</li>
<li>, <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp ">http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp </a> (2017).</li>
<li>Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+chaperone+corrects+lysosomal+storage+in+Fabry+disease+caused+by+trafficking-incompetent+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).</li>
<li>Shin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+pharmacological+chaperones+in+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease.</a> Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).</li>
<li>Shin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+response+of+mutated+alpha-galactosidase+A+to+a+pharmacological+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone.</a> Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).</li>
<li>Filoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+new+GLA+gene+mutations+leading+to+conformational+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).</li>
<li>Citro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Large+Phenotypic+Spectrum+of+Fabry+Disease+Requires+Graduated+Diagnosis+and+Personalized+Therapy%3A+A+Meta-Analysis+Can+Help+to+Differentiate+Missense+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li>
<li>Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabry_CEP%3A+a+tool+to+identify+Fabry+mutations+responsive+to+pharmacological+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 111(2013).</li>
<li>Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+correlation+between+the+residual+activity+of+beta-hexosaminidase+A+and+arylsulfatase+A+and+the+severity+of+the+resulting+lysosomal+storage+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease.</a> Hum Genet. 88, 513-523 (1992).</li>
<li>Germain, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+pharmacodynamic+effects+of+a+pharmacological+chaperone+on+%CE%B1-galactosidase+A+activity+and+globotriaosylceramide+clearance+in+Fabry+disease%3A+report+from+two+phase+2+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies.</a> Orphanet J Rare Dis. 7, 91(2012).</li>
<li>Hughes, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+pharmacological+chaperone+migalastat+compared+with+enzyme+replacement+therapy+in+Fabry+disease%3A+18-month+results+from+the+randomised+phase+III+ATTRACT+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study.</a> J Med Genet. 54, 288-296 (2017).</li>
<li>Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Chaperone+Therapy%3A+Preclinical+Development%2C+Clinical+Translation%2C+and+Prospects+for+the+Treatment+of+Lysosomal+Storage+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders.</a> Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).</li>
<li>Parenti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chaperone+Enhances+Blood+%CE%B1-Glucosidase+Activity+in+Pompe+Disease+Patients+Treated+With+Enzyme+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy.</a> Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Il protocollo descritto nel presente documento fornisce risultati affidabili per la valutazione dei danni degli enzimi in malattie lisosomiali ereditarie del metabolismo. Questo manoscritto è che un emendamento al protocollo pubblicato precedenti15. Le modifiche più cruciale coinvolgono stringenza (cioè, nel processo di preparazione del costrutto di mutante vettoriale), standardizzazione del protocollo di cultura di cellule (cioè, condizioni di manutenzione e di transfezione dell...

Ci sono oltre una dozzina i disordini da accumulo lisosomiale (LSD) legati alla disfunzione di glycosidase come conseguenza delle mutazioni di gene primario. In Fabry (OMIM #301500) e malattia di Pompe (OMIM #232300), più di 500 e 200 mutazioni di senso sbagliato sono stati segnalati1,2,3 , rispettivamente, che corrisponde a circa il 60% del conteggio totale mutazione. Numerose nuove varianti del gene ancora stanno identificandi, molte delle quali hanno ignoto significato. I vasti studi biochimici hanno rivelato che alcuni genotipi non conducono ad una completa perdita di funzione del gene GLA (OMIM * 300644) nella malattia di Fabry, ma causare l'enzima corrispondente a non riuscire a raggiungere uno stato termodinamicamente favorito pieghevole4 . Ciò provoca ritenzione di ER e degradazione prematura dell'enzima altrimenti funzionale. Simili conclusioni sono state tratte in altre malattie da accumulo lisosomiale, tra cui Pompe malattia5. Inoltre, caratterizzazione molecolare delle varianti di enzima può facilitare l'interpretazione clinica delle mutazioni al momento della diagnosi6, suggerendo che la progressione di LSD è un processo individuale sulla base della natura della mutazione. Di conseguenza, la classificazione convenzionale in diversi tipi clinici in genere 2 o 3 dovrebbe essere rivalutata al fine di ottimizzare la consulenza clinica e le decisioni terapeutiche.
Enzimatica sostitutiva (ERT) è disponibile per entrambe le malattie. ERT, tuttavia, ha limitato l'efficacia nei tessuti/organi colpiti come il cervello e muscolo scheletrico. Inoltre, ERT può suscitare una risposta immunogenica che compromette i suoi benefici terapeutici. Chaperoni farmacologici (pz) sono un'alternativa attraente di trattamento per i pazienti con mutazioni reattive cosiddette. Pz servire come un'impalcatura molecolare per la piegatura della proteina corretta e stabilizzazione che a sua volta impedisce la ritenzione del reticolo endoplasmatico (ER) ed ER-collegata di degradazione dell'enzima. Inoltre, il PC può essere somministrato per via orale e sono potenzialmente in grado di attraversare la barriera ematoencefalica. Di conseguenza, PCT potrebbe essere un'opzione più praticabile per il trattamento di pazienti con determinati genotipi. Per un'ampia rassegna su applicazione PC nelle malattie da accumulo lisosomiale, consultare l'eccellente recensione di Parenti7.
La scoperta di centinaia di malattia che causa gli alleli del mutante sfida test anti-droga pre-clinica e richiede una valutazione semplice, veloce e altamente standardizzata dei pazienti suscettibili di un approccio di medicina personalizzata. Al fine di valutare gli effetti nocivi delle mutazioni di gene di LSD e di testare le mutazioni candidato per predire i pazienti suscettibili per PCT, è stato un sistema altamente standardizzati over-espressione in cellule di HEK293H che consente la misurazione dell'attività dell'enzima veloce e affidabile sviluppato. Sistemi simili di sovra-espressione precedentemente sono stati descritti per la malattia di Fabry e Pompe utilizzando COS-78,9,10,11, HeLa cellule12o HEK29313 ,14,15,16 celle per il gene di glicosidasi.
Un metodo molto simile è stato brevettato anche come un "metodo per predire la risposta al trattamento farmacologico Chaperone di malattie"17 che indica la pertinenza di una cella cultura sistema in grado di essere integrati nella pratica clinica.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di mutagenesi sito-diretto QuikChange II XL&nbsp;</td><td>Stratagene, La Jolla, CA, USA</td><td>#200522</td><td></td></tr><tr><td>Primer GLA[R301Q]-frw: 5&acute;- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[R301Q]-rev: 5&acute;- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&acute;-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-rev: 5&acute;-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&acute;-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A143T]-rev: 5&acute;-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-frw: 5&acute;-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-rev: 5&acute;-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-frw: 5&acute;-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&acute;-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[L552P]-frw: 5&acute;-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&acute;-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>T7: 5&acute;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>BGHrev: 5&acute;-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania</td><td>n.a.Tryptone</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>103.753</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.049.360.500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.058.330.250</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Glucosio monoidrato</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.083.422.500</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.064.980.500</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>3908.2</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>X863.3</td><td></td></tr><tr><td>idrogeno fosfato disodico</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.065.860.500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.062.640.050</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>X969,2</td><td></td></tr><tr><td>LB Medio</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>X968,2</td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>ZymoResearch, Friburgo, Germania</td><td>D4020</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>HEK293H linea cellulare</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germania</td><td>11631-017&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acuto; s Aquila modificata media&nbsp;</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germania</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino HyClone&nbsp;</td><td>GE Healthcare, South Logan, Utah, USA</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germania</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Palloni standard CELLSTAR per colture cellulari, Greiner Bio One</td><td>VWR International GmbH, Hannover, Germania</td><td>82050-854</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari (24 pozzetti</td><td>)Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Germania</td><td>831.836</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti Cellstar</td><td>Greiner bio one, Frickenhausen, Germania</td><td>655185</td><td></td></tr><tr><td>Provette di reazione SafeSeal, 1,5mL&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Germania</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germania</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>1-Deossigalattojirimicina cloridrato</td><td>Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania</td><td>D9641</td><td></td></tr><tr><td>1-desossigalattojirimicina cloridrato&nbsp;</td><td>Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada</td><td>D236500</td><td></td></tr><tr><td>1-deossinojirimicina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania</td><td>D9305</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco senza calcio, senza magnesio</td><td>Biochrom, Berlino, Germania</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Germania</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Germania</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferone</td><td>Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbelliferile &alfa;-D-galattopiranoside</td><td>Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania</td><td>M7633</td><td></td></tr><tr><td>4-metilombrelliferile &alfa;-D-glucopiranoside</td><td>Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania</td><td>M9766</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator type T6</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany</td><td>n.a.Luminous</td><td></td></tr> <tr><td>Plate Gr. 2 E</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>P265.1</td><td></td></tr><tr><td>3130 xl Genetic Analyzer&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Darmstadt, Germania</td><td>n.a.GFL-3032</td><td></td></tr> <tr><td>agitatore batterico</td><td>GFL, Burgwedel, Germania&nbsp;</td><td>n.a.Avanti</td><td></td></tr> <tr><td>J-25 centrifuga</td><td>Beckman/Coulter, Krefeld, Germania</td><td>n.a.Ultraspec</td><td></td></tr> <tr><td>3100 pro Spettrofotometro</td><td>Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Regno Unito</td><td>n.a.water-jacket</td><td></td></tr> <tr><td>incubator&nbsp;</td><td>Binder, Tuttlingen, Germania</td><td>n.a.Vortex</td><td></td></tr> <tr><td>Genie 1 miscelatore a sfioramento</td><td>Scientific Industries, Bohemia, NY, USA</td><td>n.a.Z</td><td></td></tr> <tr><td>233 MK-2 centrifuga a microprovette refrigerata</td><td>Hermle, Tuttlingen, Germania&nbsp;</td><td>n.a.Dispositivo</td><td></td></tr> <tr><td>per acqua ultrapura LaboStar</td><td>Siemens, Berlino, Germania</td><td>n.a.Agitatore</td><td></td></tr> <tr><td>termico PST-60HL-4 agitatore orbitale</td><td>Biosan, Riga, Lettonia</td><td>n.a.Tecan</td><td></td></tr> <tr><td>GENios Reader</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, Svizzera</td><td>n.a.HI</td><td></td></tr> <tr><td>223 Misuratore di pH a microprocessore</td><td>HANNA Instruments, Arvore, Portogallo</td><td>n.a.CASY</td><td></td></tr><<tr><td>br/> Contatore di cellule + Sistema di analisi Modello TT</td><td>Innovatis AG, Cham/Zug, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Azienda</td><td>Numero di catalogo<td>>Commenti</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magellan software di analisi dei dati v6.6</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, Svizzera</td><td>n.a.GraphPad</td><td></td></tr> <tr><td>Prism 5.04</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA</td><td>n.a.Microsoft</td><td></td></tr> <tr><td>Office 2010</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td><td>n.a.BioEdit</td><td></td></tr> <tr><td>Alignment Editor, V7.0.1</td><td>http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Abbreviations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>frw = forward; rev = reverse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>n.a. = non applicabile</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro misurazione di enzima per test farmacologici chaperone reattività in fabry e malattia di pompe

In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease

L'uso della medicina personalizzata per il trattamento di malattie monogeniche rare come disturbi connessi all'accumulo lisosomiale (LSD) è sfidato da disegni di trial clinici complessi, costi elevati e basso numero di pazienti. Centinaia di alleli mutanti è implicati nella maggior parte delle malattie da accumulo lisosomiale. Le malattie sono in genere classificate in 2 o 3 tipi clinici differenti secondo la severità. Inoltre, caratterizzazione molecolare del genotipo può aiutare a predire gli esiti clinici e informare la cura del paziente. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un saggio di cultura cellulare semplice basato su cellule HEK293H heterologously che sovraesprimono le mutazioni identificate nella malattia di Fabry e Pompe. Un dosaggio simile recentemente è stato introdotto come un test preclinico per identificare mutazioni favorevoli per la terapia Chaperone farmacologici (PCT) nella malattia di Fabry. Questo manoscritto descrive un'analisi di cultura cellulare modificato che consente la rapida valutazione fenotipica delle varianti alleliche nella malattia di Fabry e Pompe per identificare i pazienti eleggibili per PCT e può essere di aiuto nello sviluppo del romanzo pharmacochaperones.

La procedura di mutagenesi Per valutare l'efficienza di mutagenesi gene GLA , le mutazioni sono state classificate in una delle categorie seguenti. Questo approccio per generare mutazioni ha rivelato che circa il 66,5% delle mutazioni GLA sono stati ottenuti nel primo tentativo. Un ulteriore 25% potrebbe essere ottenuto dopo una PCR seconda leggermente modificata.
Categoria 1: La mutagenesi ...

C'è una domanda per fare pre-clinica test per una nuova classe di farmaci "orfani" chiamato chaperoni farmacologici riproducibile, veloce ed efficiente. Abbiamo sviluppato un test cellulari semplice, altamente standardizzate e versatile cultura alla schermata per i pazienti eleggibili come pure droghe romanzo chaperoni farmacologici.

In Vitro Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe

The use of personalized medicine to treat rare monogenic diseases like lysosomal storage disorders (LSDs) is challenged by complex clinical trial designs, ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di coltura cellulare modificato è quello di fornire una rapida valutazione fenotipica della varianza allelica nella malattia di Fabry e Pompe. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie da accumulo lisosomiale, come gli esiti prognostici e le decisioni terapeutiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente riproducibile e che può aiutare nello sviluppo di nuovi farmaci, come i farmaco-chaperoni.Per effettuare la mutagenesi sito-specifica, iniziare utilizzando le sequenze di riferimento NM 00169.2 e NM 00152.4 come modelli per la mutagenesi dei geni GLA e GAA, rispettivamente. Utilizza lo strumento gratuito Primer Design per supportare la progettazione di primer. Quindi, avere una serie di primer ad alta purezza e privi di sale sintetizzati da un fornitore commerciale, con primer senso e antisenso che portano una delle rispettive modifiche di sequenza, fondamentali per la loro lunghezza, per introdurre individualmente la mutazione.Preparare la miscela di reazione in un volume di 50 microlitri ed eseguire il programma PCR utilizzando le condizioni standard fornite dal produttore e come elencato nel protocollo di testo. Dopo la PCR, aggiungere un microlitro di enzima di restrizione Dpn1 e continuare a incubare le fiale di reazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo aver trasformato il DNA plasmatico in cellule di E.coli competenti e aver preparato i plasmidi della trasformazione desiderata secondo il protocollo di testo, utilizzare uno strumento di biologia molecolare adatto per analizzare la sequenza.Quando viene rilevata la mutazione desiderata e non si osservano ulteriori anomalie di sequenza rispetto a NM 000169.2 per l'alfa-galattosidasi A o NM 000152.4 per l'alfa-galattosidasi acida, selezionare il clone per la purificazione plasmidico di grado trasfezione. Determinare la purezza del DNA misurando l'assorbanza in uno spettrofotometro. Dopo la coltivazione di cellule HEK293H in un pallone di coltura T75 secondo il protocollo di testo, 24 ore prima della trasfezione, utilizzare PBS senza calcio o magnesio per lavare le cellule una volta.Con lo 0,05% di tripsina-EDTA, raccogliere le cellule e nelle cavità di una piastra di coltura a 24 pozzetti utilizzare 500 microlitri di DMEM integrato con il 10% di FBS per seminare 1,5 volte 10 nelle cinque cellule. Eseguire la trasfezione cellulare secondo il manuale del produttore. Utilizzando una miscela di un microgrammo di DNA plasmidico disciolto in 100 microlitri di DMEM privo di siero e 2,5 microlitri di reagente di trasfezione.Incubare la soluzione per 20 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungerla alle cellule in modo gocciolato. Dopo un periodo di quattro ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2, rimuovere il terreno contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 500 microlitri di DMEM fresco con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Come opzione durante questo passaggio, aggiungere DGJ o DNJ al terreno di coltura dove previsto.Il giorno del raccolto, rimuovere le cellule dall'incubatrice. Quindi aspirare il terreno e utilizzare PBS con calcio e magnesio per lavare accuratamente le cellule due volte. Questo passaggio è fondamentale perché DGJ e DNJ sono inibitori di entrambi gli enzimi e quindi qualsiasi avanzo invaliderebbe il test.Dopo il lavaggio, aggiungere 200 microlitri di acqua deionizzata direttamente sopra le celle. Quindi sciacquare le cellule dalla piastra e trasferirle in una provetta di reazione da 1,5 millilitri. Posizionare i campioni in un apposito rack di schiuma e farli vorticare per cinque secondi per rendere la lisi più efficiente.Quindi alternare i campioni tra azoto liquido per 10 secondi e un bagno d'acqua a temperatura ambiente fino al completamento dello scongelamento. Dopo aver ripetuto la procedura di omogeneizzazione cinque volte, centrifugare i campioni per cinque minuti a 10.000 g. Quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta di reazione.Per effettuare il test BCA, preparare una provetta nuova per ogni campione contenente 40 microlitri di H20 deionizzato e aggiungere 10 microlitri di campione. Mescolare ogni soluzione agitando brevemente e trasferire 10 microlitri di ciascun campione in triplicato nelle cavità di una piastra a 96 pozzetti. Per preparare una curva standard, diluire una soluzione madre BSA da 2 milligrammi per millilitro e deionizzare l'H2O secondo il protocollo di testo.Dopo aver combinato il reagente A e il reagente B, avviare la reazione aggiungendo 200 microlitri della soluzione di reagente BCA e incubare i campioni al buio a 37 gradi Celsius e 300 giri/min su un agitatore orbitale per un'ora. Quindi misurare l'assorbanza a 560 nanometri in un lettore di piastre. I campioni contengono in genere da uno a 1,5 microgrammi di proteine per microlitro.Diluire la quantità calcolata di ciascun campione e pipettarlo in provette di reazione fresche da 1,5 millilitri per ottenere 0,05 microgrammi di alfa-galattosidasi A o 0,5 microgrammi di alfa-glucosidasi acida per microlitro di soluzione. Agitare nuovamente i campioni per cinque secondi e pipettare 10 microlitri di questa diluizione in duplicato in una piastra a 96 pozzetti. Avviare le reazioni aggiungendo 20 microlitri della rispettiva soluzione di substrato.Per l'alfa-galattosidasi A, aggiungere due millimolari di 4-metilumbelliferil alfa-D galattopiranoside, o 4-MU-gal, in tampone fosfato-citrato molare 0,06, pH 4,7. Per l'alfa-glucosidasi acida, aggiungere 2 millimolari di 4-metilumbelliferil alfa-D glucopiranoside, o 4-MU-glu, in acetato di sodio 0,025 molari, pH 4,0. Incubare le reazioni enzimatiche per un'ora al buio a 37 gradi Celsius e 300 giri/min su un agitatore orbitale.Quindi terminare la reazione aggiungendo 200 microlitri di tampone glicina sodico-idrossido aggiustato a pH 1,0 molare 10,5. Preparare una curva standard di 4-MU da un impasto di 0,01 milligrammi per millilitro secondo il protocollo di testo e pipettare 10 microlitri di soluzioni in duplicato in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 200 microlitri di tampone glicina sodico-idrossido molare da 1,0 molari a ciascun pozzetto per regolare il volume e il pH.Infine, misurare l'attività enzimatica in un lettore di florescenza dotato del set di filtri appropriato. E analizza i dati utilizzando il software appropriato per il dispositivo di lettura della fluorescenza. Per valutare l'efficienza della mutagenesi del gene GLA, le mutazioni sono state classificate in tre categorie e hanno rivelato che circa il 66,5% è stato ottenuto al primo tentativo.Un ulteriore 25% potrebbe essere ottenuto dopo una seconda PCR leggermente modificata. Nella terza categoria, è stato necessario intraprendere uno sforzo maggiore, come la riprogettazione del primer, per produrre il clone desiderato. Questa tabella si riferisce ai risultati della misurazione dell'attività enzimatica per tre mutazioni dell'alfa-galattosidasi A e tre dell'alfa-glucosidasi acida non trattate o trattate con DGJ e DNJ.I dati vengono visualizzati come valori assoluti per il turnover del substrato e hanno valori relativi normalizzati all'enzima wild-type. I dati sull'attività enzimatica assoluta sono stati corretti per l'attività enzimatica endogena delle cellule HEK293H utilizzando cellule trasfettate con un vettore pcDNA 3.1 vuoto. I valori di attività enzimatica sono stati normalizzati in enzima wild-type da esperimenti corrispondenti, il che spiega la deviazione dei valori relativi tra i diversi mutanti.Una volta padroneggiata, la frazione di coltura post-cellulare di questo esperimento, che rappresenta la maggior parte del tempo pratico, può essere eseguita entro quattro ore. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie da accumulo lisosomiale per esplorare le correlazioni genotipo-fenotipo nella malattia di Fabry e nella malattia di Pompe. Questo protocollo può aiutare nello sviluppo di nuovi farmaci nelle malattie da accumulo lisosomiale.

in-vitro-enzyme-measurement-to-test-pharmacological-chaperone

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

In questo protocollo un metodo per misurare ripiegamento delle proteine ​​intracellulari dopo shock termico è descritto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare foldases come chaperon molecolari e la loro co-fattori o composti in grado di influenzare la loro attività. Attività Firefly luciferasi viene utilizzato come reporter per misurare l'attività ripiegamento accompagnatore.

Ripiegamento di analisi intracellulari

Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L'approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

Questo video dimostra la misurazione in vitro dell'attività enzimatica per la α-galattosidasi A e l'acido α-glucosidasi in campioni utilizzando substrati sintetici di 4-metilumbelliferile.

Misurazione in vitro dell'attività enzimatica della α-galattosidasi A e dell'acido α-glucosidasi

Vi presentiamo un protocollo per lo studio in vitro delle pompe di efflusso da Pseudomonas aeruginosa. Questo protocollo consente la generazione di un robusto, reversibile e regolabile gradiente protonico all'interno della membrana del liposoma e quindi dovrebbe essere adattabile a qualsiasi proteina di membrana eccitato dalla forza protomotive.

In vitro Indagine della MexAB Efflux pompa da Pseudomonas aeruginosa

Il presente rapporto descrive un test enzimatico in vitro per misurare l'attività della fosfatidiletanolammina metiltransferasi utilizzando estratti cellulari di Leishmania. Questo test si basa sul trasferimento di un gruppo metilico radioattivo dalla S-[metil-3H]adenosil-L-metionina alla fosfatidiletanolammina endogena.

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

Descriviamo un protocollo di base per quantificare l'attività dell'ATPasi in vitro. Questo protocollo può essere ottimizzato in base al livello di attività e ai requisiti di una data ATPasi purificata.

misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Attività ATPasi per enzimatica Caratterizzazione

Questo lavoro dimostra la fattibilità di una tecnica di spettroscopia di risonanza magnetica al fosforo-31 in vivo (31PMRS) per quantificare la capacità di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) nel muscolo scheletrico umano.

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare In Vivo Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Presentato qui è un metodo semplice per misurare l'attività delle chitinasi nei fluidi biologici come la lavanda bronchoalveolare o il siero.

Misurazione dell'attività della chitinasi nei campioni biologici

Questo protocollo presenta una tecnica per sondare le interazioni proteina-proteina utilizzando perle donatrici legate al glutatione con co-chaperoni tPR fusi GST e perle accettori accoppiate con un peptide derivato da Hsp90. Abbiamo usato questa tecnica per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.

Studi di interazioni Chaperone-Cochaperone utilizzando il saggio omogeneo basato su perle

Questo protocollo descrive una batteria di metodi che include la cromatografia analitica di esclusione dimensionale per studiare l'oligomerizzazione e la stabilità dell'istone chaperone, il saggio pull-down per svelare le interazioni chaperone-istone degli istoni, l'AUC per analizzare la stechiometria dei complessi proteici e il saggio di chaperoning degli istoni per caratterizzare funzionalmente un presunto chaperone istonico in vitro.

In vitro Caratterizzazione degli Chaperoni degli istoni mediante saggi analitici, pull-down e chaperoning

Questo protocollo spiega come misurare l'effetto della variazione genetica associata ai disturbi dello sviluppo neurologico sull'attività dell'enzima deubiquitilante combinando la purificazione di proteine ricombinanti con saggi di scissione della catena dell'ubiquitina.

Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Impara a misurare l'attività enzimatica in vitro per testare la reattività dei chaperone farmacologici nelle malattie di Fabry e Pompe. Questo metodo cellulare altamente riproducibile facilita lo screening di nuovi farmaci e le decisioni terapeutiche.

In Vitro Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe

Esplora altri video