Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo
3 novembre 2017
Questo protocollo descrive l'utilizzo coltivate Aorta-gonade-Mesonephros per analisi di espressione, unità formanti colonia in cultura e milza e ricostituzione a lungo termine per determinare l'effetto di fattori regolatori e vie di segnalazione su staminali ematopoietiche sviluppo delle cellule. Questo è stato dimostrato come un sistema efficace per lo studio della funzione e biologia delle cellule staminali ematopoietiche.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di utilizzare una coltura di espianti di aorta-gonade-mesonephros per studiare i regolatori critici dello sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia e nei campi funzionali delle HSC su come identificare i fattori coinvolti nella regolazione dello sviluppo delle HSC nei mammiferi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questi regolatori possono essere verificati attraverso l'analisi dell'espressione del DNA e la capacità di formazione delle colonie e la capacità di ricostituzione delle HSC.
Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la separazione precisa dell'AGM dai tessuti circostanti nella regione del tronco richiede pratica per essere padroneggiata. Prima di iniziare la procedura, posizionare le reti di acciaio inossidabile nei singoli pozzetti di una piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di terreno integrato con fluoxetina appena preparato per pozzetto. Posizionare un filtro sterilizzato UV da 0,65 microlitri per pozzetto sperimentale in una piastra di coltura cellulare di vetro contenente acqua bollente fresca per due lavaggi di tre minuti, immergendo i filtri in un contenitore di PBS a temperatura ambiente per due minuti dopo ogni lavaggio.
Quindi posizionare un filtro su ciascuna rete d'acciaio all'interfaccia aria-liquido di ciascun pozzetto. Successivamente, usa le forbici da dissezione per strappare l'utero da un topo embrionale incinta di 11 giorni e raccogliere gli embrioni dall'utero. Usando le forbici da dissezione, rimuovere il sacco vitellino, il cordone ombelicale e i visceri dal corpo dell'embrione.
E rimuovere con cura i tessuti nervosi dorsali e i tessuti muscolari circostanti. Usando una pinza rimuovi i tessuti dagli arti anteriori e posteriori. E separare la regione AGM dal corpo dell'embrione.
Quindi posizionare ogni AGM su un singolo filtro all'interfaccia aria-liquido di ciascun pozzetto. Metti le colture in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Dopo due o tre giorni, trasferire i campioni AGM in singole provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti 200 microlitri di collagenasi per la loro dissociazione a 37 gradi Celsius per circa 20 minuti con agitazione ogni cinque minuti.
Al termine della digestione interrompere le reazioni con 200 microlitri di siero per espianto. Trasferire l'intero contenuto di ciascuna provetta in pozzetti individuali di una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti contenente da 500 a 600 microlitri di terreno M3434 per pozzetto. Mescolare le cellule in ogni pozzetto con una siringa da un millilitro senza ago.
Posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Il numero di unità formanti colonie all'interno di ciascun pozzetto può quindi essere valutato dopo sette-10 giorni di coltura. Per il trapianto di espianti AGM in vivo dopo due o tre giorni di coltura AGM, come appena dimostrato, eradiare letale da otto a 10 settimane maschio C57 nero sei topi con nove grigi di radiazioni.
Quattro o cinque ore dopo, dissociare gli espianti raccolti in 200 microlitri di collagenasi per campione, come dimostrato. Carico di 0,5 a un embrione equivalente delle sospensioni unicellulari risultanti in una siringa da un millilitro per animale ricevente. Metti il primo topo irradiato in un contenitore e pulisci la coda con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 75% per favorire la vasodilatazione della vena caudale.
Iniettare per via endovenosa l'intero contenuto di una siringa in una vena caudale dilatata. Utilizzare un tampone antisettico per fermare l'emorragia dopo la rimozione dell'ago. Quindi rimetti l'animale nella sua gabbia e inietta l'animale successivo.
11 giorni dopo il trasferimento adottivo, la milza può essere fissata nella soluzione di Bouin per l'enumerazione macroscopica delle colonie di milza visibili. Le colture AGM integrate con fluoxetina dimostrano un aumento dell'espressione di Runx1, un gene cardine per lo sviluppo delle HSC a livello di mRNA e di espressione proteica. La fluoxetina può anche aumentare significativamente la capacità di formazione di colonie di HSC nell'AGM, inclusi eritroidi unità di formazione di esplosioni, monociti granulari di unità formanti colonie e granulociti di unità formanti colonie, eritrociti, macrofagi e megacariociti.
Inoltre, il trapianto in vivo di HSC trattate con fluoxetina isolate da espianti di AGM determina un aumento del numero di colonie nella milza di animali riceventi adulti irradiati. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come isolare l'AGM ed eseguire una coltura di espiantazione AGM per l'identificazione dei regolatori critici dello sviluppo delle HSC all'interno dell'AGM.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso dell'aorta-gonade-mesonefro (AGM) coltivato per analisi di espressione e unità formanti colonie allo studio dello sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Si tratta di un sistema efficace per indagare i fattori regolatori e le vie di segnalazione coinvolte nella biologia delle HSC.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali ematopoietiche
- Tecniche di coltura cellulare
- Fattori regolatori nello sviluppo
Sfondo
- La regione AGM è cruciale per lo sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) nei mammiferi.
- Comprendere la regolazione delle HSC può portare a progressi nella medicina rigenerativa.
- Il saggio di formazione di colonie è essenziale per valutare la funzionalità delle HSC.
- La separazione dell'AGM dai tessuti circostanti richiede abilità e pratica.
Scopo dello studio
- Studiare i regolatori fondamentali dello sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche (HSC).
- Identificare i fattori coinvolti nella regolazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC).
- Migliorare la comprensione della biologia e della funzione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC).
Metodi Utilizzati
- Tecniche di coltura di espianti da AGM.
- Analisi dell'espressione del DNA per la verifica dei fattori regolatori.
- Saggi di formazione di colonie per valutare la capacità delle cellule staminali ematopoietiche.
- Studi di ripristino a lungo termine.
Risultati principali
- Identificazione dei principali fattori regolatori che influenzano lo sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche (HSC).
- Verifica dei fattori mediante analisi dell'espressione genica del DNA.
- Dimostrazione con successo della capacità di formazione di colonie nelle HSC coltivate.
- Approfondimenti sui percorsi di segnalazione coinvolti nella biologia delle HSC.
Conclusioni
- Il sistema di coltura AGM è efficace per lo studio dello sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche (HSC).
- Comprendere i fattori regolatori può orientare le strategie terapeutiche.
- Questo metodo fornisce una piattaforma per la ricerca futura nell'ematopoiesi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il sistema di coltura espiantata dell'AGM risolve un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca sulle cellule staminali ematopoietiche (HSC), consentendo studi meccanicistici senza richiedere modelli knock-out germinale. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi nella fase iniziale della scoperta, permettendo esperimenti di recupero farmacologico o genetico in un nicchia embrionale fisiologicamente rilevante. Migliora la fiducia predittiva nell'identificazione dei regolatori essenziali dello sviluppo delle HSC, orientando le decisioni di portafoglio in settori terapeutici focalizzati sull'ematopoiesi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche testando il coinvolgimento di fattori nella regolazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) mediante esperimenti di recupero in contesti di knock-out (KO).
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per verificare i cambiamenti nell'espressione del DNA e le risposte funzionali, come la formazione di colonie, riducendo la dipendenza da modelli in vivo costosi.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico collegando perturbazioni molecolari a risposte funzionali delle HSC, come la capacità di ripristino.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative multicellulari, incluse colonie CFU-E, CFU-GM e megacariociti, per valutare gli effetti del composto sulla differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC).
- Valore operativo: Standardizza la valutazione funzionale delle HSC mediante conteggio delle unità formanti colonie dopo 7–10 giorni, consentendo la scalabilità del saggio su librerie di composti.
- Valore traslazionale: Prepara popolazioni di HSC validate per studi successivi di trapianto, collegando la scoperta alla validazione preclinica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la patologia preservando la nicchia ematopoietica embrionale, consentendo lo studio dei meccanismi di sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) nei mammiferi.
- Valore operativo: Favorisce la continuità dalla fase di scoperta al lavoro preclinico generando HSC trapiantabili con comprovato potenziale di ripristino in soggetti riceventi irradiati.
- Contenimento del rischio: Permette la validazione funzionale di bersagli prima di costosi studi in vivo, migliorando la sicurezza delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La coltura di espianti dell'AGM si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto promettente fino alla validazione preclinica, in particolare per i programmi di ematopoiesi e medicina rigenerativa.
- Biologia della scoperta Facilita il test delle ipotesi relative a vie di segnalazione e regolatori trascrizionali coinvolti nell'emergenza e nell'espansione delle cellule staminali ematopoietiche.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi, basati su fluorescenza o microscopia, relativi alle colonie, che supportano l'analisi dose-risposta e la conferma dei risultati positivi.
- Analitica: Consente una valutazione multiparametrica mediante l'espressione di mRNA/proteine (ad esempio, Runx1), la morfologia delle colonie e le unità di ripopolamento in vivo.
- Ricerca traslazionale Collega i risultati meccanicistici alla continuità preclinica attraverso la dimostrazione di una ripopolazione a lungo termine in modelli di trapianto competitivo.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per la validazione iterativa di bersagli in progetti multipli nei settori terapeutici delle cellule staminali e dei disturbi ematici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nei bersagli collegando interventi molecolari a fenotipi funzionali delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) in un sistema sviluppativamente accurato.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a protocolli standardizzati per l'isolamento, la coltura e la dissociazione degli espanti, riducendo la variabilità nei saggi funzionali.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati ai bersagli delle HSC, minimizzando i fallimenti tardivi dovuti alla mancanza di informazioni meccanicistiche.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio fornendo dati funzionali sulla capacità di autorenovazione e differenziazione delle HSC per il classificazione dei bersagli.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione embriologica e nelle tecniche di microchirurgia per isolare la regione AGM senza contaminazione da tessuti circostanti.
- È dipendente da infrastrutture sterili per la coltura cellulare, inclusi incubatori a CO2, piastre con superficie non aderente e filtrazione sterile per il mezzo e i reagenti.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per il posizionamento degli espianti, i tempi di digestione con collagenasi e i criteri di valutazione delle colonie, al fine di garantire la comparabilità dei dati.
- L'adattamento a modelli non murini può essere limitato dal tempo embriologico e dall'accessibilità ai tessuti specifici per ciascuna specie, richiedendo una validazione in ogni sistema.
- I vincoli pratici includono la breve finestra temporale embriologica (E10,5–E11,5 nei topi) per l'isolamento dell'AGM, che influisce sul rendimento e sulla pianificazione negli studi di scoperta.
