Name: Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nellematopoiesi inerente allo sviluppo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Impara la coltura di esplanti AGM per studiare lo sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica e la formazione di colonie per identificare i fattori regolatori chiave.

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Ringraziamo Suwei Gao per aiuto nella preparazione di figura. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Foundation Natural Science of China (81530004, 31425016) e il Ministero della scienza e tecnologia della Cina (2016YFA0100500). J.L. eseguito gli esperimenti e redatto il manoscritto; F.L. modificato il manoscritto. Entrambi gli autori letto ed approvato il manoscritto finale.

tutte le procedure tra cui animali soggetti sono state approvate dal comitato etico di recensione all'Istituto di zoologia, Accademia delle scienze cinese, Beijing, China.
 1. preparazione dei materiali <ol><li>sterilizzare il 0,65 µm filtri con raggi ultravioletti raggi prodotti sotto i raggi ultravioletti ray lampada sul banco pulito per 4 h e capovolgere i filtri dopo il segno di 2 h. 
	Nota: Quando si lavora con luce UV, indossare una protezione appropriata.</li>
	<li>Sterilizzare le maglie in acciaio inox con la sterilizzatrice autoclave a 121 ° C per 30 min. 
	Nota: Una certa altezza della maglia dell'acciaio inossidabile è necessaria per supportare i filtri all'interfaccia aria-liquido e questo può essere realizzato con il filo sulla mesh in acciaio ( Figura 1 A).</li>
	<li>Fluoxetine diluire ad una concentrazione finale di 10 µM nella M5300 a lungo termine cultura medio e mescolare in modo uniforme. 
	Nota: Per una piastra a 6 pozzetti, terreno di coltura a lungo termine 2 mL M5300 è adatto per ogni pozzetto. Idrocortisone a 10 -6 M può essere diluito in modo selettivo nel medium.</li>
	<li>Trasferire supplementato con fluoxetina a 10 µM in piastre da 6 pozzetti o piatti e mettere le maglie in acciaio inossidabile sterilizzato nel medium.</li>
	<li>Lavare i 0,65 µm filtri con acqua bollente due volte per 3 minuti ogni volta nella piastra di coltura di cellule di vetro per la sterilizzazione. Dopo ogni lavaggio, inserire i filtri in tampone fosfato salino (PBS) per 2 minuti e posto sul bagnato filtri in acciaio inox maglie in piedi all'interfaccia aria-liquido come mostrato in Figura 1 A [schematica nel centro della]. 
	Nota: Acqua bollente può essere generato con la sterilizzatrice autoclave per raggiungere l'asepsi e l'apparecchiatura dovrebbe essere presa fuori dell'autoclave in modo tempestivo per evitare una diminuzione della temperatura.</li>
</ol> 2. AGM Explant Culture <ol><li>attentamente separare le regioni AGM da embrioni e 10.5 o E11 con il forcipe.
	<ol><li>Striscia uteri dai topi incinto con le forbici per dissezione e separare gli embrioni dagli uteri.</li>
		<li>Togliere il sacco vitellino, il cordone ombelicale e visceri dal corpo dell'embrione.</li>
		<li>Rimuovere con cautela il nervo dorsale tessuti e tessuti muscolari circostanti.</li>
		<li>Cut off i tessuti con il forcipe presso il sito degli arti anteriori e posteriori e separare la regione AGM dal corpo dell'embrione. figure 1 B-C Visualizza la rappresentazione schematica e la morfologia dell'AGM dissecata.</li>
	</ol></li> <li>Explant le assemblee dissecate separatamente sui filtri all'interfaccia aria-liquido ( Figura 1 A) e cultura 5% CO 2 a 37 ° C per 2-3 giorni. 
	Nota: Non posizionare il AGM dissecata sul filo della maglia d'acciaio e assicurarsi che i filtri siano all'interfaccia aria-liquido durante la coltura. Oltre l'AGM, sacco vitellino e fegato fetale possono essere coltivate con questo sistema 7.</li>
</ol> 3. Analisi dell'espressione <ol><li>livello di mRNA <ol><li>raccogliere le assemblee coltivate in 1 mL di PBS e centrifugare a 4 ° C, 310 x g per 6 min.</li>
		<li>Dopo aver rimosso il supernatante, RNA totale è estratto dalle assemblee raccolte con una soluzione monofasica di fenolo, secondo il produttore &#39; istruzioni s.</li>
		<li>RNA totale (2 µ g) quindi è inverso trascritto usando il transcriptase di M-MLV per ottenere cDNA come modello. L'analisi di PCR quantitative in tempo reale sono eseguite con SYBR Green e Gapdh viene utilizzato come controllo interno.</li>
	</ol></li> <li>Livello della proteina <ol><li>raccogliere l'AGM coltivate come descritto sopra al punto 3.1.1.</li>
		<li>Preparare la proteina da AGM coltivate con il buffer di lisi delle cellule (10 mM Tris-HCl 10 mM NaCl e 0,5% NP-40) contenente l'inibitore della proteasi e uso per macchiarsi occidentale per rilevare il livello della proteina come precedentemente descritto 13.</li>
	</ol></li></ol> 4. Unità formanti colonie nell'analisi della cultura (CFU-C) <ol><li>dopo la coltura per 2-3 giorni, raccogliere le regioni AGM in salino di 1 mL tamponato fosfato (PBS) e centrifugare a 4 ° C, 310 x g per 6 minuti e dissociare con collagenasi 200 µ l (0,1% in PBS) 37 ° C. 
	Nota: Il tempo necessario per collagenasi generare singole sospensioni di cellule è circa 20 minuti. Agitare il tubo contenente AGM ogni 5 minuti possono accelerare il processo di digestione. Collagenasi di 0,1% 200 µ l viene utilizzato per ogni AGM e 200 µ l di siero di 10% viene utilizzato per interrompere la reazione.</li>
	<li>Cultura singole sospensioni di cellule nel mezzo di M3434 in piastre da 24 pozzetti attacco ultra-basso. 
	Nota: Per evitare contaminazioni, penicillina-streptomicina soluzione possa essere selettivamente aggiunta nel mezzo. Perché il mezzo di M3434 è viscoso, una 1,0 cc una siringa senza ago è usata per mischiare le cellule e le medie.</li>
	<li>Dopo 7 - 10 giorni la coltura a 37 ° C in 5% CO 2, il numero per ogni tipo di colonie compreso Burst forming unit--eritroidi (BFU-E), CFU-granulo-monocito (CFU-GM) e CFU-granulociti, eritrociti, macrofagi, megacariocita (CFU-GEMM) si distinguono basata sulla morfologia e ha segnato con un microscopio invertito ( Figura 2 C).</li>
</ol> 5. In Vivo Dosaggio di trapianto <ol><li>formanti colonie (CFU-S) unità-milza dosaggio <ol><li>dopo 2 - 3 giorni di coltura explant, raccogliere le assemblee e preparare sospensioni di cellule singole incubando con collagenasi 200 µ l (0,1% in PBS) per 20 min.</li>
		<li>Eseguire irradiazione letale (9 Gy di raggi x) di 8 - ai 10 - settimana-vecchi topi C57BL/6 maschi 4-5 ore prima dell'iniezione di cellule.</li>
		<li>Mettere il mouse irradiato in un dispositivo di ritenuta per limitare la sua attività.</li>
		<li>Pulire la coda usando un batuffolo di cotone intriso di alcool di 75% per promuovere la vasodilatazione della vena.</li>
		<li>Iniettare 0,5 embrione equivalente (ee) o sospensioni di cellule singole 1 ee di AGM per via endovenosa nella vena della coda di topo irradiato con una siringa da 1,0 cc. 
		Nota: Le cellule sono sospesi con PBS e 0,5 mL di PBS per ogni destinatario è un volume adeguato. Un ago di calibro 25 o 26 gauge dimensione viene utilizzato per l'iniezione con una siringa cc 1,0. Aria non può essere introdotto nella siringa. Premere il sito di iniezione con un tampone antisettico per fermare l'emorragia.</li>
		<li>Undici giorni post trapianto, raccogliere e difficoltà le milze dei topi destinatari a Bouin &#39; s soluzione (soluzione acquosa di acido picrico 1,22% saturata 15 mL, 2 mL di metanolo al 40% e 1 mL di acido acetico) per 1-2 giorni e lavare con 80% di alcol per un altro 1-2 giorni. Contare le colonie visibili nella milza in modo macroscopico e determinare il numero di colonie per ee. 
		&#8203; Nota: Bouin &#39; fissativo s, indossare una protezione appropriata.</li>
	</ol></li> <li>Analisi a lungo termine di trapianto <ol><li>dopo 2-3 giorni explant coltura, raccogliere le assemblee e preparare sospensioni di cellule singole incubando con collagenasi 200 µ l (0,1% in PBS) per 20 min.</li>
		<li>Eseguire irradiazione letale (9 Gy di raggi x) di 8 - ai 10 - settimana-vecchi topi C57BL/6 maschi 4-5 ore prima dell'iniezione di cellule.</li>
		<li>Mettere il mouse irradiato in un dispositivo di ritenuta per limitare la sua attività.</li>
		<li>Pulire la coda usando un batuffolo di cotone intriso di alcool di 75% per promuovere la vasodilatazione della vena.</li>
		< lHo > iniettare 0,5 embrione equivalente (ee) o 1 ee singola cellula-sospensioni di AGM per via endovenosa nella vena della coda di un topo irradiato con una siringa cc 1,0. AGM sono iniettati ad una dose di 1 ee per ogni destinatario con 2 × 10 5 le cellule del midollo osseo (CD45.1 sfondo). 
		Nota: L'aria non può essere introdotto nella siringa. Premere il sito di iniezione con un tampone antisettico per fermare l'emorragia.</li>
		<li>Quattro mesi post-trapianto, raccogliere il midollo osseo del destinatario e utilizzarlo per il dosaggio di ricostituzione di FACS. Solo i destinatari con &#8805; 10% chimerismo donatore-derivati sono considerati ad esporre la ricostituzione successo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., Robin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+founder+of+adult+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta.</a> Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells+long-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129, 4891-4899 (2002).</li>
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<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86, 897-906 (1996).</li>
<li>Peeters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+embryonic+tissues+and+Hedgehog+proteins+induce+early+AGM+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development.</a> Development. 136, 2613-2621 (2009).</li>
<li>Taoudi, S., Medvinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+the+ventral+domain+of+the+embryonic+dorsal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.</a> PNAS. 104, 9399-9403 (2007).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+Hedgehog+Regulate+Distinct+AGM+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).</li>
<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stromal+clones+reveal+developmental+regulators+of+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells.</a> PNAS. 104, 20838-20843 (2007).</li>
<li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells%2Fhematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region%2C+with+increased+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li>
<li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li>
<li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784(2016).</li>
<li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li>
<li>Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+swimming+test+and+fluoxetine+treatment%3A+in+vivo+evidence+that+peripheral+5-HT+in+rat+platelet-rich+plasma+mirrors+cerebral+extracellular+5-HT+levels%2C+whilst+5-HT+in+isolated+platelets+mirrors+neuronal+5-HT+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes.</a> Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).</li>
<li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood%3A+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li>
<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
<li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi finanziario.

È noto che HSCs maturo nel midollo osseo può ripopolare il sistema sangue di destinatari irradiati. A differenza di questi HSCs funzionale, le HSCs emergenti in AGM degli embrioni del mouse sono immaturi. Risultati di trapianto diretto ha mostrato quel tipo mi (VE-cad+ CD45– CD41+) e tipo II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs possedere nessuna capacità di ricostituzione20. Sfruttando il sistema di coltura explant AGM, il nascente HSCs nella regione AGM ...

Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule staminali adulte tessuto-specifici che possiedono multilineare potenziale compreso degli eritrociti, mieloidi e cellule linfoidi come pure la capacità di auto-rinnovarsi. Recenti studi hanno dimostrato che i primi HSCs è sorto da una popolazione endoteliale specializzata, nota come endotelio hemogenic (HE), attraverso l'endoteliale di transizione ematopoietico (EHT) presso la parete ventrale dell'aorta dorsale1,2 ,3,4. Una volta formato regione aorta-gonade-mesonephros (AGM) da embrionali (E) 10.5 a 12.5 in embrione di topo, HSCs migrare nel fegato fetale per espansione e infine colonizzare il midollo osseo per mantenere l'ematopoiesi adulto per tutta la vita di un individuo 5 , 6. anche se questo è stato studiato per molti anni, i meccanismi di fondo di HSC emersione e sviluppo rimangono in modo incompleto capiti.
A differenza di fecondazione in vitro e sviluppo di embrioni di zebrafish, lo sviluppo intrauterino degli embrioni del mouse rende lo studio dell'emopoiesi definitiva durante l'embriogenesi molto più scomodo. Anche se gli esperimenti genetici, utilizzando topi knockout (KO) sono comunemente utilizzati, la mancanza di alcuni topi KO anche limita il loro uso nel campo della ricerca ematopoietico. Inoltre, in vivo gli esperimenti di salvataggio non sono facilmente eseguiti nei topi KO. Dal 1996, la cultura di espianto AGM è stata sviluppata per gli studi ematopoietici dai pionieri nel campo7. Con l'aiuto di questo sistema di coltura, tessuti ventrale della regione AGM sono stati identificati per promuovere attività HSC, mentre tessuti dorsale esercitano un opposto effetto8,9. Il sistema di coltura explant AGM è stato applicato anche per determinare i ruoli di serotonina, Mpl, SCF, BMP e Hedgehog signaling in HSC sviluppo10,11,12,13, 14. la cosa importante, è anche un metodo popolare usato per salvare ematopoietici difetti in embrioni mutanti13,15.

<table><tbody><tr><td>durapore 0,65 &micro; m filtri</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>coltura di espianti AGM</td></tr><tr><td>terreno di coltura a lungo termine M5300</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5300</td><td>coltura di espianti AGM</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>Estrazione di RNA</td></tr><tr><td>M-MLV trascrittasi inversa</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>trascrizione inversa</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>inibitore quantitativo della proteasi PCR in tempo reale</td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>55622</td><td>Estrazione proteica</td></tr><tr><td>collagenasi</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>digestione dei tessuti AGM</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 medio</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>CFU-C test</td></tr><tr><td>attacco ultra-basso piastre a 24 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>CFU-C test</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.2 topi</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>CFU-S assay</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1 topi</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Trapianto a lungo termine</td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td> Life <td>Technologines</td><td>8115284</td><td>AGM Collection</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>Coltura di espianti AGM</td></tr><tr><td>anti-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>Trapianto a lungo termine</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>Lampada UV per trapianto a lungo termine</td></tr><tr><td></td><td>Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD</td><td>039-14402</td><td>potenza: 30W</td></tr><tr><td>maglia in acciaio inossidabile</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10&nbsp;</td><td>Diametro apertura: 2,5 mm</td></tr><tr><td>idrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>diluito selettivamente in terreno M5300</td></tr></tbody></table>

applicazione del sistema di coltura explant aorta-gonade-mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

La limitazione dell'utilizzo di embrioni di topo per studi di ematopoiesi è l'inconveniente aggiunto nelle operazioni, che è in gran parte dovuto lo sviluppo intrauterino dell'embrione. Anche se sono convincenti dati genetici da topi knockout (KO), non è realistico per generare topi KO per i geni tutti come necessario. Inoltre, esibendosi in vivo gli esperimenti di salvataggio per consolidare i dati ottenuti da topi KO non è conveniente. Per superare queste limitazioni, la cultura di espianto Aorta-gonade-Mesonephros (AGM) è stata sviluppata come un sistema appropriato per studiare lo sviluppo di cellule staminali ematopoietiche (HSC). Soprattutto per gli esperimenti di salvataggio, può essere utilizzato per recuperare l'ematopoiesi alterata in topi KO. Con l'aggiunta di prodotti chimici appropriati nel mezzo, la segnalazione alterata può essere riattivata o vie di up-regolato possono essere inibite. Con l'uso di questo metodo, molti esperimenti possono essere eseguite per identificare i regolatori critici dello sviluppo di HSC, compreso HSC correlati espressione genica a livelli di mRNA e proteina, capacità di formazione di Colonia e la capacità di ricostituzione. Questa serie di esperimenti sarebbe utile nel definire i meccanismi di fondo essenziali per lo sviluppo di HSC nei mammiferi.

Una recente pubblicazione segnalata serotonina derivato da cellule endoteliale promuove la sopravvivenza di HSCs inibendo la via di pro-apoptotica del AGM13. Per confermare l'effetto di promozione della serotonina sullo sviluppo di HSC, Fluoxetine è stato inclusa. Come un inibitore della ricaptazione di serotonina (SSRI), Fluoxetine è stata dimostrata di inibire il riassorbimento di serotonina in tessuti periferici16,<sup class="x...

Questo protocollo descrive l'utilizzo coltivate Aorta-gonade-Mesonephros per analisi di espressione, unità formanti colonia in cultura e milza e ricostituzione a lungo termine per determinare l'effetto di fattori regolatori e vie di segnalazione su staminali ematopoietiche sviluppo delle cellule. Questo è stato dimostrato come un sistema efficace per lo studio della funzione e biologia delle cellule staminali ematopoietiche.

Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di utilizzare una coltura di espianti di aorta-gonade-mesonephros per studiare i regolatori critici dello sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia e nei campi funzionali delle HSC su come identificare i fattori coinvolti nella regolazione dello sviluppo delle HSC nei mammiferi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questi regolatori possono essere verificati attraverso l'analisi dell'espressione del DNA e la capacità di formazione delle colonie e la capacità di ricostituzione delle HSC.Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la separazione precisa dell'AGM dai tessuti circostanti nella regione del tronco richiede pratica per essere padroneggiata. Prima di iniziare la procedura, posizionare le reti di acciaio inossidabile nei singoli pozzetti di una piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di terreno integrato con fluoxetina appena preparato per pozzetto. Posizionare un filtro sterilizzato UV da 0,65 microlitri per pozzetto sperimentale in una piastra di coltura cellulare di vetro contenente

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

mStrawberry OP9 cellule permettere una valutazione completa di tutte le ES-derivati ​​dalla progenie di co-coltura.

Modificato ES / OP9 Co-Cultura Protocollo prevede Caratterizzazione avanzata di Progeny emopoietiche

Un sistema di coltura 3D per ematopoiesi è descritta utilizzando sangue umano corda e leucemiche cellule del midollo osseo. Il metodo si basa sull'impiego di un poliuretano poroso scaffold sintetico rivestito con proteine ​​della matrice extracellulare. Questa impalcatura è adattabile per soddisfare una vasta gamma di celle.

Ex vivo Mimicry di emopoiesi normale e anormale umana

Questo protocollo descrive la dissezione dell'anlagen tiroideo embrionale di topo e la coltura di espianti su filtri semiporosi o su vetrini plastici per microscopia. Questo sistema è ideale per studiare gli eventi morfogenetici o di differenziazione che si verificano durante lo sviluppo tiroideo di embrioni wild type o knockout ed è suscettibile di esperimenti di guadagno e perdita di funzione.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultura sistema per studiare lo sviluppo della tiroide

La coltura di goccioline verticali ex vivo è un'alternativa alle attuali tecniche sperimentali in vitro e in vivo. Questo protocollo è facile da eseguire e richiede piccole quantità di reagente, consentendo al contempo la capacità di manipolare e studiare la vascolarizzazione, la morfogenesi e l'organogenesi fetale.

Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Questo protocollo descrive un metodo per isolare e coltivare rudimenti metanufricani da embrioni di topo.

Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse

Protocolli per lo studio dell'aorta murino embrionale e perinatale, usando in vivo analisi clonale e destino mapping, espianti aortiche e muscolo liscio isolato cellule sono dettagliate qui. Questi diversi approcci l'espletamento dell'indagine della morfogenesi dell'aorta embrionale e perinatale nello sviluppo normale e la patogenesi in malattia.

Usando In Vivo e del tessuto e delle cellule Explant approcci per studiare la morfogenesi e la patogenesi dell'Aorta embrionale e perinatale

Qui presentiamo la metodologia per l'analisi clonale di cellule staminali ematopoietiche precursori durante lo sviluppo embrionale murino. Combiniamo Indice ordinamento delle singole cellule della regione di aorta-gonade-Mesonefro embrionale con co-coltura delle cellule endoteliali e trapianto per caratterizzare le proprietà fenotipiche e potenziale di attecchimento dei precursori ematopoietici singoli.

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

Questo articolo fornisce un approccio aggiornato al sistema classico pollo quaglia chimera di studiare la formazione di organo, combinando romanzo procedure sperimentali in vitro e in ovo .

Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma

Questo lavoro descrive due metodi per studiare lo sviluppo degli organi, una migliore impostazione dello xenotrapianto sulla membrana corioallantoica (CAM) dagli embrioni aviari che consente la vascolarizzazione di organi embrionali e organoidi coltivati e una nuova direzione z fissa metodo di coltura dell'organo con condizioni sperimentali modificate che consente l'imaging confocale time-lapse ad alta risoluzione.

Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato

Qui vengono descritti quattro metodi per generare organoidi testicolari da cellule testicolari murine neonatale primarie, cioè matrice extracellulare (ECM) e ambienti di coltura 2D e 3D senza ECM. Queste tecniche hanno molteplici applicazioni di ricerca e sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo testicolare e la fisiologia in vitro.

Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Qui, abbiamo stabilito osteo-organoidi in vivo innescati da scaffold di gelatina caricati con proteina morfogenetica ossea 2 per raccogliere cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche per la ricostruzione di un sistema ematopoietico e immunitario danneggiato. Nel complesso, questo approccio può fornire una promettente fonte cellulare per le terapie cellulari.

Approccio osteo-organoide in vivo per la raccolta di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche

Impara la coltura di esplanti AGM per studiare lo sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica e la formazione di colonie per identificare i fattori regolatori chiave.

Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo

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