3D ultrastruttura mitocondriale del muscolo di voli indiretti di Drosophila ha rivelato tramite tomografia dell'elettrone Serial-sezione

L'obiettivo generale di questo video è determinare l'applicazione della tomografia elettronica a sezione seriale per studiare l'ultrastruttura mitocondriale del muscolo del volo indiretto di Drosophila. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare strutturale, come la struttura e la relazione funzionale con i mitocondri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'ultrastruttura cellulare si rivela in tre dimensioni.

Per iniziare l'esperimento, anestetizzare cinque campioni di Drosophola su ghiaccio e immergere ogni mosca in un millilitro di agarosio a basso punto di fusione al 4% in tampone fosfato. Lasciare solidificare l'agarosio con ghiaccio. Quindi, utilizzare un microtomo a lama vibrante per sezionare Drosophola incorporata in gel di agarosio in fette con uno spessore di 100 micrometri.

Immergere le fette in una soluzione fissativa contenente il 2,5% di glutaraldeide in un tampone fosfato molare a punto zero. Lavare le sezioni di tessuto in tre gocce di tampone fosfato, quindi seguire con un lavaggio con due gocce di tampone fosfato al 20% di BSA. Posizionare le sezioni in contenitori d'oro per il congelamento ad alta pressione, o HPF, riempiti con tampone e 20% BSA.

Quindi, caricare il campione contenente i supporti in un congelatore ad alta pressione secondo il manuale dell'utente. Dopo il congelamento, rilasciare i supporti dal supporto sotto azoto liquido e trasferirli in un dispositivo di sostituzione libera raffreddato a una temperatura negativa di 140 gradi Celsius. Eseguire il protocollo di sostituzione libera con il cocktail FS contenente il 2% di glutaraldeide, il 2% di tetrossido di osmio, lo 0,1% di acetato di uranile in acetone.

Incorporare i campioni in resina a temperatura ambiente. Quindi, polimerizzare la resina a 65 gradi Celsius per 16 ore. Tagliare i blocchi del campione per esporre la faccia del blocco desiderata che contiene tessuto.

Quindi, pretrattare particelle d'oro a 10 nanometri con l'1% di BSA per 30 minuti. Lavare e sospendere le particelle d'oro in soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS. Sovrapponi le particelle d'oro su griglie di scorrimento in rame rivestite con pellicola di carbonio per creare marcatori fiduciali.

Taglia sezioni seriali da 200 a 250 nanometri di spessore utilizzando un ultramicrotomo. Quindi, raccogli le sezioni seriali sulle griglie delle fessure utilizzando un anello perfetto per sezioni sottili. Macchiare le sezioni con il citrato di piombo Reynolds per 10 minuti.

Sovrapponi un secondo strato di particelle d'oro fiduciale sulla parte superiore delle sezioni. Caricare la griglia su un supporto per tomografia a doppio asse e inserirla nel microscopio elettronico a trasmissione funzionante a 200 kilovolt. Allineare il microscopio al fuoco eucentrico.

Impostare il software di raccolta automatica dei dati, regolare e allineare il fascio di elettroni con l'impostazione di imaging multiscala, acquisire riferimenti scuri e luminosi della fotocamera in un'area vuota senza pellicola di carbonio con l'impostazione di raccolta della tomografia. Quindi, raccogli un atlante a griglia a basso ingrandimento. Seleziona i mitocondri su sezioni seriali come bersagli per la raccolta della tomografia, acquisisci una serie di inclinazioni da 60 gradi negativi a 60 gradi positivi con incrementi di due gradi sull'asse A per ciascun bersaglio.

Infine, raccogli la seconda serie di inclinazione. Ruotare il portacampioni di 90 gradi. Acquisisci un nuovo atlante.

Selezionare le posizioni corrispondenti e acquisire la serie di inclinazione sull'asse B per ogni target. Utilizzando questo metodo, sono state generate micrografie 2D e tomografi 3D da sezioni seriali che coprono l'intero volume di un mitocondrio. I tomogrammi a sezione seriale uniti vengono proiettati in modo da creare una sezione longitudinale con l'asse z mostrato verticalmente.

La tomografia elettronica a sezione seriale è stata applicata per analizzare le caratteristiche strutturali delle cristae mitocondriali che riflettono il suo stato energetico e l'invecchiamento. Fette di ricostruzioni tomografiche elettroniche mitocondriali rivelano passaggi tra le membrane lamellari attraverso l'asse z. Segmentazione tomografica che illustra una spirale sinistrorsa in 3D.

I modelli di commutazione Cristae sono stati analizzati e resi cromatici sul modello di segmentazione. Una fetta tomografica mostra la confluenza laterale della matrice attraverso le membrane delle cristae. È stato generato un modello di segmentazione del tomogramma che mostra la confluenza della matrice laterale e le cristae rappresentative.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la tomografia elettronica a sezione seriale, che può essere adattata per studiare qualsiasi struttura cellulare in tre dimensioni.