Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi
12 marzo 2018
Questo protocollo descrive un'analisi di invasione verticale invertito che potrebbe essere utilizzata per quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule in un ambiente tridimensionale, preservando il microambiente cellulare. Questo test è adatto per le cellule rare e/o sensibili.
L'obiettivo generale di questo test di invasione è quantificare le capacità migratorie e invasive di cellule rare e sensibili in un ambiente 3D senza spostare le cellule dal loro microambiente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro sulla capacità di invasione di eventi sensibili e orali, come il prodotto di fusione delle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule vengono analizzate nel loro microambiente originale utilizzando un'impostazione 3D.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro perché può essere utilizzata per lo screening di agenti farmacologici in grado di inibire l'invasione e la metastasi delle cellule tumorali. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale. L'aspirazione della temperatura e del pH della miscela di collagene influisce sulla sua polimerizzazione e la manipolazione brusca provoca il distacco del gel.
Iniziare trattando una piastra di coltura da 35 millimetri con un pozzetto di fondo in vetro da 10 millimetri con un millilitro di acido cloridrico molare per abbassare l'idrofobicità del vetro. Dopo 15 minuti, lavare la piastra due volte con un millilitro di PBS per lavaggio, seguita da un lavaggio con un millilitro di etanolo al 70%. Successivamente, sciacquare la piastra con un millilitro di terreno di coltura specifico per le cellule di interesse da utilizzare.
E semina la piastra con le celle di interesse. Quindi posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari. Quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza, combinare 114,5 microlitri di collagene a coda di topo appena preparato, 16,6 microlitri di terreno 10 X DMEM e 33,1 microlitri di terreno di coltura integrati con chemio-attrattivo di interesse in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio.
Neutralizzare la miscela di collagene con 14 microlitri di bicarbonato di sodio e sovrapporre le cellule con 80 microlitri di gel. Lasciare polimerizzare il collagene in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi sovrapporre due millilitri di terreno di coltura cellulare sierica ridotto al due percento sul gel e rimettere con cura le cellule nell'incubatore per il periodo di tempo sperimentale appropriato senza rimuovere il collagene.
Al termine dell'incubazione, rimuovere delicatamente il terreno e sciacquare accuratamente il gel con un millilitro di PBS. Fissare le cellule con un millilitro di paraformaldeide al quattro percento per 15 minuti, seguito da due lavaggi in un millilitro di PBS per lavaggio. Quindi etichettare le cellule con la soluzione DAPI per 20 minuti a temperatura ambiente e visualizzare l'invasione tridimensionale del collagene in vitro mediante microscopia confocale.
Qui viene mostrata la quantificazione dell'invasione del gel di collagene da parte di una linea cellulare di cancro al seno e dei prodotti di fusione delle cellule del cancro al seno in risposta a un chemio-attrattivo per un periodo di migrazione di 48 ore. In particolare, è stata osservata anche la migrazione di rari prodotti di fusione delle cellule del cancro al seno nel gel di collagene in risposta all'attrattivo chemio. Le cellule rimangono sane per tutta la durata dell'esperimento del gel di collagene, come evidenziato dal mantenimento di un numero robusto di cellule e dalla loro morfologia a 48 ore dalla polimerizzazione del gel.
Questo test verticale su gel di collagene consente inoltre di analizzare la cinetica della migrazione cellulare al momento dell'invasione, mediante imaging della migrazione cellulare nella serie Z, nonché la morfologia delle cellule migranti da catturare in situ. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di utilizzare un piatto di coltura compatibile con il microscopio. Seguendo questa procedura, possono essere introdotte altre variabili come la modifica della forza del collagene o l'uso di diversi chemioattrattivi per rispondere a ulteriori domande sugli effetti dell'impegno della ECM sull'invasione cellulare o su diversi chemioattrattivi sull'invasione cellulare, rispettivamente.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia e del cancro per lo screening degli inibitori farmacologici delle metastasi e per esplorare la guarigione delle ferite in tutte le risposte infiammatorie in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la capacità migratoria e invasiva di cellule rare e sensibili, in un ambiente 3D, senza distorcere le cellule sul micro coinvolgimento. Non dimenticare che camminare con cellule tumorali umane, acido cloridrico, paraformaldeide e DAPI può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come l'uso di una cabina biosettica numero due e una sospensione dei fumi, dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un saggio di invasione verticale invertito che quantifica le capacità di migrazione e di invasione di cellule rare e sensibili in un contesto tridimensionale, preservando al contempo il microambiente cellulare. Questo metodo è particolarmente rilevante nella ricerca sul cancro.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Migrazione cellulare
- Ricerca sul cancro
- Saggi di invasione
Sfondo
- Il saggio consente l'analisi delle cellule nel loro microambiente originale.
- È progettato per cellule rare e sensibili.
- Comprendere l'invasione cellulare è fondamentale per lo sviluppo di terapie antitumorali.
- Una dimostrazione visiva della tecnica è essenziale per la corretta esecuzione.
Scopo dello studio
- Quantificare le capacità migratorie e invasive delle cellule.
- Esplorare la capacità invasiva delle cellule sensibili.
- Effettuare lo screening di agenti farmacologici che inibiscono l'invasione e la metastasi delle cellule tumorali.
Metodi Utilizzati
- Saggio di invasione verticale invertita
- Cultura cellulare tridimensionale
- Analisi delle cellule nel loro microambiente
- Valutazione degli effetti della temperatura e del pH sulla polimerizzazione del collagene
Risultati principali
- Ha dimostrato la capacità di analizzare il comportamento cellulare in un ambiente tridimensionale.
- Ha evidenziato l'importanza del mantenimento del microambiente cellulare.
- Ha fornito informazioni sulle capacità invasive delle cellule tumorali.
- Ha mostrato un potenziale utilizzo nella selezione di agenti terapeutici.
Conclusioni
- Il saggio rappresenta uno strumento prezioso per la ricerca sul cancro.
- Preserva il microambiente delle cellule sensibili.
- Può contribuire allo sviluppo di terapie mirate all'invasione e alla metastatizzazione tumorale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio consente ai team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici di valutare il potenziale invasivo di modelli cellulari rari e sensibili in un microambiente tridimensionale fisiologicamente rilevante, senza alterare le interazioni native tra cellule e matrice extracellulare. Preservando la nicchia cellulare originale, il metodo supporta una de-risking meccanicistica dei bersagli associati alla metastasi e migliora la capacità predittiva nella validazione precoce dei bersagli. Esso colma una lacuna critica nello screening preclinico, in cui i saggi tradizionali compromettono l'integrità del microambiente, potenziando così la continuità traslazionale dalla scoperta all'ottimizzazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche valutando l'invasione in modelli cellulari rari o derivati da fusione in condizioni microambientali native.
- Valore operativo: Riduce la variabilità artifattuale causata dallo spostamento cellulare, migliorando la riproducibilità dei fenotipi di invasione tra esperimenti diversi.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione del rischio associato ai bersagli collegando perturbazioni molecolari a esiti funzionali di invasione in un contesto tridimensionale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera metriche quantitative standardizzate di invasione compatibili con l'analisi automatizzata ad alto contenuto informativo.
- Riproducibilità: Riduce al minimo la variabilità tra pozzetti eliminando la rottura meccanica degli strati cellulari durante l'allestimento del saggio.
- Scalabilità: Compatibile con diverse concentrazioni di collagene e chemiotattici, consentendo studi di relazione struttura-attività (SAR) per inibitori della metastasi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella l'invasione tumorale umana utilizzando cellule ibride fibroblasto-epiteliali che riflettono le interazioni stroma-tumore in vivo.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro alla validazione preclinica mantenendo segnali microambientali cruciali per il comportamento invasivo.
- Decisioni adattate al rischio: Fornisce dati funzionali sull'invasione per prioritizzare bersagli o composti con ridotta probabilità di fallimento in fasi avanzate dovuto a una modellizzazione inadeguata del microambiente.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione precoce del bersaglio all'identificazione del composto attivo, offrendo un'alternativa che preserva il microambiente rispetto ai sistemi di tipo Boyden Chamber o transwell per programmi legati alla metastasi.
- Biologia della scoperta: Supporta test basati su ipotesi sui percorsi di invasione consentendo l'acquisizione in tempo reale con z-stack della migrazione cellulare all'interno di gel di collagene fisiologici.
- Screening: Fornisce dati sull'esito dell'invasione adatti allo screening di librerie di composti, in particolare per agenti che agiscono sul rimodellamento della matrice extracellulare o sulla segnalazione chemotattica.
- Analisi: Consente la quantificazione del numero di cellule penetrate e l'analisi morfometrica, fornendo letture multiparametriche per la correlazione struttura-funzione.
- Ricerca traslazionale: Modella l'invasione mediata dallo stroma utilizzando ibridi MSC-cancro, supportando studi meccanicistici associati a biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile a diversi tipi di cancro e colture cellulari stromali in co-coltura, favorisce il riutilizzo della piattaforma in programmi dedicati alla metastasi e alla guarigione delle ferite.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo riducendo i falsi positivi derivanti dalla perturbazione del microambiente.
- Valore operativo: Migliora la robustezza del saggio attraverso protocolli standardizzati di polimerizzazione del gel e di sovrapposizione.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati sull'invasione fisiologicamente rilevanti già nelle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Consente l'avanzamento stratificato per rischio di inibitori della metastasi basato su profili funzionali di invasione in 3D.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella coltura cellulare 3D e nella microscopia confocale per una quantificazione accurata dell'invasione.
- È fortemente dipendente da un controllo preciso della temperatura e del pH durante la preparazione del collagene, al fine di garantire una polimerizzazione del gel uniforme.
- Necessita di un dosaggio standardizzato di chemiotattici e di condizioni di mezzo con ridotto contenuto di siero per ottenere risposte chemiotattiche riproducibili.
- L'adattamento a proteine della matrice extracellulare alternative (ad esempio Matrigel, fibrina) potrebbe richiedere un'ottimizzazione della cinetica di gelificazione e della concentrazione.
- È limitato a cellule aderenti o semi-aderenti in grado di invadere verso l'alto attraverso un sovrapposizione gelatinosa; le sospensioni non aderenti potrebbero richiedere modifiche al protocollo.
