Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

Questo protocollo descrive un'analisi di invasione verticale invertito che potrebbe essere utilizzata per quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule in un ambiente tridimensionale, preservando il microambiente cellulare. Questo test è adatto per le cellule rare e/o sensibili.

L'obiettivo generale di questo test di invasione è quantificare le capacità migratorie e invasive di cellule rare e sensibili in un ambiente 3D senza spostare le cellule dal loro microambiente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro sulla capacità di invasione di eventi sensibili e orali, come il prodotto di fusione delle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule vengono analizzate nel loro microambiente originale utilizzando un'impostazione 3D.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro perché può essere utilizzata per lo screening di agenti farmacologici in grado di inibire l'invasione e la metastasi delle cellule tumorali. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale. L'aspirazione della temperatura e del pH della miscela di collagene influisce sulla sua polimerizzazione e la manipolazione brusca provoca il distacco del gel.

Iniziare trattando una piastra di coltura da 35 millimetri con un pozzetto di fondo in vetro da 10 millimetri con un millilitro di acido cloridrico molare per abbassare l'idrofobicità del vetro. Dopo 15 minuti, lavare la piastra due volte con un millilitro di PBS per lavaggio, seguita da un lavaggio con un millilitro di etanolo al 70%. Successivamente, sciacquare la piastra con un millilitro di terreno di coltura specifico per le cellule di interesse da utilizzare.

E semina la piastra con le celle di interesse. Quindi posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari. Quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza, combinare 114,5 microlitri di collagene a coda di topo appena preparato, 16,6 microlitri di terreno 10 X DMEM e 33,1 microlitri di terreno di coltura integrati con chemio-attrattivo di interesse in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio.

Neutralizzare la miscela di collagene con 14 microlitri di bicarbonato di sodio e sovrapporre le cellule con 80 microlitri di gel. Lasciare polimerizzare il collagene in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi sovrapporre due millilitri di terreno di coltura cellulare sierica ridotto al due percento sul gel e rimettere con cura le cellule nell'incubatore per il periodo di tempo sperimentale appropriato senza rimuovere il collagene.

Al termine dell'incubazione, rimuovere delicatamente il terreno e sciacquare accuratamente il gel con un millilitro di PBS. Fissare le cellule con un millilitro di paraformaldeide al quattro percento per 15 minuti, seguito da due lavaggi in un millilitro di PBS per lavaggio. Quindi etichettare le cellule con la soluzione DAPI per 20 minuti a temperatura ambiente e visualizzare l'invasione tridimensionale del collagene in vitro mediante microscopia confocale.

Qui viene mostrata la quantificazione dell'invasione del gel di collagene da parte di una linea cellulare di cancro al seno e dei prodotti di fusione delle cellule del cancro al seno in risposta a un chemio-attrattivo per un periodo di migrazione di 48 ore. In particolare, è stata osservata anche la migrazione di rari prodotti di fusione delle cellule del cancro al seno nel gel di collagene in risposta all'attrattivo chemio. Le cellule rimangono sane per tutta la durata dell'esperimento del gel di collagene, come evidenziato dal mantenimento di un numero robusto di cellule e dalla loro morfologia a 48 ore dalla polimerizzazione del gel.

Questo test verticale su gel di collagene consente inoltre di analizzare la cinetica della migrazione cellulare al momento dell'invasione, mediante imaging della migrazione cellulare nella serie Z, nonché la morfologia delle cellule migranti da catturare in situ. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di utilizzare un piatto di coltura compatibile con il microscopio. Seguendo questa procedura, possono essere introdotte altre variabili come la modifica della forza del collagene o l'uso di diversi chemioattrattivi per rispondere a ulteriori domande sugli effetti dell'impegno della ECM sull'invasione cellulare o su diversi chemioattrattivi sull'invasione cellulare, rispettivamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia e del cancro per lo screening degli inibitori farmacologici delle metastasi e per esplorare la guarigione delle ferite in tutte le risposte infiammatorie in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la capacità migratoria e invasiva di cellule rare e sensibili, in un ambiente 3D, senza distorcere le cellule sul micro coinvolgimento. Non dimenticare che camminare con cellule tumorali umane, acido cloridrico, paraformaldeide e DAPI può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come l'uso di una cabina biosettica numero due e una sospensione dei fumi, dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.