Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

L'obiettivo generale di questa piattaforma preclinica è quello di fornire una procedura standard per identificare e caratterizzare i meccanismi che guidano la resistenza acquisita alle terapie mirate. Questo metodo può aiutare a implementare il genoma drive in oncologia, in particolare, affrontare le questioni chiave sull'eterogeneità del tumore e sui molteplici meccanismi responsabili della resistenza acquisita alla terapia mirata. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'approccio efficiente in termini di tempo e costi che consente lo studio in vitro dei meccanismi di resistenza alla terapia mirata.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro, poiché la resistenza polmonare è ancora impegnativa per le terapie mirate emergenti. Questo metodo può fornire informazioni sul meccanismo coinvolto nella resistenza alla terapia mirata, ma può anche essere utilizzato per studiare l'efficacia degli agenti chemioterapici convenzionali. Generalmente, gli operatori che utilizzano questo metodo barcolleranno con una generazione di subcloni resistenti ai farmaci, il passaggio più difficile da standardizzare.

Abbiamo concepito l'idea di questo metodo quando abbiamo caratterizzato il meccanismo di resistenza acquisita a trastuzumab in linee cellulari di cancro gastrico HER-positive. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto sono necessarie diverse tecniche per la generazione e la convalida di modelli resistenti ai farmaci in vitro, tra cui il ripristino della sensibilità mediante knock-down genico. Per iniziare questa procedura, seminare le cellule NCI N87 in fiasche di coltura da 25 centimetri quadrati.

Aggiungere 10 microgrammi per millilitro di trastuzumab al terreno di coltura in ciascun pallone. Esporre le cellule a questa dose iniziale fino a quando non riprendono a crescere. Dopo che la crescita cellulare è ripresa in circa due settimane, esporre le cellule a una dose di concentrazione di 100 microgrammi per millilitro di trastuzumab.

Continuare ad aumentare gradualmente la concentrazione di trastuzumab aspettando che le cellule riprendano a crescere prima di ogni esposizione, fino a raggiungere una concentrazione di 400 microgrammi per millilitro. Una linea cellulare può mostrare una sensibilità diversa a farmaci diversi. Una soluzione a questo problema è quella di esporre le cellule a dosi di farmaci gradualmente crescenti, a partire da una dose circa dieci volte all'ora della concentrazione di picco plasmatico fino a quando le cellule continuano a crescere.

Successivamente, seminare le cellule in 24 piastre di coltura a più pozzetti. Esporre le cellule seminate a concentrazioni crescenti di inibitori della terapia target da 100 microgrammi per millilitro a 400 microgrammi per millilitro. Incubare in un incubatore a CO2 a 37 gradi Celsius per 15 giorni.

Successivamente, rimuovere il terreno e sciacquare le celle con 10 millilitri di PBS-1X. Rimuovere il PBS-1X e aggiungere tra i due e i tre millilitri di soluzione di fissaggio. Dopo 20 minuti, rimuovere la soluzione di fissazione e aggiungere due millilitri di soluzione di cristallovioletto allo 0,5% in ciascun pozzetto.

Incubare a temperatura ambiente per due ore. Quindi, utilizzare una pipetta per aspirare con cura la soluzione di cristallovioletto. Immergere le piastre in acqua di rubinetto per sciacquare via eventuali residui rimasti.

Asciugare all'aria a temperatura ambiente per un massimo di due giorni. Quindi, utilizzare un microscopio invertito con ingrandimento 4X per contare le colonie contenenti più di 50 cellule. Calcola il rapporto di resistenza relativa IC50 come indicato nel protocollo di testo.

Per iniziare, preparare una sospensione a cellula singola mediante tripsinizzazione come indicato nel protocollo di testo. Utilizzando un emocitometro e la colorazione con Trypan Blue, contare le cellule. Quindi, seminare 2,5 volte da 10 a cinque cellule su un pallone T-25 per ogni condizione.

Successivamente, diluire 12,5 microlitri di ciascun oligonucleotide siRNA mirato al gene o di oligonucleotide siRNA di controllo negativo in un terreno di trasfezione essenziale minimo. Aggiungere un reagente di trasfezione di liposomi cationici in rapporto 1:1 con gli oligonucleotidi. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.

Successivamente, aggiungere 700 microlitri della miscela di trasfezione a ciascun pallone T-25. Incubare a 37 gradi Celsius per uno o tre giorni. Utilizzare la RT-PCR e l'analisi Western Blot per verificare il knock-down del gene.

Successivamente, seminare le cellule in 24 piastre di coltura a più pozzetti. Esporre le cellule a concentrazioni crescenti di inibitore della terapia target da 100 microgrammi per millilitro a 400 microgrammi per millilitro. Per l'efficacia del knock-down genico, gli oligonucleotidi siRNA devono essere specifici per ridurre l'espressione del bersaglio.

Gli strumenti progettati e la misura del siRNA era lo stesso gene bersaglio sono utili per questo scopo. Incubare in un incubatore a CO2 a 37 gradi Celsius per 15 giorni. Rimuovere il terreno e sciacquare le celle con 10 millilitri di PBS-1X.

Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere da due a tre millilitri di soluzione di fissaggio. Quindi, rimuovere la soluzione di fissazione e aggiungere una soluzione di cristallovioletto allo 0,5%. Incubare a temperatura ambiente per due ore.

Utilizzando una pipetta, aspirare con cura la soluzione di cristallovioletto. Quindi, immergere le piastre in acqua di rubinetto. Asciugare all'aria a temperatura ambiente per un massimo di due giorni.

Successivamente, utilizzare un microscopio invertito con ingrandimento 4X per contare le colonie contenenti più di 50 cellule. In questo studio, tre linee cellulari di cancro gastrico che esprimono un alto livello di HER2 e sono sensibili a trastuzumab sono cresciute in un terreno di coltura contenente gli agenti terapeutici mirati. Da questo si ottengono tre subcloni caratterizzati da un fenotipo stabile e resistente.

Dei sottocloni, HR NCI N87 è considerato il più resistente, raggiungendo una resistenza relativa IC50 di 28,57. L'analisi dell'espressione proteica e genica supporta l'ipotesi che il gene IQGAP1 svolga un ruolo fondamentale nel fenotipo di resistenza della sottolinea HR NCI N87. Come mostrato qui, il livello della proteina IQGAP1 è di cinque volte superiore nel subclone resistente rispetto alle cellule parentali.

E l'espressione del gene IQGAP1 è 2,5 volte superiore nella sottolinea HR NCI N87 rispetto al sottoclone originale. Viene quindi eseguito il silenziamento del gene IQGAP1 per valutare il suo ruolo nello sviluppo del fenotipo di resistenza a trastuzumab. Un test clonogenico conferma ulteriormente l'ipotesi dell'importanza di IQGAP.

Come si vede qui, il silenziamento genico ripristina la sensibilità della cellula a trastuzumab, abbassando il valore IC50 a sette microgrammi per millilitro. Quello che penso di questa procedura è importante tenere presente che in genere non è facile ottenere subcloni cellulari resistenti ai farmaci. E che questo metodo comporta un potenziale rischio di fallimento.

Attraverso questa procedura è possibile ottenere diverse cellule di cloni caratterizzate da diversi meccanismi che guidano la resistenza acquisita alle terapie target. Lo sviluppo di una procedura standard per la modellazione in vitro della resistenza alla terapia target dovrebbe consentire a un ricercatore oncologico di studiare nuovi bersagli abilitati ai farmaci per superare la resistenza ai farmaci, che è la più grande critica alle terapie di ultima generazione.