Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

Gli agenti patogeni di origine alimentare contribuiscono a gran parte dei problemi di salute pubblica a livello globale, influenzando in modo significativo il tasso di mortalità e morbilità umana. I metodi convenzionali per la rilevazione di agenti patogeni di origine alimentare richiedono una gestione complicata dei campioni e richiedono molto tempo. Recentemente, i biosensori hanno dimostrato di essere un metodo di rilevamento promettente e completo con i vantaggi di un rilevamento rapido e pratico.

Lo sviluppo dei biosensori si basa su elettrodi modificati con nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico. L'elettrodo di carbonio serigrafato è stato modificato per aumentare la superficie attiva dell'elettrodo di lavoro. Il blu di metilene utilizzato come complesso redox ha un forte legame con il DNA a singolo filamento del DNA della sonda immobilizzata.

Questo rapporto di elevata afinità è rappresentato da un'elevata corrente di picco. L'ibridazione del DNA a singolo filamento con la sua sequenza complementare sostituisce le molecole di blu di metilene legate, riducendo la corrente della voltammetria differenziale dell'impulso. Ciò potrebbe essere dovuto a una minore quantità di blu di metilene raccolto sulla superficie dell'elettrodo modificato con DNA complementare a doppio filamento, che è stato causato dall'interazione irraggiungibile tra le basi guanina.

Il colore delle soluzioni preparate cambia a partire dal giallo al nerastro e infine al rosso rubino scuro. Ciò indica che il sale d'oro è stato ridotto dagli ioni citrato. L'acido polilattico disciolto è stato miscelato con la soluzione di nanoparticelle d'oro precedentemente preparata e quindi mescolato in modo omogeneo a temperatura ambiente, che poi è stato indicato come nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico.

La spettroscopia ultravioletta visibile, la diffrazione dei raggi X, la microscopia elettronica a trasmissione e la microscopia elettronica a scansione a emissione di campo con spettrometria a raggi X a dispersione di energia sono state utilizzate per caratterizzare le nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico. Circa 25 microlitri della soluzione omogenea di nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico sono stati rapidamente pipettati sull'elettrodo di carbonio serigrafato e asciugati all'aria per 24 ore prima dell'uso. Gli elettrodi modificati sono stati quindi caratterizzati elettrochimicamente in ferrocianuro di potassio per misurare l'area superficiale attiva, la spettroscopia di impedenza elettrochimica, la ripetibilità, la riproducibilità e la stabilità.

L'ottimizzazione della condizione di immobilizzazione è stata determinata utilizzando tre fattori, la concentrazione di DNA a singolo filamento compresa tra 0,2 e 1,4 micromolari, il tempo compreso tra 30 e 220 minuti e la temperatura compresa tra 25 e 75 gradi Celsius. D'altra parte, l'ottimizzazione della condizione di ibridazione è stata determinata attraverso due fattori, che sono il tempo compreso tra cinque e 35 minuti e la temperatura compresa tra 25 e 75 gradi Celsius. Gli elettrodi modificati trattati sono stati successivamente immersi in blu di metilene 20 micromolari per 30 minuti.

Il DNA assorbito in modo non specifico e il blu di metilene in eccesso sono stati rimossi mediante lavaggio con tampone di acetato salino pH 4,5 e quindi risciacquati con acqua deionizzata. La corrente di picco della riduzione del blu di metilene è stata misurata utilizzando la tecnica della voltammetria a impulsi differenziali. La misurazione della voltammetria a impulsi differenziali è stata eseguita utilizzando una soluzione salina tampone fosfato a pH 7,0 che non conteneva indicatori.

Una procedura simile è stata condotta per tutte le interazioni. Vibrio parahaemolyticus come ceppi di riferimento e altri otto ceppi batterici, vale a dire Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus e Vibrio alginolyticus del comune patogeno di origine alimentare sono stati impiegati per la convalida elettrochimica del biosensore del DNA in questo studio. Ogni due settimane è stata condotta una sottocoltura di routine di ceppi batterici sui rispettivi agar per mantenerne la vitalità.

La quantità di cellule di Vibrio parahaemolyticus è stata determinata utilizzando una tecnica di piastra diffusa. Un millimetro della coltura cellulare batterica è stato trasferito in nove millimetri di brodo di soia tripticasi contenente il 3% di cloruro di sodio per ottenere un fattore di diluizione di 10. Successivamente, 0,1 millilitri di ciascun fattore di diluizione a partire da un fattore di diluizione di 10-10 volte il fattore di diluizione di 10 sono stati sparsi su una piastra di CHROMagar Vibrio per il conteggio delle colonie, rispettivamente.

Le vongole sono state ottenute dal mercato umido e poi portate rapidamente in laboratorio in una scatola di raffreddamento del ghiaccio per l'analisi. Le vongole sono state divise in due gruppi, vale a dire il gruppo trattato e quello non trattato, partendo dal presupposto che le vongole fossero raccolte in modo uniforme dall'inizio della raccolta fino alla loro messa in celle frigorifere al mercato. Le vongole del gruppo trattato sono state pretrattate conservandole a meno 20 gradi Celsius per 24 ore, seguite dall'esposizione alla luce ultravioletta a 20 gradi Celsius per quattro ore prima dell'estrazione del DNA.

Ci si aspettava che la temperatura di congelamento e l'esposizione ai raggi ultravioletti utilizzati per il gruppo di controllo lo uccidessero o almeno limitassero gli agenti patogeni di origine alimentare che si accumulavano naturalmente nelle vongole. Non è stato applicato un regime di pastorizzazione più elevato di 70 gradi Celsius, poiché lo scopo della condizione controllata in questo studio era quello di imitare la situazione reale delle vongole fresche. Nel frattempo, i campioni del gruppo non trattato sono stati analizzati direttamente senza alcun pretrattamento non appena sono arrivati in laboratorio.

Le vongole venivano lavate in acqua distillata e pulite dallo sporco prima di rimuovere i tessuti dai gusci utilizzando una pinza sterile e una cappa a flusso laminare. Circa 10 grammi di campioni di tessuto di vongole sono stati omogeneizzati con l'omogeneizzatore in 19 millilitri di brodo di soia sterile tripticasi contenente il 3% di cloruro di sodio per 60 secondi. Una quantità nota di agenti patogeni di origine alimentare è stata quindi aggiunta a nove millimetri del brodo campione omogeneizzato per i campioni addizionati.

I campioni non addizionati sono stati utilizzati come controllo negativo. Circa un millilitro di campioni è stato pipettato in una provetta Eppendorf per l'estrazione del campione di DNA, che sarebbe stato utilizzato per il biosensore e il saggio della reazione a catena della polimerasi. Il DNA genomico dell'agente patogeno di origine alimentare è stato quindi estratto dai campioni addizionati e non addizionati.

Il DNA genomico è stato estratto a seguito di una procedura di lisi bollita modificata. Il DNA genomico è stato centrifugato a 12.000 rotazioni al minuto per tre minuti a quattro gradi Celsius per ottenere una sospensione trasparente e il surnatante è stato mantenuto a meno 20 gradi Celsius per un ulteriore utilizzo. Un biofotometro è stato utilizzato per determinare la concentrazione e la purezza del DNA genomico estratto.

L'identità di tutti i ceppi è stata quindi determinata utilizzando saggi biochimici standard e verificata mediante sequenziamento genico di 16 RNA SR. Infine, il DNA genomico è stato denaturato a 92 gradi Celsius per due minuti e raffreddato rapidamente in acqua ghiacciata prima dell'applicazione del biosensore. Un'ulteriore conferma dei patogeni di origine alimentare è stata effettuata utilizzando la reazione a catena della polimerasi che ha come bersaglio il rispettivo gene.

Il prodotto amplificato e le loro dimensioni sono stati determinati mediante elettroforesi su gel di agarosio all'1,5%. Le immagini del gel sono state acquisite utilizzando un sistema di documentazione del gel. La generazione di nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico è stata confermata dagli spettri visibili ultravioletti, che la crescita del plasma superficiale e il picco di risonanza sono stati fondati intorno ai 540 nanometri.

La formazione e l'esistenza di nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico sono state indicate a intervalli di lunghezza d'onda da 500 a 600 nanometri, a seconda della dimensione delle particelle. Tutti i picchi di cristalliti di nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico sono stati osservati nei due teatri a 31,7, 38,2, 44,4, 64,7 e 77,7 gradi. Le intensità di picco dei cristalliti sono aumentate anche quando i picchi di diffrazione più ampi sono entrati a 31,7 gradi, il che implica che le nanoparticelle fredde sono state incorporate nell'acido polilattico e suggerendo la formazione di nanostrutture polifasiche dell'oro.

Dalla curva di distribuzione delle particelle al microscopio elettronico a trasmissione e dalle immagini delle nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico, si è potuto vedere che le nanoparticelle d'oro sono di forma quasi sferica. La dimensione delle nanoparticelle era nell'intervallo di circa 37 nanometri, che è leggermente più grande di quella ottenuta dalla formula di Scherrer, suggerendo una natura policristallina delle nanoparticelle sintetizzate. La dimensione principale delle nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico è stata calcolata utilizzando l'equazione di Sherrer determinando l'ampiezza della riflessione di Bragg 100

Dalla tabella, la dimensione del cristallito delle nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico è stata calcolata come 27 nanometri. Dalle immagini di microscopia elettronica a scansione di emissione di campo e con spettri di raggi X a dispersione di energia, l'elettrodo di carbonio serigrafato modificato aveva la più alta percentuale di peso di oro, la massima densità e la più grande struttura di copertura delle nanoparticelle. Lo spettro dei raggi X a dispersione di energia ha confermato che le nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico prodotte erano composte solo da oro e non mostravano altri elementi tranne il picco corrispondente al carbonio e all'ossigeno.

I potenziali di picco anodico e catodico erano coerenti a diverse velocità di scansione, suggerendo che la reazione elettrochimica era reversibile in base alla separazione dei picchi. L'area della superficie attiva degli elettrodi modificati è stata calcolata come 0,26 centimetri quadrati e 0,41 centimetri quadrati rispettivamente per l'elettrodo nudo e l'elettrodo modificato. Questo risultato ha confermato che il miglioramento offerto dalle nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico sulla superficie attiva era relativamente più alto rispetto all'elettrodo nudo.

Il valore della resistenza di trasferimento di carica per l'elettrodo nudo era di 1.932 ohm, mentre l'elettrodo modificato diminuiva a 1.444 ohm. La diminuzione del valore della resistenza al trasferimento di carica nell'elettrodo modificato può essere il risultato di una diminuzione della costante dielettrica locale e/o di un aumento dello spessore del doppio strato elettrico, suggerendo che il ferrocianuro di potassio funzionasse per assorbimento all'interfaccia del metallo o della soluzione. Le correnti di picco aumentavano progressivamente con la modifica dell'elettrodo nudo utilizzando nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico che mostravano che una sensibilità più elevata era l'inverso della minore resistenza al trasferimento di carica.

La deviazione standard relativa dell'elettrodo modificato è stata derivata come 4,26%L'elettrodo con la modifica delle nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico ha fornito una migliore deviazione standard relativa dopo diverse misurazioni. Valori di deviazione standard relativa del 4,05% per elettrodi modificati che indicano una migliore riproducibilità della fabbricazione dell'elettrodo per nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico. La concentrazione ottimizzata del DNA era di 1,2 micromolari di DNA a singolo filamento.

Il tempo di immobilizzazione ottimale del DNA a singolo filamento è stato selezionato in 180 minuti. La temperatura ottimale di immobilizzazione del DNA a singolo filamento è stata selezionata come 55 gradi Celsius. Il tempo di ibridazione ottimale del DNA a doppio filamento è stato selezionato in 10 minuti.

La temperatura di ibridazione ottimale del DNA a doppio filamento è stata selezionata come 35 gradi Celsius. Il DNA complementare ha mostrato la corrente di picco più bassa di 0,73 microampere tra il DNA sondato, il DNA non complementare, il DNA non corrispondente a tre basi e il DNA non corrispondente a una base. È ovvio che l'alta corrente del DNA che è stato preso di mira è più piccola della corrente delle altre sequenze di oligonucleotidi.

Questo risultato ha indicato che il biosensore potrebbe essere utilizzato per discriminare con elevata sensibilità e specificità. Il biosensore di DNA costruito aveva una selettività di rilevamento dell'ibridazione tramite DNA sonda immobilizzata sulla superficie dell'elettrodo modificato. La continua diminuzione della corrente di picco della voltammetria a impulsi differenziali del blu di metilene sull'elettrodo modificato è stata innescata a seguito di un aumento della concentrazione di DNA complementare.

Una correlazione lineare tra il log di varie concentrazioni di DNA target da 0,2 picomolari a 0,02 millimolari e il log della corrente di picco di riduzione del blu di metilene è rappresentata con un coefficiente di regressione lineare di 0,96. La percentuale di recupero per il biosensore di DNA fabbricato è diminuita lentamente fino a non meno dell'80% del suo segnale iniziale dopo sei mesi di conservazione, indicando che la sonda di DNA a singolo filamento sulla superficie dell'elettrodo modificato è altamente stabile. Una buona stabilità a lungo termine a una temperatura inferiore a 45 gradi Celsius potrebbe essere la ragione della forte reazione tra le nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico e il DNA a singolo filamento.

Sono stati esaminati i prodotti di amplificazione della reazione a catena della polimerasi per nove diverse specie di batteri, che erano Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae e Vibrio parahaemolyticus. La corrente di picco della voltammetria a impulsi differenziali ottenuta dopo una valutazione della reattività crociata mostra una rilevazione molto chiara di Vibrio parahaemolyticus rispetto ad altre specie batteriche. Può essere visto diminuendo il numero di coppie di basi, il segnale di voltammetria a impulsi differenziali osservato aumenta.

Ciò è correlato alla maggiore quantità di molecole di blu di metilene fino alle sonde. Dall'analisi della reazione a catena della polimerasi, Vibrio parahaemolyticus è stato trovato sia nei campioni spiked trattati che in quelli non trattati, come mostrato dalle corsie sette, otto, nove, 10, 11 e 12. Mentre i campioni non addizionati trattati e non trattati nelle corsie uno, due, tre, quattro, cinque e sei erano privi di Vibrio parahaemolyticus.

I risultati del rilevamento sono stati ottenuti utilizzando il biosensore del DNA sviluppato, che ha determinato con successo la presenza di Vibrio parahaemolyticus nel gruppo trattato, costituito da campioni addizionati e non addizionati. Questi risultati sono correlati positivamente con i risultati della reazione a catena della polimerasi precedentemente discussi. L'applicazione di nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico ha un grande potenziale per l'applicazione come modifica per un ulteriore senso di fabbricazione.

Un'elevata selettività potrebbe essere raggiunta quando il complesso redox si lega più fortemente con la molecola di bioriconoscimento non ibridata, che potrebbe essere un'innovazione che vale la pena seguire.