Name: Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: Impara a sviluppare un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare Vibrio parahaemolyticus utilizzando nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico. Questo metodo offre rilevazione rapida e pratica per la sicurezza alimentare.

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Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno di Universiti Putra Malaysia.

Nota: Tutti i reagenti chimici e biochimici per essere utilizzati devono essere di purezza analitica e utilizzato senza ulteriore purificazione. Preparare tutte le soluzioni utilizzando acqua deionizzata sterile. Autoclave tutti i bicchieri prima della sterilizzazione.
Attenzione: Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si eseguono attività di laboratorio, compreso l'uso di controlli (cappa, glovebox) tecnici e dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice, pantaloni di lunghezza completa, chiuse scarpe).
1. fabbricazione e caratterizzazione di elettrodo per volta utilizzando PLA-AuNPs
<ol><li>
Preparazione e caratterizzazione di PLA-AuNPs
	<ol>
<li>Aggiungere 10 mL di soluzione di citrato di sodio (38,8 mM) a 100 mL di soluzione di acido cloroaurico acquosa (1 mM) di ebollizione rapidamente e raffreddare fino a temperatura ambiente. Osservare i cambiamenti nel colore nella soluzione preparata AuNPs che inizia come giallo, modifiche a nerastro e infine termina come rosso rubino scuro.</li>
		<li>Posizionare i pellet PLA in uno stampo di acciaio inox per il processo di fusione e li preriscaldare a una temperatura di 190 ° C per 10 min. Segui la procedura di pressatura: metterli sotto una pressione di 2,2 MPa per 1 min come parte della preparazione foglio PLA. Il foglio PLA sarà pronto per l'uso dopo il raffreddamento per circa 3 ore.</li>
		<li>Mescolando energicamente, sciogliere 0,68 mg dei fogli PLA in 5 mL di cloroformio a temperatura ambiente. Mescolare il PLA disciolto con 10 mL di soluzione AuNPs precedentemente preparata e mescolate in modo omogeneo a temperatura ambiente. Le miscele omogenee possono quindi essere denotate come PLA-AuNPs e caratterizzato usando UV-Vis, XRD, TEM e FESEM con EDX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione e caratterizzazione di elettrodi di carbonio serigrafato modificate Nota: Il SPCE utilizzato in questo studio comprende un sistema di tre elettrodi: un elettrodo contatore, un elettrodo di lavoro di carbonio e un elettrodo di riferimento Ag/AgCl.<ol>
<li>Dispensare 25 µ l della soluzione omogenea di PLA-AuNPs sul SPCE e quindi aria asciugare rapidamente per 24 h prima dell'uso.</li>
		<li>Elettrochimicamente caratterizzano gli elettrodi modificati, SPCE/PLA-AuNPs-ferro cianuro del potassio (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) per misurare la superficie attiva, spettroscopia di impedenza elettrochimica, ripetibilità, riproducibilità e stabilità30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sviluppo del biosensore elettrochimico del DNA
<ol><li>
Preparazione della sonda Nota: Le sequenze del DNA complementare e ssDNA sonda sono stati scelti sulla base delle informazioni dal centro nazionale per database Biotechnology Information (NCBI).<ol>
<li>Acquisto di oligonucleotidi sintetici (20-mer ssDNA sonda, DNA complementare 20-mer, 20-mer malassortiti DNA e DNA non-complementare 21-mer) come polvere liofilizzata da laboratori commerciali, basato su sequenze seguenti: chitosani ssDNA sonda: 5 ′ - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 ' DNA complementare: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - DNA non corrispondente uno-base: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - tre basi DNA non corrispondente: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - DNA non complementari: 3 ′ 5 ′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -</li>
		<li>Preparare soluzioni di riserva di tutti gli oligonucleotidi (100 µM) utilizzando una soluzione TE sterile (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), suddivisa in porzioni analitiche. Tenere questo a-4 ° C e quindi apportare le appropriate diluizioni appena prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ottimizzazione di immobilizzazione e ibridazione Nota: Un SPCE modificato con PLA-AuNPs, denotato come SPCE/PLA-AuNPs, è stato utilizzato per questo studio e un metodo di fusione di goccia è stato utilizzato per l'immobilizzazione del DNA e l'ibridazione.<ol>
<li>In primo luogo, immobilizzare 25 µ l di sonda ssDNA chitosani su SPCE/PLA-AuNPs e poi aria la asciugare per 24 ore a temperatura ambiente, dopo di che essa verrà infine indicata come SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinare l'ottimizzazione della condizione immobilizzazione utilizzando tre fattori: la concentrazione di ssDNA (che vanno da 0,2 a 1,4 µM), tempo (variabile da 30 a 210 min) e temperatura (che vanno da 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Pipettare 25 µ l di DNA complementare sopra alla superficie di SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA di svolgere l'evento di ibridazione dopo di che può essere infine indicata come SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determinare l'ottimizzazione della condizione ibridazione tramite i due fattori di tempo (da 5 a 30 min) e temperatura (che vanno da 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Immergere l'immobilizzato e ibridati elettrodi in µM 20 MB per 30 min. rimuovere il DNA non specifico adsorbito e MB in eccesso mediante lavaggio con 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) e poi risciacquo con acqua deionizzata. Misurare la corrente di picco del MB riduzione usando tecnica DPV. Eseguire la misura di DPV con 0.1 M PBS (pH 7) non contenente nessun indicatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caratterizzazione del biosensore DNA fabbricato
	<ol>
<li>Immergere il SPCE/PLA-AuNPs in µM 20 MB per 30 min, lavare con 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) e poi risciacquare con acqua deionizzata prima della misura. Seguire una procedura simile per tutte le interazioni tra cui la sonda DNA, DNA complementare, DNA non corrispondente e non complementari campioni di DNA.</li>
		<li>Misurare la riduzione elettrochimica. Nota: Abbiamo misurato DPV utilizzando un Autolab commercialmente manufactured con software di interfaccia. Le misurazioni di DPV della riduzione elettrochimica MB eseguita presso un potenziale che vanno da -0.5 V a 0,25 V, con un passo di potenziale di 0.005 V, ampiezza di modulazione di 0.05 V e una velocità di scansione di 7,73 mVs-1 in 0.1 M PBS (pH 7), non contenente nessun indicatore. La selettività, sensibilità, riproducibilità e stabilità al calore del biosensore DNA fabbricato più ulteriormente sono stati studiati. Risultati riferiti sono stati presentati come media valore misurazioni in tre repliche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. convalida del biosensore fabbricato del DNA utilizzando campioni reali
<ol><li>Preparazione dei ceppi batterici
	<ol>
<li>Selezionare batterici campioni basati sulla loro significativa contaminazione dei frutti di mare31,32 . Nota: V. parahaemoliticus come ceppi di riferimento e 8 altri ceppi batterici (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, polmonite da Klebsiella Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereuse alginolyticus del vibrione) delle epidemie alimentari comuni patogeni sono stati impiegati per la validazione di biosensori elettrochimica del DNA in questo studio.</li>
		<li>Condurre una routine sub-cultura di ceppi batterici su loro rispettivi agar ogni due settimane per mantenere la loro vitalità, consultare la tabella 1 per le condizioni di coltura.</li>
		<li>Mantenere la conservazione a lungo termine dei ceppi batterici nei loro rispettivi brodi crescenti contenente 20% (v/v) glicerolo a-80 ° C come glicerolo protegge i batteri impedendo la formazione di cristalli di ghiaccio che possono danneggiarli durante il processo di congelamento. Successivamente, inoculare un ciclo della cultura di cellula batterica conservati negli stock di glicerolo nei rispettivi brodi. Incubare i brodi secondo le loro rispettive crescita tempo e temperatura quando il bisogno di far rivivere i batteri.</li>
		<li>Determinare la quantità di V. parahaemoliticus celle utilizzando una piastra di diffusione tecnica33, standard e un metodo ben noto per l'enumerazione dei microrganismi derivate da una serie di diluizioni.<ol>
<li>Cultura V. parahaemoliticus in brodo di soia Trypticase (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C in una condizione di agitazione 140 giri/min. Quindi, trasferire 1 mL di coltura delle cellule di batteri in 9 mL di TSB + 3% NaCl per ottenere un fattore di diluizione 10-1 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ripetere questo passaggio nove volte per ottenere una serie completa di fattore di diluizione fino a 10-10 . Successivamente, si sono diffuse 0,1 mL di ciascun fattore di diluizione (a partire da 10-1 a 10-10) sulla piastra di agar selettivo di un Vibrio per Colonia contando, rispettivamente. Incubare le piastre incubate a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Utilizzare un contatore per contare diverse colonie e poi retro-calcolare (conteggio la quantità CFU/pipettato x fattore di diluizione) per ottenere un'unità formanti colonie per millilitro densità (CFU mL-1). Derivare la concentrazione della Colonia formando unità (CFUs) in sospensioni di cellule di batteri dalla trama di calibrazione di CFU mL-1 assorbanza.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del test PCR
	<ol>
<li>Estrarre DNA genomic seguendo un modificato bollito Lisi procedura34. Primo, streak un batterica individuale ceppo agarizzati e inoculare in media di brodo, seguita da incubazione e alla sua condizione di crescita relativa, un 140 giri/min agitazione condizione.</li>
		<li>Dispensare una cultura di 1 mL di brodo in una provetta da centrifuga micro. Questo Centrifugare a 4830 x g e a 4 ° C per 1 min ottenere pellet. Utilizzare circa 500 µ l di tampone sterile TE per risospensione con il pellet. Tenere la sospensione risultante per 10 min a 98 ± 2 ° C in un blocco di riscaldamento e raffreddare immediatamente a-18 ° C per 10 min lisare le cellule e liberare il DNA.</li>
		<li>Centrifugare il DNA genomico a 4830 x g e a 4 ° C per 3 minuti ottenere una sospensione di chiara e tenere il supernatante a-20 ° C per un ulteriore uso. Utilizzare una misurazione biofotometro con assorbimento UV a lunghezza d'onda di 260 nm (come acidi nucleici assorbire la lunghezza d'onda della luce) e anche ad una lunghezza d'onda di 280 nm (come le proteine assorbe la lunghezza d'onda della luce) per determinare la concentrazione e la purezza dell'Estratto il DNA genomico e quindi identificare tutti i ceppi utilizzando saggi biochimici standard35 e loro verifica tramite 16S rRNA gene sequenziamento36. Infine, denaturare il DNA genomico a 92 ° C per 2 min e raffreddarlo rapidamente in acqua di ghiaccio prima dell'applicazione per il biosensore.</li>
		<li>Confermare ulteriormente la presenza V. parahaemoliticus usando la PCR per il gene toxR di destinazione. Eseguire questa procedura in un termociclatore utilizzando una coppia di primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' e 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Ottimizzare l'amplificazione di PCR in un volume di reazione totale di 25 µ l composto da acqua sterile (15,5 µ l), buffer (5 µ l), primer (1 µ l, 10 µM), miscela del dNTP (1 µ l), mascherina del DNA (2 µ l) e la Taq DNA polimerasi (0,2 µ l, 10 x).</li>
		<li>Mescolare bene i componenti e organizzare l'amplificazione di PCR della sequenza dell'obiettivo in un termociclatore programmato per 30 cicli di amplificazione. Nel nostro studio, ogni ciclo consisteva di tre fasi reazioni i. e., denaturazione iniziale (94 ° C, min 3) seguita da 30 cicli di denaturazione (94 ° C, 1 min), ricottura (63 ° C, min 1,5) ed estensione (72 ° C, min 1,5), seguito dall'estensione finale (72 ° C, min 7).</li>
		<li>Determinare i prodotti amplificati e le loro dimensioni tramite elettroforesi su gel di agarosio 1.5%. Catturare le immagini di gel con un sistema gel-documentazione prodotta commercialmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dei campioni di cockle
	<ol>
<li>Ottenere campioni freschi. Nota: Il nostro freschi vongole (Anadara granosa) erano ottenuti dal mercato bagnato in Serdang, Selangor e rapidamente portati al laboratorio in una scatola più fredda del ghiaccio per l'analisi. Dividere i campioni in 2 gruppi, vale a dire il gruppo trattato e non trattato, supponendo che le vongole sono state raccolte in modo uniforme dall'inizio della vendemmia fino alla loro immissione in cella frigorifera.</li>
		<li>Pretrattare le vongole nel gruppo curato memorizzandole a-20 ° C per 24 h, seguita dall'esposizione alla luce UV a 20 ° C per 4 h prima dell'estrazione del DNA. Nota: La temperatura di congelamento e l'esposizione UV utilizzato per la controllata gruppo uccide o almeno limita il naturalmente ad accumulare V. parahaemoliticus nelle vongole. Non applicare un regime di pastorizzazione più alto di 70 ° C come l'obiettivo della condizione controllata in questo studio è quello di imitare la situazione reale dei cardi freschi. Nel frattempo, analizzare campioni direttamente al gruppo non trattato senza alcun pre-trattamento, non appena arrivano in laboratorio.</li>
		<li>Sottocultura un ceppo di V. parahaemoliticus ATCC 17802 in TSB (3% NaCl). Determinare il livello di cellule vitali nell'inoculo tramite placcatura di appropriate diluizioni della TSB (3% NaCl) su CA al fine di ottenere un inoculo di 104 CFU mL-1 di V. parahaemoliticus. Lavare ogni cockle in acqua distillata e lo scrub privo di sporco prima di utilizzare pinze sterili in un'unità a flusso laminare per rimuovere i tessuti dalla shell.</li>
		<li>Circa 10 g di campioni di tessuto di cockle di omogeneizzare con un omogeneizzatore in 90 mL di TSB sterile (3% NaCl) per 60 s. Aggiungi una quantità nota di V. parahaemoliticus a 9 mL di brodo campione omogeneizzato per i campioni arricchiti. Utilizzare gli esempi sono come controllo negativo. Stimare i conteggi delle cellule di V. parahaemoliticus a spillo per i campioni di cockle da 0,1 mL dei campioni su CA di placcatura, e successivamente, Pipettare 1 mL di campioni in una microcentrifuga per DNA campione estrazione, da utilizzarsi nel biosensore e analisi di PCR.</li>
		<li>Estrarre il DNA genomico del V. parahaemoliticus dai campioni a spillo e sono seguito modificato bollito Lisi procedura36. Infine, determinare la concentrazione di DNA e la purezza tramite una misurazione di Fotometro bio con assorbimento UV a lunghezza d'onda di 260 nm (come acidi nucleici assorbire la lunghezza d'onda della luce) e anche ad una lunghezza d'onda di 280 nm (come le proteine assorbe la lunghezza d'onda della luce).</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I passaggi critici in un quadro di sviluppo positivo di questo tipo di biosensore elettrochimico sono selezione di elementi di riconoscimento biologico appropriato per il trasduttore (acido nucleico o DNA qui); approccio chimico per la costruzione di strato sensibile del trasduttore; materiale di trasduzione; ottimizzazione di immobilizzazione del DNA ed ibridazione; e convalida del biosensore sviluppato utilizzando campioni reali.
Core per il corretto sviluppo di un biosensore elettrochimico ...

Un importante argomento di dibattito pubblico e scientifico negli ultimi anni, l'intossicazione alimentare è principalmente associata con 3 agenti: microrganismi1, prodotti chimici2e parassiti3. Alimenti contaminati possono causare conseguenze gravi per la salute negli esseri umani, soprattutto nel gruppo di rischio più elevato di quelli con un sistema immunitario debole, anziani, donne incinte, neonati e bambini piccoli4. Con più di 1 milione casi di diarrea acuta che accadono annualmente nei bambini sotto i 5 anni in Africa, Asia e America Latina, l'intossicazione alimentare è una malattia globale principale5,6 e l'organizzazione mondiale della sanità ha stabilito microrganismi come il più importante collaboratore7. Vibrio parahaemolyticus spicca i più ampiamente riconosciuti ceppi virulenti. Solitamente si trova in ambienti costieri, estuari e marino8, è un batterio gram-negativo, che diventa attiva in ambienti sale alti e provoca gravi gastroenteriti umana quando mangiato nella Marina non adeguatamente cotta, maltrattato o cruda prodotti9. Inoltre, condizioni mediche esistenti in alcune persone li rendono inclini a infezioni, setticemia o orecchio infezione derivante da V. parahaemolyticus10della ferita. I fattori di virulenza di V. parahaemoliticus emolisine sono divisi in due tipi che contribuiscono alla patogenesi della malattia: termostabile emolisina diretta (TDH) codificati da geni tdh ed emolisina TDH-correlati codificati da geni di trh11. I marcatori di virulenza (geni tdh e trh) di V. parahaemoliticus si trovano principalmente in campioni clinici piuttosto che in campioni ambientali.
V. parahaemoliticus possiede la capacità di sopravvivere in una vasta gamma di condizioni, rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali12. Il suo meccanismo di proliferazione intensifica il potenziale di rischio aumenta la sua tossicità in parallelo con cellula massa13. Peggio ancora, il cambiamento climatico sta fornendo questi batteri con ampio condizioni per accelerare la loro crescita di popolazione cellulare14. A causa della sua alta frequenza, V. parahaemoliticus deve essere monitorato lungo la catena di approvvigionamento alimentare, in particolare nel commercio e produzione di frutti di mare dal momento che tali prodotti sono dove si trovano in enormi quantità15,16 in tutto il mondo. Attualmente i batteri vengono identificati e isolati utilizzando una gamma di metodi tra cui prove biochimiche, arricchimento e selettivi17, enzima-collegata immunomagnetica sorbente assay (ELISA)18, elettroforesi del gel di impulso-campo (PFGE) 19, test di agglutinazione al lattice e della polimerasi reazione a catena (PCR) test20. Solitamente, questi metodi richiedono personale qualificato, sofisticati strumenti e tecniche laboriose che non forniscono informazioni sulla contaminazione immediatamente. Questo limita fortemente la probabilità di rilevare prontamente contaminazione nociva e applicazioni in loco. Strumenti di rilevazione rapida rimangono una sfida eccezionale.
Biosensoristica sta emergendo come un'opzione di promessa per la rilevazione di patogeni di origine alimentare, perché offre un risparmio di tempo, conveniente, pratico e in tempo reale analisi metodo21,22,23,24 . Tuttavia, anche se ci sono stati molti risultati positivi di rilevazione di analita in campioni arricchiti e soluzione standard utilizzando biosensori, c'è ancora una mancanza di ricerca applicata a campioni reali in miscele acquose o estratti organici25. Recentemente, biosensori elettrochimici tramite rilevazione diretta e/o indiretta dell'acido deossiribonucleico (DNA) hanno ricevuto maggiore attenzione tra gli scienziati, a causa della loro specifica per la rilevazione di complementare di destinazione tramite un evento di ibridazione26 , 27 , 28 , 29. questi approcci unici sono più stabili rispetto ai biosensori basati su enzima, offrendo così una tecnologia promettente per la miniaturizzazione e la commercializzazione. L'obiettivo dello studio segnalato qui è quello di costruire uno strumento veloce che può rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività, sensibilità e praticità, basata sulla specificità di sequenza di DNA durante l'ibridazione. Strategie di identificazione comportano la combinazione di polilattico acido-stabilizzato di nanoparticelle d'oro (PLA-AuNPs)30 ed elettrodi di carbonio serigrafato (SPCEs) in presenza di indicatore di ibridazione, blu di metilene (MB). Il potenziale del costrutto rilevamento sviluppati è ulteriormente esplorato utilizzando campioni di batteri DNA cockle lisato e fresco.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Acido tetraacetico Diaminoetano</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Idrogeno fosfato disodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro d'oro (III) triidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico, monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Resina poli(acido lattico), grado commerciale 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>R& M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogeno fosfato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Esacianoferrato di potassio III</td><td>R& M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio sale anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil) amminometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Master Mix con Dual-Dye</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Gel di agarosio</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Brodo</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Eosina metilene blu agar&nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di caricamento 100 bp Scala DNA</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di caricamento 1kb Scala DNA</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo tuorlo d'uovo polimixina agar</td><td>Merck</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>McConkey Agar</td><td>Merck</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>Brodo nutriente</td><td>Merck</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerasi</td><td>Merck</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>Tripticasi Brodo di soia</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Tripticasi Agar di soia</td><td></td><td>Merck 105458</td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di un biosensore elettrochimico del dna per rilevare un patogeni di origine alimentare

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemoliticus) è un agente patogeno comune di origine alimentare che contribuisce a gran parte dei problemi di salute pubblica a livello globale, significativamente che colpiscono il tasso di morbosità e di mortalità umana. I metodi convenzionali per il rilevamento di V. parahaemoliticus quali metodi basati su cultura, analisi immunologiche e metodi molecolari basati richiedono manipolazione complicate e sono che richiede tempo, noioso e costoso. Recentemente, biosensori hanno dimostrato di essere un promettente e completo metodo di rilevamento con i vantaggi di rilevamento rapido, economicità e praticità. Questa ricerca si concentra sullo sviluppo di un metodo rapido per rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività e sensibilità utilizzando i principi di ibridazione del DNA. Nel lavoro, caratterizzazione di nanoparticelle d'oro stabilizzato in acido polilattico sintetizzato (PLA-AuNPs) è stata ottenuta utilizzando la diffrazione dei raggi x (XRD), spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis), microscopia elettronica in trasmissione (TEM), emissione di campo Microscopia elettronica a scansione (FESEM) e la voltammetria ciclica (CV). Inoltre abbiamo effettuato ulteriori test di stabilità, sensibilità e riproducibilità di PLA-AuNPs. Abbiamo trovato che il PLA-AuNPs formata una solida struttura di nanoparticelle stabilizzate in soluzione acquosa. Inoltre abbiamo osservato che la sensibilità migliorata grazie il più piccolo valore di resistenza (Rct) trasferimento carica ed un aumento della superficie attiva (0,41 cm2). Lo sviluppo del nostro biosensore di DNA si basava sulla modificazione di un elettrodo di carbonio serigrafato (SPCE) con PLA-AuNPs e utilizzando il blu di metilene (MB) come l'indicatore redox. Abbiamo valutato gli eventi immobilizzazione e ibridazione mediante voltammetria impulso differenziale (DPV). Abbiamo trovato che non-complementari, complementari e non corrispondenti oligonucleotidi specificamente si distinguevano per il biosensore fabbricato. Inoltre ha mostrato in modo affidabile sensibile rilevamento negli studi di reattività crociata contro vari agenti patogeni di origine alimentare e nell'identificazione di V. parahaemoliticus in vongole fresche.

Formazione di AuNPs è stato rivelato attraverso il cambiamento di colore della soluzione acquosa con citrato di sodio presente. Ciò ha causato il colore da modificare da giallo chiaro a un colore rosso rubino intenso. La generazione di PLA-AuNPs è stata confermata dagli spettri UV-vis (Figura 1) dove la crescita del picco surface plasmon resonance (SPR) è stata trovata a circa 540 nm. La formazione e l'esistenza di PLA-AuNPs è stato indicato alle gamme di lun...

Un protocollo per lo sviluppo di un biosensore elettrochimico di DNA che comprende un elettrodo di carbonio nanoparticelle-modificato, serigrafata, acido-stabilizzato, oro polilattico per rilevare il vibrione paraemolitico è presentato.

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Gli agenti patogeni di origine alimentare contribuiscono a gran parte dei problemi di salute pubblica a livello globale, influenzando in modo significativo il tasso di mortalità e morbilità umana. I metodi convenzionali per la rilevazione di agenti patogeni di origine alimentare richiedono una gestione complicata dei campioni e richiedono molto tempo. Recentemente, i biosensori hanno dimostrato di essere un metodo di rilevamento promettente e completo con i vantaggi di un rilevamento rapido e pratico.Lo sviluppo dei biosensori si basa su elettrodi modificati con nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico. L'elettrodo di carbonio serigrafato è stato modificato per aumentare la superficie attiva dell'elettrodo di lavoro. Il blu di metilene utilizzato come complesso redox ha un forte legame con il DNA a singolo filamento del DNA della sonda immobilizzata.Questo rapporto di elevata afinità è rappresentato da un'elevata corrente di picco. L'ibridazione del DNA a singolo filamento con la sua sequenza complementare sostituisce le molecole di blu di metilene legate, riducendo la corrente della voltammetria differenziale dell'impulso. Ciò potrebbe essere dovuto a una minore qua

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Descriviamo un metodo di analisi sensore elettrochimico per la rilevazione rapida di batteri e di identificazione. Il saggio comporta una serie di sensori funzionalizzato con DNA oligonucleotide sonde di cattura per RNA ribosomiale (rRNA) sequenze specie-specifici. Sandwich ibridazione del target rRNA con la sonda di cattura e di una perossidasi-coniugati DNA sonda rivelatore oligonucleotide rafano produce una corrente amperometrico misurabile.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Fonte: Barber, A. E., et al. Preparazione e applicazione di un nuovo biosensore batterico per la rilevazione presuntiva di residui di arma da fuoco. J. Vis. Exp. (2019).Questo video mostra la rilevazione di analiti specifici utilizzando un biosensore batterico. Viene prelevata una coltura batterica che trasporta un plasmide con un gene della proteina fluorescente rossa (RFP) sotto un promotore sensibile all'analita. Dopo aver pulito accuratamente la superficie del test, una piccola sezione...

Rilevamento di un analita target utilizzando un biosensore batterico

Questo video mostra una tecnica per rilevare contaminanti batterici in campioni di cibo e acqua utilizzando nanosensori. I batteri patogeni bersaglio vengono rilevati attraverso una combinazione di modalità di rilassamento magnetico e di emissione di fluorescenza.

Rilevamento della contaminazione batterica mediante nanosensori magnetofluorescenti

Viene introdotto un biosensore ottico privo di etichetta per il rilevamento di batteri rapidi. Il biosensore è basato su poroso nanostrutturato Si, che è stato progettato per catturare direttamente le cellule dei batteri bersaglio sulla sua superficie. Usiamo anticorpi monoclonali, immobilizzati sul trasduttore poroso, come le sonde di cattura. I nostri studi dimostrano l'applicabilità di questi biosensori per il rilevamento di concentrazioni batteriche basse in pochi minuti, senza...

Rilevamento ottico di E. coli Batteri di mesoporosi Silicon Biosensors

Descriviamo un protocollo per la rilevazione colorimetrica di E. coli utilizzando una cartina di tornasole modificata che sfrutta un DNAzima che scinde l'RNA, l'ureasi e le perle magnetiche.

Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test

L'obiettivo generale del presente protocollo è di sintetizzare funzionale Nanosensori per il portatile, conveniente, e rilevamento rapido di specificamente mirati batteri patogeni attraverso una combinazione di rilassamento magnetico e le modalità di emissione di fluorescenza.

Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

Salmonella spp /Shigella spp sono agenti patogeni comuni attribuiti alla diarrea. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per lo screening della Salmonella spp /Shigella spp usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidato.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Microfluidico digitale basato sull'elettrowetting è una tecnica che utilizza un cambiamento basato sulla tensione nell'angolo di contatto apparente di una goccia di microlitro-volume per facilitarne la manipolazione. La combinazione di questo con perline magnetiche funzionalizzate consente l'integrazione di più operazioni di unità di laboratorio per la preparazione del campione e l'identificazione di agenti patogeni utilizzando Immunosorbent Assay (ELISA) legato all'enzima.

Piattaforma di microfluidica digitale basata su Electrowetting per l'analisi automatizzata di Immunosorbent legata all'enzima

Impara a sviluppare un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare Vibrio parahaemolyticus utilizzando nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico. Questo metodo offre rilevazione rapida e pratica per la sicurezza alimentare.

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

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