Name: Unanalisi del Reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (RTA) tratta di lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Scopri un saggio reporter a fluorescenza in lievito per identificare i componenti cellulari necessari al traffico della tossina ricina A (RTA). Questo metodo rapido ed economico consente di analizzare l'effetto di singoli geni sul trasporto intracellulare.

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Parti di questo studio sono state gentilmente sostenuta da una sovvenzione del Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).

Nota: Una panoramica del flusso di lavoro sperimentale generale è raffigurata nella Figura 1.
Attenzione: RTA è altamente tossico per gli esseri umani. È necessaria l'autorizzazione del laboratorio di sicurezza S2 (livello di biosicurezza 2 equivalente). Si prega di indossare guanti durante l'intero esperimento.
1. eterologhi di sua etichetta RTA in Escherichia coli
<ol>
	<li>Trasformare le cellule di Escherichia coli con l'espressione del plasmide pET24-RTA(sua) 6 o il vettore vuoto pET24a(+) utilizzando protocolli standard elettroporazione9,10. Celle contenenti il plasmide vuoto servono come controllo negativo.</li>
	<li>Dopo la selezione dei cloni positivi sulle piastre di LB (100 µ g/mL) contenenti kanamicina, inoculare le cellule contenenti il plasmide di espressione di RTA o il vettore vuoto nel mezzo di 5ml LBkan (LB medium con 100 µ g/mL di kanamicina) e incubare a 37 ° C e 220 giri/min per 24 h.</li>
	<li>Supplemento 1 L LBkan medio con la pre-cultura 5ml e incubare le cellule a 37 ° C e 220 giri/min fino a quando le cellule hanno raggiunto un OD600 di 0.8-1.0 (circa 3-4 h). Da allora in poi, ridurre la temperatura di cultura a 28 ° C e preparare un 1m della soluzione di riserva (IPTG) isopropilico-β-D-1-thiogalactopyranoside in H2O.</li>
	<li>Inducono l'espressione di RTA di e. coli con l'aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM.</li>
	<li>Dopo 3,5 h a 28 ° C e 220 giri/min, raccolto cellule mediante centrifugazione a 10.000 x g e 4 ° C per 10 minuti, lavare la pallina due volte con 5 mL di tampone di associazione (500 mM NaCl, imidazolo di 10 mM e 20 mM KH2PO4 pH = 7,4) a 10.000 x g e a 4 ° C per 10 min e risospendere il pellet in 5 mL di tampone di associazione. Nota: Il protocollo può essere sospesa in questa fase e le cellule possono essere memorizzate a 80 ° C per diversi giorni.</li>
</ol>
2. la purificazione della sua etichetta RTA tramite cromatografia di affinità
<ol>
	<li>Sottoporre ad ultrasuoni cellule sul ghiaccio con il seguente protocollo: 15 s pulse (20 micron), 30 s pausa. Ripetere questo passaggio cinque volte.</li>
	<li>Centrifugare a 21.000 x g e a 4 ° C per 15 min lysate delle cellule e filtrare il surnatante utilizzando un sistema di filtri siringa sterile (dimensione dei pori di 0,2 µm). Nota: Il pellet cellulare dei campioni lisati con successo mediante mostrano bordi trasparenti.</li>
	<li>Utilizzare un sistema di purificazione automatizzata con 5ml Ni2 +-base colonna di affinità per purificare la frazione di His-Tag RTA dalla sterile filtrata e. coli surnatante. In generale, utilizzare una velocità di eluizione di 1 mL/min e raffreddare il sistema di purificazione di tutto per prevenire la perdita di attività di tossina e associazione tossina non efficiente. Nota: I parametri per purificazione efficiente RTA sono elencati nella tabella 1. Vedi anche Becker et al. Per ulteriori informazioni9.<ol>
		<li>Brevemente, equilibrare la colonna di affinità con 20 mL di buffer obbligatorio rimuovere il buffer di memoria. Applicare il surnatante filtrato sterile sulla colonna di affinità usando una siringa.</li>
		<li>Lavare la colonna con 25-35 mL di buffer di associazione per rimuovere le proteine non associate dalla colonna. Eseguire la fase di lavaggio fino a capacità di assorbimento UV a 280 nm è vicino al valore iniziale di UV.</li>
		<li>Eluire la frazione legata RTA in 20-35 mL di tampone di eluizione (imidazolo di 500 mM, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7.2) e tenere il campione sul ghiaccio (Figura 2A e 2B di figura). Nota: Eluizione della frazione RTA è contrassegnata da un aumento nell'assorbimento di UV. Si prega di notare per raccogliere esclusivamente questa frazione per evitare la contaminazione con proteine rilegate non specifici.</li>
		<li>Utilizzare 20 µ l di campioni eluiti per eseguire Blue di Coomassie macchiatura11 o Western blot analisi12,13 (facoltativo). Utilizzare primario anti-sua anticorpi (1:1, 000) e secondario anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) per rilevare RTA e verificare la purezza del campione (Figura 3).</li>
		<li>Desalificare eluiti frazione RTA su una colonna di dissalazione 5ml ed equilibrare il campione in sorbitolo di 0,8 M.<ol>
			<li>Sostituire la colonna di affinità del sistema di purificazione dalla colonna dissalazione ed equilibrare in primo luogo la colonna con 20 mL di sorbitolo di 0,8 M.</li>
			<li>Applicare la frazione di RTA eluita alla colonna tramite una siringa. Lavare la colonna con 100 mL di sorbitolo 0,8 M ed eluire la frazione di RTA dissalata in una provetta da 15 mL, non appena l'assorbimento di UV inizia ad aumentare (Figura 2).</li>
			<li>Memorizzare la frazione eluita RTA a 4 ° C. Nota: Interrompere direttamente campionamento frazione RTA quando aumenta la conduttanza per evitare contaminazione salina. Parametri per la procedura di dissalazione sono elencati nella tabella 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eluite frazione RTA a 10.000 x g e a 4 ° C per 30-180 min utilizzando una colonna di spin 10 kDa cut-off ad un volume finale di 1-2 mL di concentrato e conservare il campione a 4 ° C per 3-4 settimane. Attenzione: Non congelare il campione dal congelamento conduce ad una perdita completa di attività di RTA.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di proteina mediante un kit di determinazione della proteina convenzionali. Concentrazione nella proteina dovrebbe essere nel range di 1-1.5 mg/mL. Nota: RTA tende a precipitare se la concentrazione nella proteina è troppo alta (&gt; 5 mg/mL).</li>
</ol>
3. trasformazione e rimozione della parete cellulare del lievito
<ol>
	<li>Trasformare mutanti di delezione di lievito wild-type o selezionato con la GFP reporter plasmide pRS315-K28SP- GFP6 utilizzando standard litio acetato trasformazione metodi14. Incubare le cellule su leucina abbandono (d/o) piastre di glucosio (glucosio 2%, 1,5% agar, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% lievito azoto Base (YNB) e 0,087% d/o mix senza leucina) a 30 ° C per 2-3 giorni per selezione clonale positivo.</li>
	<li>Scegli 3 cloni di lievito diverso da ogni piatto e inoculare i cloni in 100 mL di leucina d/o raffinosio medio (2% raffinosio, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e mescolare senza leucina 0,087% dallavalle) a 220 giri/min e 30 ° C a OD600 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 cellule/mL). Nota: La crescita delle cellule i diverso l'eliminazione di ceppi di lievito è diverso. Monitor OD600 tramite uno spettrofotometro.</li>
	<li>Per calcolare i valori di OD600 , diluire i campioni a OD600 = 0.1-0.3 (1:5 a 01:10 diluizioni) e misurare OD600 con uno spettrofotometro. Come riferimento, utilizzare H2O completato con la corrispondente quantità di leucina d/o raffionose mezzo di.</li></ol>Infine, risospendere OD600 = 125 in 5 mL di acqua sterile (5 x 108 cellule/mL).
	<li>Centrifugare le cellule a 25 ° C per 5 min a 10.000 x g, lavare le cellule due volte con 5 mL di acqua sterile e risospendere le cellule in 50 mL di tampone spheroplasting (sorbitolo 0,8 M, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM CaCl2, 2mm ditiotreitolo (DTT) e degli enzimi litici di 200 µ g/mL).</li>
	<li>Incubare la coltura di 50 mL a 100 giri/min e 30 ° C per 90 min. facoltativo: monitorare la formazione dello spheroplast ogni 15 min da microscopia di contrasto di fase. Al microscopio, le cellule dovrebbero avere un colore grigio scuro traslucido. Cellule di Bright (refractile) sono insufficientemente digerite, mentre fantasmi (cellule grigio pallido con poco, se del caso, struttura interna) sono sovra-digerito.</li>
	<li>Verificare l'efficacia di preparazione dello spheroplast per ciascun campione.
	<ol>
		<li>Dopo finitura passo 3.5, mescolare 4 µ l della cultura spheroplasted 50ml con 496 µ l di tampone di spheroplasting (circa 2 × 106 Sferoplasti) e centrifugare per 10 min a 400 x g.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 10 mL di H2O distillata, campione di vortice per 30 s e piastra fuori 10 µ l del campione su piastre di glucosio di d/o di leucina (2% di glucosio, agar 1,5%, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e 0,087% d/o mix senza leucina).</li>
		<li>Incubare le cellule per 3 giorni a 30 ° C. Contare il numero totale delle colonie delle cellule coltivate sulla piastra. Per la valutazione dei dati, utilizzare solo i campioni con efficienza supera al 98% (totale numero di Colonia di cellule &lt; 40 colonie/piastra).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrifugare le cellule da passo 3.5 a 400 x g e a 4 ° C per 10 min e lavare le cellule due volte con 5 mL stabilizzato leucina d/o raffinosio medio (0,8 M sorbitolo, raffinosio 2%, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e 0,087% drop-out mix senza leucina). Risospendere le cellule in 5ml stabilizzato leucina d/o raffinosio medium (1 x 108 cellule/mL) e utilizzare direttamente le cellule per le misurazioni di dosaggio di reporter GFP (sezione 4).</li>

4. GFP Reporter Assay misura in piastre da 96 pozzetti
<ol>
	<li>Seme fuori gli sferoplasti di cellule di lievito ottenute al passaggio 3,7 in piastre da 96 pozzetti (200 µ l/pozzetto).</li>
	<li>Aggiungere 70 µ l leucina stabilizzato d/o raffinosio terreno contenente il controllo negativo (eluato di una Ni2 +-affinità purificato lysate delle cellule dalle cellule di IPTG-indotta e. coli che esprimono il vettore vuoto) o purificata RTA a una concentrazione finale di RTA di 5 µM ( corrispondenti a 160 g/L RTA) in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Immediatamente aggiungere 30 µ l stabilizzato galattosio soluzione (30% galattosio, sorbitolo 0,8 M) per indurre l'espressione di GFP e successivamente avviare la misurazione. Nota: Eseguire la tecniche almeno 3 ripetizioni per esperimento e 3 biologici replica al ceppo di lievito.</li>
	<li>Dopo aver completato la preparazione del campione (punti 4.1-4.3), mettere la piastra a 96 pozzetti in un lettore di fluorescenza e avvia la misurazione. Utilizzare il 475/509 nm set di filtri necessari per la rilevazione della fluorescenza di GFP. Eseguire misurazioni a 30 ° C, 120 giri/min e con un diametro d'agitazione di 1 mm sopra una finestra di tempo di 20 h (gli intervalli di 10 min di misurazione). Nota: Il set di filtri GFP è normalmente disponibile in tutti i sistemi di lettore. Temperatura, intervallo di tempo, misurare intervalli e RTA concentrazione può essere regolata per le proprie esigenze. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4.</li>
	<li>Facoltativo: Utilizzare ulteriori controlli interni nella misura per il controllo qualità. Preparare un controllo negativo aggiungendo 30 µ l leucina stabilizzato d/o raffinosio medium invece 30% galattosio (nessuna induzione di GFP). Inoltre, aggiungere 70 µ l di soluzione di 0,8 M sorbitolo stabilizzato G418 (300 µ g/mL). L'inibitore di traduzione proteica G418 serve come controllo positivo per l'inibizione della proteina impedisce espressione di GFP in lievito.</li>
	<li>Calcolare in per cento per il punto di tempo di 20 h secondo la seguente equazione relativa fluorescenza GFP (Vedi Figura 4A): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg"> dove NC è il controllo negativo
	<ol>
		<li>In alternativa, determinare la fluorescenza di GFP relativa per ciascun punto di misura (in questo caso 10 min, vedi anche punto 4.4) utilizzando l'equazione di cui sopra. Come mostrato in Figura 4B, è possibile creare un grafico di macchiare le intensità di fluorescenza di GFP (asse y) nel corso del tempo (asse x).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li>
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<li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+RNA+polymerase+II+is+affected+by+Kluyveromyces+lactis+zymocin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin.</a> J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).</li>
<li>Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kluyveromyces+lactis+zymocin+mode+of+action+is+linked+to+RNA+polymerase+II+function+via+Elongator%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator.</a> Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quando si esegue il protocollo di cui sopra, si consiglia i seguenti suggerimenti per ottenere un risultato di successo dell'esperimento.
Per l'espressione della proteina eterologa, è importante non superare la concentrazione di IPTG di 1 mM. Concentrazioni di IPTG &#62; 1 mM inibire indotta da promotore espressione di RTA e piombo per abbassare i rendimenti di tossina. Inoltre, le cellule non vanno coltivate a temperature superiori a 28 ° C per impedire la formazione del corpo di inclusione, ...

Pazienti affetti da infezioni da batteri che producono la tossina rappresentano un grave onere medico e finanziario per ogni sistema di assistenza sanitaria sociale, in particolare quanto efficaci trattamenti terapeutici sono ancora in gran parte mancante. Per sviluppare nuove strategie terapeutiche, i meccanismi complessi intossicazione della medicamente relativi A / tossine B come la tossina del colera, produttore della tossina Shiga o ricina ha bisogno di essere compresa a livello molecolare, basato sul romanzo saggi potente che devono essere implementati.
Negli ultimi anni, diversi studi ha tentato di analizzare A / trasporto di tossina B in lievito e cellule di mammifero usando metodi che richiede tempo e costosa come tossina radioattivo etichettatura1,2 , nonché a screening basato su siRNA si avvicina a3. In alcuni casi, traffico di tossina è stata visualizzata in vivo mediante microscopia a fluorescenza dopo accoppiamento chimico e/o genetico delle subunità di tossina individuali con fluorofori, punti quantici o proteine fluorescenti4,5. Purtroppo, tali modifiche spesso portano a inattivo e/o alterata proprietà naturali delle tossine. Un altro modo elegante per rispondere indirettamente a una vasta gamma di domande scientifiche è l'uso di sistemi reporter basato sugli enzimi come lacZ, luciferasi, o proteine fluorescenti (ad es. GFP o Discosoma sp. (proteina fluorescente rosso dsRed)).
In questo manoscritto, un semplice protocollo è descritto che identifica i componenti cellulari necessari per il trasporto intracellulare di RTA extracellularly applicata in S. cerevisiae. In tal modo, un plasmide di fluorescenza-reporter contenente un segnale N-terminale ER-importazione seguito da GFP agisce come un sensore di biosintesi della proteina, che misura indirettamente l'inibizione di traduzione di RTA-mediato della proteina GFP emissione di fluorescenza dopo in vivo traduzione6. Nel caso che endocitosi RTA e/o traffico intracellulare è influenzata negativamente (o positivamente) in un mutante di delezione di lievito particolare rispetto al wild type, questo può essere rilevato attraverso un aumento (o diminuzione) GFP fluorescenza emissione6.
Finora, tutti i metodi di analisi trasporto RTA in cellule di lievito sono stati limitati al processo retrò-traslocazione ER-a-citosol di RTA. In un sistema così artificiale, RTA contenente un segnale di importazione di ER è espresso da un promotore inducibile, risultante in un fenotipo suicida1,7. Anche se la cella associazione subunità B della ricina similarmente è manca nel setup sperimentale descritto in questo manoscritto e, quindi, non rappresenti perfettamente la situazione naturale di ricina holotoxin intossicazione8, tossina trasporti dal plasma membrana attraverso l'apparato del Golgi al pronto soccorso può essere imitata molto attentamente con questa analisi Novella. Interessante, i risultati preliminari ottenuti nello studio pilota indicano che le vie di traffico utilizzate da RTA rivelano sorprendenti analogie con l'itinerario di intossicazione di ricina holotoxin.
In sintesi, il metodo descritto può essere utilizzato per determinare il ruolo specifico di proteine cellulari selezionati nell'endocitosi RTA e traffico in lievito. Inoltre, questa messa a punto sperimentale potrebbe essere facilmente adattato a altri ribosoma inattivanti tossine prodotto e secreto da diverse specie batteriche come zymocin o tossina Shiga e lievito.

<table><tbody><tr><td>Ceppi batterici e di lievito</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 DE3(Gold)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742</td><td>Euroscarf</td><td>Y10000<</td><td></td></tr><tr><td>em>S. cerevisiae BY4742 mutanti da delezione</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1054</td><td>intera collezione</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmidi utilizzati in questo protocollo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a(+) (Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA(His6)</td><td>Becker et al. (2016)3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250</td><td>enzima litico per parete cellulare rimozione</td></tr><tr><td>LB brodo medio</td><td>Thermo Scientific</td><td>10855021</td><td>15 g agar è stato aggiunto per la produzione di piastre</td></tr><tr><td>YNB</td><td>Thermo Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Lievito drop-out mix supplemts senza leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-raffinosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-galattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>11811031</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>PAGINA righello prestained</td><td>Fermentas</td><td>26616</td><td>scala proteica utilizzata per l'analisi occidentale</td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</ strong</td></tr><tr><td>>Materiale per la purificazione RTA, la desalinizzazione e le misure con lettore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>vecchio modello, altri modelli disponibili</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>vecchio modello, non più disponibile</td></tr><tr><td>& Auml; KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific</td><td>28406266</td><td>Prodotto fuori produzione e sostituito</td></tr><tr><td>Colonna HisTRAP HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di desalinizzazione HiTRAP</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Filtro sterile Midisart</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>0.2 &; m pori misura</td></tr><tr><td>BCA kit di dosaggio delle proteine BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>660 nm kit di dosaggio</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anticorpi (opzionale)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>anticorpo primario; diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-topo-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9044-2ML</td><td>anticorpo secondario, diluizione 1:10.000</td></tr></tbody></table>

un'analisi del reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (rta) tratta di lievito

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

Batterica e centrale un / tossine B sfruttano le naturali vie di traffico nelle cellule eucariotiche per raggiungere i loro target intracellulare nel citosol e infine uccidere. Un / tossine B consistono generalmente di un enzimaticamente attivo Asubunit (ad es., tossina ricina un (RTA)) e uno o più celle, associazione Bsubunit(s), che sono responsabili di tossina vincolante a specifici recettori di superficie di cella. La nostra attuale conoscenza di come A / B tossine sono in grado di efficientemente inebrianti cellule ha aiutate gli scienziati per comprendere i meccanismi cellulari fondamentali, come endocitosi e proteina intracellulare in cellule eucariotiche superiori. Da un punto di vista medico, allo stesso modo è importante identificare le rotte del narcotraffico tossina principali per trovare soluzioni adeguate di trattamento per i pazienti o per eventualmente sviluppare applicazioni basate su tossina terapeutiche per la terapia del cancro.
Dall'analisi del genoma della A / tossina B traffico in cellule di mammifero è complesso, lungo e costoso, parecchi studi sulla A / trasporto di tossina B sono stati effettuati nell'organismo modello lievito Saccharomyces cerevisiae. Pur essendo meno complessi, fondamentali processi cellulari in lievito e cellule eucariotiche superiori sono simile e molto spesso i risultati ottenuti in lievito possono essere trasferiti alla situazione dei mammiferi.
Qui, descriviamo un'analisi del reporter di veloce e facile da usare per analizzare il traffico intracellulare di RTA in lievito. Un vantaggio essenziale del nuovo test è la possibilità di indagare non solo RTA retrò-traslocazione dal reticolo endoplasmatico (ER) nel citosol, ma piuttosto di endocitosi e retrograda tossina trasporto dalla membrana plasmatica in ER. Il test si avvale di un plasmide del reporter che permette la misura indiretta della tossicità di RTA attraverso l'emissione di fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP) dopo la traduzione in vivo . Poiché RTA previene efficacemente l'inizio della biosintesi della proteina da depurinazione rRNA 28S, questo test consente l'identificazione delle proteine della cellula ospite coinvolti nel trasporto intracellulare di RTA attraverso la rilevazione dei cambiamenti nell'emissione di fluorescenza.

Il flusso di lavoro generale del protocollo descritto in questo manoscritto è illustrata nella Figura 1, approssimativamente che riassume i singoli passaggi per successo RTA purificazione e il successivo esperimento di analisi del reporter GFP. Una descrizione più dettagliata di ogni singolo passaggio può essere trovata nel protocollo. La figura 2 illustra il risultato previsto di una purificazione di RTA successo da cromatografi...

Nel manoscritto, descriviamo l'uso di un'analisi del reporter di fluorescenza basati su lievito per identificare componenti cellulari coinvolti nel traffico e uccidere i processi dei citotossici una subunità della ricina di tossina della pianta (RTA).

Un'analisi del Reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (RTA) tratta di lievito

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

L'obiettivo generale di questo semplice test reporter basato sulla fluorescenza è quello di individuare i componenti cellulari necessari per il corretto traffico della tossina ricina A o della catena RTA nell'organismo modello di lievito. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti il trasporto intercellulare del ribosoma nell'attivazione di una tossina B. Nel nostro caso, la subunità citotossica della tossina semplice ricina dalla membrana plasmatica al citosoma.Il vantaggio principale di questo test è l'opportunità di analizzare l'effetto di un singolo gene di lievito sul trasporto dell'RTA in modo rapido ed economico. Iniziare questo protocollo con la trasformazione cellulare come descritto nel protocollo di testo. Inoculare cinque millilitri di terreno di kanamicina LB con cellule contenenti il plasmide di espressione RTA o il vettore vuoto.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 220 giri/min per 24 ore. Integrare un litro di terreno di kanamicina LB con cinque millilitri di precoltura. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 220 giri/min fino a quando le cellule non hanno raggiunto una densità ottica a 600 nanometri da 0,8 a 1,0.Successivamente, ridurre la temperatura di coltura a 28 gradi Celsius. Indurre l'espressione di RTA di E.Coli aggiungendo IPTG a una concentrazione finale di un millimolare. Dopo 3,5 ore a 28 gradi Celsius e 220 giri/min, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 10.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.Quindi lavare il pellet con cinque millilitri di tampone legante e il pellet a 10.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver ripetuto il lavaggio una volta, risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone legante. Sonica le cellule sul ghiaccio utilizzando cinque cicli di un impulso di 15 secondi e una pausa di 30 secondi.Dopo aver centrifugato il licato cellulare a 21.000 g e quattro gradi Celsius per 15 minuti, filtrare il surnatante utilizzando un sistema di filtraggio a siringa sterile. Utilizzare un sistema di purificazione automatizzato, dotato di una colonna di affinità a base di nichel da cinque millilitri, per purificare la frazione RTA marcata con HIS dal surnatante di E.Coli filtrato sterile. In generale, utilizzare una velocità di allusione di un millilitro al minuto e raffreddare l'intero sistema di purificazione per evitare un legame inefficiente della tossina e la perdita di attività della tossina.Equilibrare brevemente la colonna di affinità con 20 millilitri di tampone legante per rimuovere il tampone di conservazione. Quindi applicare il surnatante sterile e filtrato sulla colonna di affinità utilizzando una siringa. Lavare la colonna con 25-35 millilitri di tampone legante per rimuovere le proteine non legate dalla colonna.Eseguire la fase di lavaggio fino a quando gli assorbenti UV a 280 nanometri si avvicinano al valore UV iniziale. Quindi eluire la frazione RTA legata con 20-35 millilitri di tampone di eluizione e mantenere il campione in ghiaccio. È importante avviare il campionamento della frazione RTA poco dopo l'aumento del valore UV, 280 e interrompere il campionamento della frazione RTA quando raggiunge nuovamente la linea di base originale.Per desalinizzare la frazione RTA elusa, sostituire la colonna di affinità del sistema di purificazione con la colonna di desalinizzazione ed equilibrare la colonna con 20 millilitri di sorbitolo molare 0,8. Applicare la frazione RTA elusa sulla colonna tramite una siringa. Lavare la colonna con 100 millilitri di sorbitolo molare 0,8 e diluire la frazione RTA dissalata in un tubo da 15 millilitri non appena l'assorbimento UV inizia ad aumentare.Per evitare la contaminazione salina, fermarsi direttamente al campionamento della frazione quando la conduttanza aumenta. Conservare la frazione RTA elusa a quattro gradi Celsius. Dopo aver trasformato il lievito come descritto nel protocollo di testo, prelevare tre diversi cloni di lievito da ogni piastra.Inoculare i cloni in 100 millilitri di terreno raffinosio con dropout di lucina a 220 giri/min e 30 gradi Celsius a una densità ottica a 600 nanometri da 1,0 a 2,0. Centrifugare le celle a 25 gradi Celsius per cinque minuti a 10.000 g. Dopo aver lavato le cellule due volte con cinque millilitri di acqua sterile, risospendere le cellule in 50 millilitri di tampone sferoplasto.Incubare la coltura da 50 millilitri a 100 giri/min e 30 gradi Celsius per 90 minuti. Dopo la centrifugazione a 400 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti, lavare le cellule due volte con cinque millilitri di terreno di lucina stabilizzato drop out raffinosio. Quindi risospendere le cellule in cinque millilitri dello stesso mezzo per utilizzare le cellule direttamente per le misurazioni del test reporter GFP.Seminare gli sferoplasti delle cellule di lievito in piastre a 96 pozzetti. Ad ogni pozzetto, aggiungere 70 microlitri di terreno di lucina drop out raffinosio stabilizzato, contenente il controllo negativo, che esprime il vettore vuoto o RTA purificato in una concentrazione finale di RTA di cinque micromolari. Aggiungere 70 microlitri di terreno di uscita di lucina stabilizzato a ciascuno dei pozzetti rimanenti per portare il loro volume totale a 270 microlitri.Per un controllo positivo dell'inibizione delle proteine, aggiungere 70 microlitri di soluzione G418 stabilizzata con sorbitolo molare 0,8 molare, poiché G418 impedisce l'espressione di GFP nel lievito. Aggiungere immediatamente 30 microlitri di soluzione stabilizzata di galattosio per indurre l'espressione della GFP. Preparare un ulteriore controllo negativo aggiungendo 30 microlitri di terreno di lucina stabilizzato drop out raffinosio invece del 30% di galattosio.Dopo aver terminato la preparazione del campione, inserire la piastra a 96 pozzetti in un lettore di fluorescenza e prepararsi per la misurazione utilizzando il set di filtri da 475, 509 nanometri necessari per la rilevazione della fluorescenza GFP. Esegui misurazioni a 30 gradi Celsius, 120 giri/min e un diametro di agitazione di un millimetro in una finestra temporale di 20 ore con intervalli di misurazione di 10 minuti. Di seguito è mostrato un grafico di purificazione rappresentativo della cromatografia di affinità dell'RTA e del controllo del vettore vuoto.Il picco blu nella casella nera rappresenta la frazione RTA associata. Come mostrato nella scatola nera, nessuna proteina viene elusa dalla colonna nel controllo negativo. Di seguito è mostrato un diagramma di desalinizzazione di una frazione RTA purificata per affinità.Il diagramma mostra la separazione della frazione proteica RTA e della frazione salina. I risultati della colorazione Coomassie dopo il successo della purificazione e della desalinizzazione mostrano lisato cellulare o campioni purificati di diverse varianti di RTA. In questo studio è stato utilizzato RTA non modificato.Per convalidare il saggio reporter spaziato in fluorescenza, la fluorescenza relativa alla GFP degli sferoplasti di lievito wild type è stata misurata in condizioni indotte e non indotte dopo 20 ore di induzione della GFP. La fluorescenza relativa della GFP è stata analizzata anche in presenza di RTA, G418 o del controllo negativo. La fluorescenza relativa della GFP è stata misurata anche per mutanti selezionati in cui è noto che le proteine corrispondenti sono coinvolte e non coinvolte nel traffico di RTA nel lievito.La linea tratteggiata rappresentava una soglia di significatività. Una volta padroneggiata l'espressione e la purificazione dell'RTA, i risultati del saggio del rapporto di fluorescenza possono essere ricevuti in un solo giorno. Inoltre, questo metodo apre la strada ai ricercatori nel campo dell'inattivazione dei ribosomi delle tossine B per studiare le loro radici di intossicazione in un lievito modello di organismo eucariotico.

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Un'analisi del Reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (RTA) tratta di lievito

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