Un'analisi del Reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (RTA) tratta di lievito

L'obiettivo generale di questo semplice test reporter basato sulla fluorescenza è quello di individuare i componenti cellulari necessari per il corretto traffico della tossina ricina A o della catena RTA nell'organismo modello di lievito. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti il trasporto intercellulare del ribosoma nell'attivazione di una tossina B. Nel nostro caso, la subunità citotossica della tossina semplice ricina dalla membrana plasmatica al citosoma.

Il vantaggio principale di questo test è l'opportunità di analizzare l'effetto di un singolo gene di lievito sul trasporto dell'RTA in modo rapido ed economico. Iniziare questo protocollo con la trasformazione cellulare come descritto nel protocollo di testo. Inoculare cinque millilitri di terreno di kanamicina LB con cellule contenenti il plasmide di espressione RTA o il vettore vuoto.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 220 giri/min per 24 ore. Integrare un litro di terreno di kanamicina LB con cinque millilitri di precoltura. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 220 giri/min fino a quando le cellule non hanno raggiunto una densità ottica a 600 nanometri da 0,8 a 1,0.

Successivamente, ridurre la temperatura di coltura a 28 gradi Celsius. Indurre l'espressione di RTA di E.Coli aggiungendo IPTG a una concentrazione finale di un millimolare. Dopo 3,5 ore a 28 gradi Celsius e 220 giri/min, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 10.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi lavare il pellet con cinque millilitri di tampone legante e il pellet a 10.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver ripetuto il lavaggio una volta, risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone legante. Sonica le cellule sul ghiaccio utilizzando cinque cicli di un impulso di 15 secondi e una pausa di 30 secondi.

Dopo aver centrifugato il licato cellulare a 21.000 g e quattro gradi Celsius per 15 minuti, filtrare il surnatante utilizzando un sistema di filtraggio a siringa sterile. Utilizzare un sistema di purificazione automatizzato, dotato di una colonna di affinità a base di nichel da cinque millilitri, per purificare la frazione RTA marcata con HIS dal surnatante di E.Coli filtrato sterile. In generale, utilizzare una velocità di allusione di un millilitro al minuto e raffreddare l'intero sistema di purificazione per evitare un legame inefficiente della tossina e la perdita di attività della tossina.

Equilibrare brevemente la colonna di affinità con 20 millilitri di tampone legante per rimuovere il tampone di conservazione. Quindi applicare il surnatante sterile e filtrato sulla colonna di affinità utilizzando una siringa. Lavare la colonna con 25-35 millilitri di tampone legante per rimuovere le proteine non legate dalla colonna.

Eseguire la fase di lavaggio fino a quando gli assorbenti UV a 280 nanometri si avvicinano al valore UV iniziale. Quindi eluire la frazione RTA legata con 20-35 millilitri di tampone di eluizione e mantenere il campione in ghiaccio. È importante avviare il campionamento della frazione RTA poco dopo l'aumento del valore UV, 280 e interrompere il campionamento della frazione RTA quando raggiunge nuovamente la linea di base originale.

Per desalinizzare la frazione RTA elusa, sostituire la colonna di affinità del sistema di purificazione con la colonna di desalinizzazione ed equilibrare la colonna con 20 millilitri di sorbitolo molare 0,8. Applicare la frazione RTA elusa sulla colonna tramite una siringa. Lavare la colonna con 100 millilitri di sorbitolo molare 0,8 e diluire la frazione RTA dissalata in un tubo da 15 millilitri non appena l'assorbimento UV inizia ad aumentare.

Per evitare la contaminazione salina, fermarsi direttamente al campionamento della frazione quando la conduttanza aumenta. Conservare la frazione RTA elusa a quattro gradi Celsius. Dopo aver trasformato il lievito come descritto nel protocollo di testo, prelevare tre diversi cloni di lievito da ogni piastra.

Inoculare i cloni in 100 millilitri di terreno raffinosio con dropout di lucina a 220 giri/min e 30 gradi Celsius a una densità ottica a 600 nanometri da 1,0 a 2,0. Centrifugare le celle a 25 gradi Celsius per cinque minuti a 10.000 g. Dopo aver lavato le cellule due volte con cinque millilitri di acqua sterile, risospendere le cellule in 50 millilitri di tampone sferoplasto.

Incubare la coltura da 50 millilitri a 100 giri/min e 30 gradi Celsius per 90 minuti. Dopo la centrifugazione a 400 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti, lavare le cellule due volte con cinque millilitri di terreno di lucina stabilizzato drop out raffinosio. Quindi risospendere le cellule in cinque millilitri dello stesso mezzo per utilizzare le cellule direttamente per le misurazioni del test reporter GFP.

Seminare gli sferoplasti delle cellule di lievito in piastre a 96 pozzetti. Ad ogni pozzetto, aggiungere 70 microlitri di terreno di lucina drop out raffinosio stabilizzato, contenente il controllo negativo, che esprime il vettore vuoto o RTA purificato in una concentrazione finale di RTA di cinque micromolari. Aggiungere 70 microlitri di terreno di uscita di lucina stabilizzato a ciascuno dei pozzetti rimanenti per portare il loro volume totale a 270 microlitri.

Per un controllo positivo dell'inibizione delle proteine, aggiungere 70 microlitri di soluzione G418 stabilizzata con sorbitolo molare 0,8 molare, poiché G418 impedisce l'espressione di GFP nel lievito. Aggiungere immediatamente 30 microlitri di soluzione stabilizzata di galattosio per indurre l'espressione della GFP. Preparare un ulteriore controllo negativo aggiungendo 30 microlitri di terreno di lucina stabilizzato drop out raffinosio invece del 30% di galattosio.

Dopo aver terminato la preparazione del campione, inserire la piastra a 96 pozzetti in un lettore di fluorescenza e prepararsi per la misurazione utilizzando il set di filtri da 475, 509 nanometri necessari per la rilevazione della fluorescenza GFP. Esegui misurazioni a 30 gradi Celsius, 120 giri/min e un diametro di agitazione di un millimetro in una finestra temporale di 20 ore con intervalli di misurazione di 10 minuti. Di seguito è mostrato un grafico di purificazione rappresentativo della cromatografia di affinità dell'RTA e del controllo del vettore vuoto.

Il picco blu nella casella nera rappresenta la frazione RTA associata. Come mostrato nella scatola nera, nessuna proteina viene elusa dalla colonna nel controllo negativo. Di seguito è mostrato un diagramma di desalinizzazione di una frazione RTA purificata per affinità.

Il diagramma mostra la separazione della frazione proteica RTA e della frazione salina. I risultati della colorazione Coomassie dopo il successo della purificazione e della desalinizzazione mostrano lisato cellulare o campioni purificati di diverse varianti di RTA. In questo studio è stato utilizzato RTA non modificato.

Per convalidare il saggio reporter spaziato in fluorescenza, la fluorescenza relativa alla GFP degli sferoplasti di lievito wild type è stata misurata in condizioni indotte e non indotte dopo 20 ore di induzione della GFP. La fluorescenza relativa della GFP è stata analizzata anche in presenza di RTA, G418 o del controllo negativo. La fluorescenza relativa della GFP è stata misurata anche per mutanti selezionati in cui è noto che le proteine corrispondenti sono coinvolte e non coinvolte nel traffico di RTA nel lievito.

La linea tratteggiata rappresentava una soglia di significatività. Una volta padroneggiata l'espressione e la purificazione dell'RTA, i risultati del saggio del rapporto di fluorescenza possono essere ricevuti in un solo giorno. Inoltre, questo metodo apre la strada ai ricercatori nel campo dell'inattivazione dei ribosomi delle tossine B per studiare le loro radici di intossicazione in un lievito modello di organismo eucariotico.