Analizzando la comunicazione tra i monociti e le cellule di cancro al seno primario in una tabella extracellulare estrarre (ECME)-sistema tridimensionale basato su

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di studiare la comunicazione diretta e indiretta tra cellule primarie di carcinoma mammario e monociti in un sistema di co-coltura tridimensionale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del microambiente infiammatorio del cancro al seno, come ad esempio come le cellule immunitarie vengono riclassificate e attivate, come queste cellule aiutano a sostenere il microambiente infiammatorio tumorale e come questi microambienti facilitano l'invasione delle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un'alternativa economica per studiare la comunicazione intra-tumorale e illustra il potenziale dei sistemi cellulari 3D in vitro per interrogare caratteristiche specifiche della biologia dei tumori.

In particolare quelli legati all'aggressione tumorale. Per iniziare, coltivare due volte 10 al sesto monociti U937 e THP1 in 10 millilitri di RPMI1640 terreno, integrato con il 10% di FBS e l'1% di antibiotico antimicotico. Coltiva anche PM freschi in DMEMF12 mezzo integrato.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato al cinque percento di anidride carbonica. Piastra quattro volte 10 al quinto monociti in un millilitro per pozzetto del loro terreno corrispondente. Posizionare un inserto in ciascun pozzetto e aggiungere 900 microlitri della sospensione di quattro volte 10 alla quinta cellula BrC nel terreno corrispondente.

Incubare le colture a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato al cinque percento di anidride carbonica per cinque giorni e recuperare i surnatanti. Recuperare le cellule mediante tripsinizzazione se viene eseguita un'analisi successiva. Includere i controlli delle singole colture cellulari con i rispettivi terreni.

Per marcare le cellule BrC e i monociti con cumerina e rodamina disponibili in commercio prima della coltura cellulare, preparare un monostrato di due volte 10 fino alla sesta cellula BrC di interesse e sostituire il terreno standard con una soluzione di lavoro sufficiente e preriscaldata del colorante fluorescente. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato al cinque percento di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi aspirare la soluzione colorante e utilizzare una quantità sufficiente di XPBS per sciacquare delicatamente le cellule.

Aspirare il PBS e aggiungere il terreno standard. Per tripsinizzare le cellule, aggiungere due millilitri di tripsina allo 05% e EDTA 0,48 millimolari al pallone e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque-10 minuti. Aggiungere 200 microlitri di FBS per fermare la tripsinizzazione e sette millilitri del terreno corrispondente senza integratori.

Risospendere le cellule mediante pipettaggio, quindi trasferire 10 microlitri di cellule in una camera Nuebauer e contarle. Quindi, pellettare le celle a 430 volte g e temperatura ambiente per cinque minuti, quindi scartare il surnatante e utilizzare tre millilitri di soluzione di lavoro di colorante fluorescente preriscaldato per risospendere le cellule. Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato al cinque percento di anidride carbonica per 30 minuti.

Dopo aver pellettato nuovamente le cellule, scartare la soluzione di lavoro del colorante e utilizzare da cinque a sette millilitri di un XPBS per risospendere delicatamente le cellule. Quindi, dopo aver pellettato nuovamente le celle e scartato il PBS, risospendere le cellule in cinque-sette millilitri di terreno standard. Contare 10 microlitri di sospensione cellulare.

Impostare una co-coltura diffondendo una quantità sufficiente di ECME sul fondo del pozzetto per formare uno strato uniforme in ciascun pozzetto di un sistema di scorrimento a camera a quattro pozzetti. Piastra 20 microlitri di una sospensione a singola cellula contenente cinque volte 10 alla quinta cellule BrC marcate per pozzetto. Dopo 15-20 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere una sospensione di 2,5 volte 10 ai monociti marcati al quinto in 80 microlitri di terreno di prova integrato con il 60% di ECME.

Lasciare solidificare l'ECME a 37 gradi Celsius per 15-20 minuti. Ora aggiungere un millilitro di una miscela uno a uno di cellule BrC e terreno di coltura di monociti. Incubare le co-colture a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato al cinque percento di anidride carbonica per 24 ore, 48 ore o cinque giorni per tenere traccia dei cambiamenti in diversi punti temporali.

Per degradare le proteine della ECM e recuperare le cellule dalle colture, aspirare e scartare il terreno, quindi aggiungere 0,5 millilitri di XPBS con lo 0,1% di tripsina e lo 0,25% di EDTA alla coltura. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5 millilitri di XPBS con il 10% di FBS per neutralizzare la tripsina e risospendere le cellule mediante pipettaggio energico per ottenere una sospensione di una singola cellula.

Dopo aver pellettato le cellule, scartare il surnatante e risospendere le cellule in cinque millilitri di XPBS con il 10% di FBS. Ripetere questo passaggio una volta. Sottoporre la sospensione cellulare a fax con lo strumento appropriato.

Assicurarsi che le popolazioni finali siano pure almeno al 95%. In ogni pozzetto di un sistema di vetrini a otto pozzetti, stendere una base da 40 microlitri di ECME e lasciarla solidificare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Seminare 800 cellule MCF10 A per pozzetto in 400 microlitri di terreno di coltura DMEM F12 integrato secondo il protocollo di testo.

Quindi aggiungere 400 microlitri di terreno condizionato o di terreno di coltura DMEM F12 integrato con 20 nanogrammi per millilitro di IL1 beta ricombinante umana. Posizionare il vetrino della camera in una capsula di Petri di vetro contenente una capsula di Petri da 35 millilitri riempita con due millilitri di PBS. Le cellule MCF 10A devono essere seminate in ciascun pozzetto molto lentamente per evitare danni alla base dell'ECME e per evitare che le cellule si depositino e formino una monolide.

Utilizzando un microscopio ottico, registrare la formazione di acini ghiandolari ogni 24 ore per 14 giorni. Dopo 14 giorni di coltura, aggiungere 100 microlitri di dapy 100 nanomolari in un XPBS e incubare i campioni a temperatura ambiente agitando costantemente per 25 minuti. Sciacquare i campioni con un XPBS a temperatura ambiente, tre volte per cinque minuti ciascuna mescolando costantemente.

Utilizzare un mezzo di montaggio specifico per la colorazione fluorescente per montare i preparati. Quindi sigillare i campioni montati con lucidante trasparente e mantenere i vetrini, protetti dalla luce a quattro gradi Celsius. A dimostrare la procedura al microscopio confocale sarà Vadim Perez, ricercatore del National Laboratory of Advanced Microscoping.

Analizzare gli acini con un microscopio confocale scattando immagini di pile trasversali a diverse profondità degli acini. Visualizzare diverse proteine cellulari negli acini con protocolli di colorazione adeguati. Ad esempio, il caheren è stato colorato qui per valutare l'adesione da cellula a cellula, la polarità cellulare e la formazione dell'oralimen.

La morfologia delle cellule primarie di BrC che crescono in colture 3D a basse e alte densità è stata studiata per cinque giorni. Durante le prime 48 ore, le cellule aderiscono all'ECME con una forma a fuso allungata e formano strutture a maglia a cinque giorni. Dopo cinque giorni di co-colture 3D, sia le cellule commerciali di BrC MCF7 che quelle MDA-MB-231 hanno formato aggregati disorganizzati.

Tuttavia, le celle MDA-MB-231 aggressive per aggregati con forme allungate, mentre le celle MCF7 non aggressive per aggregati con forme arrotondate che sono più densamente compattate rispetto alle celle MDA-MB-231. Sono stati raccolti i surnatanti provenienti da colture primarie di BrC 3D a interazione indiretta e le loro co-colture di cinque giorni con monociti primari. Livelli significativamente aumentati di IL1 beta e IL8 sono stati osservati nelle co-colture primarie di monociti di cellule BrC.

Citochine sia cruciali che infiammatorie che sono state precedentemente associate alla progressione maligna. Le cellule MCF10A sono state coltivate con due diversi surnatanti da due linee cellulari primarie di BrC per osservare la formazione del lume come misura della resistenza agli anoykis. A differenza delle cellule MCF10A cresciute in condizioni standard, la microscopia bi-confocale al giorno 14, i tagli trasversali degli sferoidi mostrano che le cellule MCF10A hanno evitato l'anoikis, come misurato contando il numero di cellule centrali negli acini.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi medica per rispondere a ulteriori domande. Testare le vie di segnalazione in entrambe le migrazioni del cancro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei microambienti tumorali per esplorare le comunicazioni delle cellule del cancro al seno con cellule di massa, fibroblasti, neutrofili o persino diversi cloni di cellule tumorali in sistemi di co-coltura 3D.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire un sistema di coltura 3D per modellare il microambiente tumorale.