Aderenza dei batteri per piantare superfici misurate in laboratorio

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare e misurare il legame dei batteri alle superfici delle piante. Questo metodo può rispondere a domande importanti sia nella patologia vegetale che nella sicurezza alimentare. In particolare, può rispondere a domande su come i batteri si legano alle superfici delle piante e su come possono essere rimossi.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile, veloce ed economica. Per preparare le piantine coltivate in acqua, metti un piccolo numero di semi in un bicchiere di vetro da 30, 50, 100 o 150 millilitri. Qui vengono utilizzati i semi di pomodoro.

Coprite i semi con etanolo all'80% e agitate brevemente. Quindi lasciare in ammollo i semi per un minuto. Versare l'etanolo e immergere i semi in una soluzione di candeggina commerciale al 50% e Triton X-100 allo 0,1% e acqua di rubinetto.

Lasciare i semi in ammollo per 20 minuti o più se i semi sono grandi, come i semi di fagioli. Versare la miscela di candeggina e lavare i semi tre volte con acqua sterile, lasciando i semi in ammollo nell'acqua per un minuto per ogni lavaggio. Versare i semi e una piccola quantità di acqua in una capsula di Petri sterile e incubare i semi al buio fino a quando le piantine raggiungono la dimensione desiderata, tra un centimetro e 10 centimetri.

Per preparare semi o piantine coltivate nella sabbia, dopo aver sterilizzato i semi e i materiali di piantagione, inoculare i semi o le piantine con batteri secondo il protocollo del testo. Usando una bacchetta di vetro sterile, fai un buco poco profondo nella sabbia abbastanza profondo da posizionare il seme sotto la superficie. Metti il seme nella buca e coprilo con un sottile strato di sabbia.

Quindi utilizzare una pellicola sigillante per sigillare la parte superiore del contenitore per evitare la perdita di acqua e l'ingresso di ulteriori microbi. Coltiva le piante in laboratorio sotto una luce o in serra a una temperatura e una durata del giorno adeguate alla specie e alla varietà di pianta. Pianta le piantine nella sabbia.

Usa una bacchetta di vetro sterile per fare un foro. Quindi, con un uncinetto sterile in acciaio inossidabile, guida con cura la radice nel foro e usa la sabbia per riempire i lati del buco. Dopo aver incubato le piante con i batteri secondo il protocollo di testo, preparare un campione per la microscopia ponendolo in una goccia d'acqua o in un mezzo di incubazione su un vetrino da microscopio e osservarlo direttamente.

Se non ci sono batteri liberi visibili, potrebbe esserci stata una morte batterica o un legame batterico al contenitore in cui è stata effettuata l'incubazione. Lavare il campione in acqua o terreno di incubazione mettendolo in una fiala di liquido e capovolgendo delicatamente la fiala. Quindi posizionare il campione sul vetrino del microscopio in un liquido fresco per l'osservazione.

Per montare il campione utilizzare un normale vetrino coprioggetti. Se il campione è denso e si gonfia, aggiungere il liquido e il campione nel pozzetto di una pressa, applicare un vetrino coprioggetti che ha un anello di gomma o plastica attorno al bordo. Posizionare il vetrino sopra e premere delicatamente verso il basso per sigillare il vetrino coprioggetti al vetrino.

Capovolgere il vetrino per esaminare il campione. In alternativa, utilizzare un vetrino contaalghe e un vetrino coprioggetti in modo simile e visualizzare con un ingrandimento non superiore a 20 volte. Per determinare il numero di batteri vitali presenti nelle piante coltivate nella sabbia, inizia rimuovendo il materiale sigillante dalla parte superiore e inferiore del contenitore.

Posiziona il contenitore su un pezzo di carta sterile e sbatti delicatamente il contenitore contro la superficie per sciogliere la sabbia prima di sollevare delicatamente la sabbia con la pianta dal contenitore. Quando il cilindro di sabbia e la pianta sono liberi sulla carta, dividi la sabbia a metà per rivelare la radice della pianta. Se lo si desidera, prelevare campioni di sabbia vicino al bordo del contenitore e vicino alla radice.

Questo può essere utile per determinare la diffusione, l'accumulo e la crescita dei batteri. Raccogli la radice e rimuovi la sabbia e i batteri che aderiscono liberamente immergendo la radice in un volume misurato di acqua o tampone e agitando delicatamente. Determinare la conta cellulare vitale dei batteri nella sospensione risultante piastrandola su terreni adatti come la luria agar.

Questo rappresenta il numero di batteri vagamente associati alla radice. Infine, rimuovere i batteri strettamente legati mediante sonicazione e determinarne il numero. Questo grafico mostra l'effetto di due diverse mutazioni della cellulosa meno sulla capacità dei batteri di colonizzare le radici del pomodoro.

Sebbene le deviazioni standard di alcune misurazioni fossero fino a 0,9 log base di 10, la riduzione del legame della cellulosa meno i mutanti è chiaramente evidente. In questo esperimento è stato misurato il legame con i germogli di erba medica di E.Coli selvatico 0157:H7 in mutanti incapaci di produrre vari esopolisaccaridi. In entrambi i ceppi, la produzione di acido poli-beta e sei glucuronico, o PGA, sembra dare il maggior contributo al legame di E.coli patogeno alle superfici delle piante.

Anche l'acido colanico ha svolto un ruolo significativo nel legame. Qui, due ceppi di batteri che non sono in grado di legarsi alle superfici delle piante sono stati ingegnerizzati per produrre PGA per determinare se è sufficiente a causare il legame batterico alle radici del pomodoro. Nel caso di A. tumefaciens A1045, il PGA ha causato il legame individuale dei batteri alla superficie della radice.

D'altra parte, S. meliloti si legava in grandi grappoli, in cui solo pochi batteri erano direttamente attaccati alla radice, e la maggior parte dei batteri erano attaccati ad altri batteri. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora per la configurazione iniziale, più il tempo di incubazione, e tra 10 minuti e un'ora di punteggio, a seconda del campione. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che i batteri possono attaccarsi a quasi tutte le superfici.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come osservare il legame dei batteri alle superfici delle piante. Determina dove si legano i batteri sulla pianta e determina il numero di batteri legati. Non dimenticare che se si eseguono queste procedure con agenti patogeni umani, la procedura può essere estremamente pericolosa e devono essere sempre prese precauzioni come lavorare in una cappa di contenimento e indossare guanti.